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病毒学报 2020年第3期36卷 385-393页

作者：郑惠文候东佩李嘉祺黄星杨谨溪刘龙丁中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118 中国医学科学院病毒疫苗研发系统创新研究重点实验室昆明650118

建立基于重组荧光病毒CV-A16-EGFP的流式快速测定CV-A16感染或免疫动物血清中和抗体效价的方法。在Vero细胞上对不同感染时间点,不同病毒接种量情况下的CV-A16-EGFP病毒的增殖特性进行分析;随后,利用流式检测不同病毒滴度下的EGFP阳性... 详细信息

建立基于重组荧光病毒CV-A16-EGFP的流式快速测定CV-A16感染或免疫动物血清中和抗体效价的方法。在Vero细胞上对不同感染时间点,不同病毒接种量情况下的CV-A16-EGFP病毒的增殖特性进行分析;随后,利用流式检测不同病毒滴度下的EGFP阳性细胞数量、EGFP阳性细胞百分比(%)、及EGFP阳性细胞的平均荧光密度值,并换算出不同病毒滴度与三者之间分别的数值对应关系。最后,以平均荧光密度值作为替代判断病毒病变效应的指标,并利用流式荧光检测及传统微量中和方法对CV-A16感染恒河猴血清及CV-A16免疫的羊血清中和抗体效价进行检测,并对两种方法的检测结果进行比较。在感染后24h,不同的病毒滴度与对应的平均荧光密度值呈良好的线性关系。利用流式荧光检测的CV-A16中和抗体效价与传统的微量中和实验相比,两者检测结果具有较好的线性相关性,线性回归系数为R^2=0.8026;传统的微量中和实验检测的平均中和抗体效价略高于流式荧光检测的中和抗体效价,但是差异无统计学意义(P>0.05)。利用流式荧光检测可以迅速检测CV-A16中和抗体效价,并且实验结果与传统的微量中和实验具有较好的一致性。相比与传统方法,该方法更简单、快速、灵敏,为CV-A16抗血清的中和抗体检测提供参考。

关键词：柯萨奇病毒A组16型流式荧光检测病毒滴定微量中和实验中和抗体检测

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单纯疱疹病毒1型与阿尔茨海默病的研究进展

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中华微生物学和免疫学杂志 2021年第2期41卷 149-153页

作者：高杨李雪琦李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)感染常引起口唇疱疹,但近年来其引发的生殖器疱疹越来越多,且与阿尔茨海默病等神经系统疾病的发生密切相关。阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种慢性进行性的中枢神经系统变... 详细信息

单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)感染常引起口唇疱疹,但近年来其引发的生殖器疱疹越来越多,且与阿尔茨海默病等神经系统疾病的发生密切相关。阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种慢性进行性的中枢神经系统变性病,其发病机制尚未完全阐明,目前也缺乏能够明确改善该疾病的药物。关于AD的HSV-1致病假说由来已久,但一直没有确切的证据证明两者之间的联系,本文将对HSV-1导致AD发病机制的研究进展进行简单综述。

关键词：单纯疱疹病毒1型阿尔茨海默病 β淀粉样蛋白 tau蛋白

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不稳定血红蛋白HbRush的血液学表型和基因型分析

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中华医学遗传学杂志 2017年第1期34卷 15-20页

作者：葛世军杨必清易薇黄铠刘红仙黄小琴褚嘉秸杨昭庆中国医学科学院&北京协和医学院医学生物学研究所医学遗传学研究室昆明650118 德宏州人民医院检验科云南芒市678400

目的分析不稳定异常血红蛋白HbRush及其合并地中海贫血病例的血液学表型和基因型特征。方法对3例不明病因的贫血病例进行血液学常规检测和血红蛋白电泳，并检测α和β珠蛋白基因、^Gγ启动子区-158XmnI多态性位点和7个β珠蛋白基因簇中... 详细信息

目的分析不稳定异常血红蛋白HbRush及其合并地中海贫血病例的血液学表型和基因型特征。方法对3例不明病因的贫血病例进行血液学常规检测和血红蛋白电泳，并检测α和β珠蛋白基因、^Gγ启动子区-158XmnI多态性位点和7个β珠蛋白基因簇中限制性酶切多态位点的单倍型。结果3例病例均具有小细胞低色素贫血表型，血红蛋白电泳HbF区域有定量值显著增高的异常条带（30．5％～59．2％），携带有不稳定血红蛋白Hb Rush突变（HBBCD101GAG〉CAG，Glu〉Gln），其中2例还携带有-α^3.7，CD17和HbE地中海贫血突变；HbRush突变有不同的β珠蛋白基因簇单倍型；未发现F区异常血红蛋白电泳条带与^Gγ启动子区多态和大片段β基因簇缺失的关联。结论本研究结果证实了中国不同人群中存在HbRush突变，是世界范围内第3个病例报告。HbRush异常血红蛋白可导致HbF区域电泳条带的定量值显著增高。单纯HbRush突变杂合子可产生小细胞低色素贫血及地中海贫血样临床症状，需进行产前诊断；对血红蛋白电泳HbF区域条带定量值明显增高的贫血病例及地中海贫血进行诊治时需考虑对HbRush的基因诊断和鉴别诊断。

关键词：异常血红蛋白 Hb Rush 地中海贫血基因型和表型 Hb F

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狂犬病病毒糖蛋白表达及纯化及其记忆性B细胞结合能力的分析

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生物工程学报 2017年第11期33卷 1840-1849页

作者：严丽蔚巩蔚朱文兵张雪梅徐婧雯吴忠香卢孔杰孙明董少忠中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

表达纯化不同标签、不同大小3个狂犬病病毒糖蛋白,分析其结合功能后,得到具备高亲和力的、可特异性结合记忆性B细胞的狂犬病病毒糖蛋白。本实验通过基因工程的方法,采用不同的原核表达系统分别表达带有不同标签的、全长和膜外区的RVG,... 详细信息

表达纯化不同标签、不同大小3个狂犬病病毒糖蛋白,分析其结合功能后,得到具备高亲和力的、可特异性结合记忆性B细胞的狂犬病病毒糖蛋白。本实验通过基因工程的方法,采用不同的原核表达系统分别表达带有不同标签的、全长和膜外区的RVG,纯化蛋白并分析比较其结合功能,荧光标记候选蛋白,结合CD19及CD27的抗体,流式细胞术检测狂犬疫苗免疫后PBMCs中抗狂犬病病毒特异性记忆性B细胞的情况,确认候选蛋白与抗狂犬病毒特异性记忆性B细胞的结合功能。本实验成功构建了3个表达载体pGEX-5X-1-RVG、pET28a-RVG和pET30a-G,优化表达纯化条件成功获得了糖蛋白GST-RVG、His-RVG和His-G。纯化后的GST-RVG、His-RVG和His-G经Western blotting和ELISA鉴定均有抗原特异性;由竞争ELISA法测得3个纯化后糖蛋白与抗狂犬病病毒抗体的亲和力。通过流式细胞术可以检测到狂犬疫苗免疫后阳性志愿者PBMCs中的抗狂犬病病毒特异性记忆性B细胞,从而获得了高亲和力、可用于分选抗原特异性的记忆性B细胞的狂犬病病毒糖蛋白。

关键词：狂犬病病毒糖蛋白抗原特异性记忆性B细胞流式细胞术

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稳定表达α-Synuclein 4种选择性剪接异构体的PC12细胞对神经毒性剂MPP^+的敏感性研究

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中国药理学通报 2013年第6期29卷 814-817页

作者：马开利宋连昆苑玉和张莹陈乃宏中国医学科学院北京协和医学院药物研究所教育部生物活性物质与资源利用重点实验室药理学研究室北京100050 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南昆明650118

目的研究稳定表达α-synuclein 4种选择性剪接体的PC12细胞对神经毒性剂MPP+的敏感性。方法 PCR获得α-synuclein的4个选择性剪切体,克隆入pcDNA3.1载体,转染PC12细胞,经G418筛选获得稳定表达这4个剪切体的PC12细胞株,采用细胞毒的方法... 详细信息

目的研究稳定表达α-synuclein 4种选择性剪接体的PC12细胞对神经毒性剂MPP+的敏感性。方法 PCR获得α-synuclein的4个选择性剪切体,克隆入pcDNA3.1载体,转染PC12细胞,经G418筛选获得稳定表达这4个剪切体的PC12细胞株,采用细胞毒的方法检测这4个稳定细胞株对神经毒性剂MPP+的敏感性。结果同全长相比,去除外显子5的选择性剪切体α-synuclein114和α-synuclein98对神经毒性剂MPP+的敏感性升高,表现为细胞活力的降低。结论去除外显子5的选择性剪切体α-synuclein114和α-synu-clein98对神经毒性剂MPP+的敏感性明显升高。抑制外显子5的选择性剪切,从而抑制选择性剪切异构体α-synucle-in114和α-synuclein98的产生可能是阻止神经元退行性丢失的一种策略。

关键词： α-synuclein 异构体 MPP+ PC12细胞敏感性帕金森病

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新型冠状病毒膜蛋白不具有以Fc受体途径诱导抗体依赖性增强效应的能力

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中华微生物学和免疫学杂志 2022年第3期42卷 161-170页

作者：常朋兰李琦涵李丹丹段素琴李雪琦张晶晶曾敬富张莹中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研究室昆明650118 昆明金域医学检验所有限公司昆明650500

目的:探寻SARS-CoV-2膜蛋白(membrane protein,M protein)引起的免疫特征,尤其是其引发抗体依赖性增强效应(antibody-dependent enhancement,ADE)的可能性。方法:利用原核表达系统制备纯化的SARS-CoV-2全长M蛋白,并经皮下途径3次(第1、14和21天)免疫BALB/c小鼠,获得血清。Western blot鉴定血清特异性,ELISA法和中和试验对血清抗体的效价进行验证。体外培养检测在抗M蛋白血清存在的情况下SARS-CoV-2在树突状细胞、自然杀伤细胞、T和B细胞中的增殖情况。结果:SARS-CoV-2全长M蛋白免疫BALB/c小鼠后获得的免疫血清能够特异地识别病毒M蛋白,且免疫血清中抗全病毒抗体效价约为1∶400,但该抗体没有中和活病毒的能力。此外,这种抗体不能够辅助病毒感染各种类型具有Fc受体(Fc receptor,FcR)的免疫细胞并在其中增殖。结论:由M蛋白诱导的非中和抗体不能以FcR途径诱导ADE效应。

关键词： SARS-CoV-2 抗体依赖性增强效应膜蛋白非中和抗体

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云南省2009年埃可病毒6型分离株KM57—09全基因序列分析

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中华流行病学杂志 2012年第9期33卷 951-955页

作者：朱艳菊潘玥陈俊英马忠飞邓新强刘建生马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的对云南埃可病毒6型（Ech06）分离株KM57—09全基因序列进行分析和研究，了解其遗传特性。方法设计针对Ech06引物，提取病毒RNA、RT-PCR扩增和产物直接测序获得序列。利用Mega5．05、RDP3和SimPlot3．5．1等生物学软件分析全基因序... 详细信息

目的对云南埃可病毒6型（Ech06）分离株KM57—09全基因序列进行分析和研究，了解其遗传特性。方法设计针对Ech06引物，提取病毒RNA、RT-PCR扩增和产物直接测序获得序列。利用Mega5．05、RDP3和SimPlot3．5．1等生物学软件分析全基因序列。结果获得KM57—09全基因组核苷酸序列长度为7419bp，编码含2191个氨基酸残基的多聚蛋白；与其他Ech06参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为79．3％～80．2％和93．3％～94．4％，与原型株D’Amor核苷酸和氨基酸同源性分别为79．3％和93．6％。在基因组各个区段上，Ech06KM57—09分离株的2C和3A区，与HN-2-E25核苷酸同源性最高，分别为86-3％和85．0％，而其5’UTR、VP4、3D和3’UTR区则与CoxB5-Henan-2010核苷酸同源性最高，分别为91．7％、81．2％、89．7％和96．9％。在VP1区上，与中国其他省份分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为80．0％～96．0％和95．8％～99．0％，而与其他国家分离株的核苷酸和氨基酸同源性分别为77．6％～96．0％和95．2％-99．0％。进化分析发现Ech06可分为5个分支，中国分离株分属C和E分支，其中KM57—09属于E分支，且5个分支之间核苷酸的差异为15．6％～23．3％。3D基因序列种系进化分析以及RDP3和SimPlot3．5．1软件分析发现KM57—09序列在非结构区可能存在重组。结论Ech06可分为5个基因型，KM57—09分离株属于E基因型；中国大陆曾存在不同Ech06株传播链的流行。

关键词：埃可病毒6型全基因组序列分析

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人埃可病毒20型KM／EV20／2010分离株的全基因组序列分析

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中华流行病学杂志 2015年第5期36卷 501-505页

作者：潘玥邵聪文王晓辉朱艳菊陈俊英陈伟马绍辉刘建生中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的对人埃可病毒20型（EcH020）KM／EV20／2010分离株全基因组进行序列测定，并分析其分子变异和进化特点。方法设计针对KM／EV20／2010引物，提取病毒RNA，RT-PCR扩增和序列测定获得全基因序列。利用Mega4．1、RDP3和SimPlot3．5．1... 详细信息

目的对人埃可病毒20型（EcH020）KM／EV20／2010分离株全基因组进行序列测定，并分析其分子变异和进化特点。方法设计针对KM／EV20／2010引物，提取病毒RNA，RT-PCR扩增和序列测定获得全基因序列。利用Mega4．1、RDP3和SimPlot3．5．1软件分析全基因序列。结果KM／EV20／2010病毒株基因组全长7395bp个核苷酸（nt），5’端和3’端分别为744nt和96nt的非编码区，5’和3’非编码区间为一个6549rlt长的开放阅读框，编码一个含2183个氨基酸的多聚蛋白，编码区内未见核苷酸的插入或缺失。与GenBank中现有唯-1株ECH020JVl-1原型株全基因组序列相比对，核苷酸同源性为80．1％，氨基酸同源性为96．7％；构建基于全长VP1基因序列的进化树图并进行基因分型分析，ECH020可分为6个基因型，中国分离株分属Ⅲ和Ⅳ基因型，其中KM／EV20／2010属于基因型Ⅳ，且6个基因型之间核苷酸的差异为9．4％-21．7％。基于全基因组序列的种系进化分析提示KM／EV20／2010分离株与ECH020原型株JV-1遗传距离很远，未与原型株JV-1聚簇分布，而与ECH030病毒株遗传距离较近。分析发现KM／EV20／2010序列在非结构区可能存在重组。结论中国ECH020可分为6个基因型，KM／EV20／2010分离株属于Ⅳ基因型。

关键词：埃可病毒全基因组序列分析

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烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与氢氧化铝联合佐剂对HBsAg诱导小鼠体液免疫应答的影响

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中国生物制品学杂志 2012年第9期25卷 1143-1146页

作者：王琳王海漩李建芳李彦涵胡凝珠胡云章中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所疫苗研究室云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的研究烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)与氢氧化铝联合佐剂对HBsAg诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法将NAD与氢氧化铝按不同剂量联合后,与不同剂量的HBsAg混合,分别经肌肉注射免疫ICR小鼠1针或2针(间隔2... 详细信息

目的研究烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)与氢氧化铝联合佐剂对HBsAg诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法将NAD与氢氧化铝按不同剂量联合后,与不同剂量的HBsAg混合,分别经肌肉注射免疫ICR小鼠1针或2针(间隔2周),每只注射0.2 ml,并设阴性对照组(生理盐水)、单纯抗原对照组、单纯铝佐剂对照组和单纯NAD对照组,共23组,每组6只。分别于末次免疫后2、4、6、8、10、12周采血,分离血清,采用ELISA法检测小鼠血清中抗HBsAg IgG水平;试验期内,观察小鼠是否发生异常状况;14周后,取最佳剂量免疫组及阴性对照组小鼠心、肝、脾、肺组织做组织切片,进行病理分析。结果阴性对照组在各时间点均未检测到抗HBsAg IgG抗体,除联合佐剂12组外,其余各组血清抗HBsAg IgG抗体水平均在末次免疫后第6周达峰值,随着时间的延长,抗体水平呈下降趋势;联合佐剂14组(HBsAg 2μg+氢氧化铝100μg+NAD 2.5μg)产生的抗体水平最高,且持续时间较长,其对HBsAg的体液免疫增强效应显著优于单纯抗原对照组、单纯铝佐剂对照组及单纯NAD佐剂对照组(P<0.05)。试验期内,各组小鼠均未出现异常反应;最佳剂量免疫组(14组)及阴性对照组组织切片观察结果显示,均为发生病变。结论 NAD与氢氧化铝联合佐剂能显著增强HBsAg诱导的小鼠特异性体液免疫应答,在免疫剂量范围内,联合佐剂安全性良好。

关键词： NAD 氢氧化铝佐剂乙型肝炎表面抗原体液免疫应答

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2009年云南省柯萨奇病毒B3型分离株A103／KM／09全基因序列分析

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中华流行病学杂志 2013年第12期34卷 1208-1212页

作者：杨卉娟刘建生张云昆马忠飞赵卫中潘玥陈俊英邵聪文马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的分析2009年云南省脑炎患儿粪便标本分离的柯萨奇病毒B3型分离株A103／KM／09全基因序列，了解其遗传特性。方法设计针对柯萨奇病毒B3型引物，提取病毒RNA、RT-PCR扩增和产物直接测序获得全基因组序列，利用Geneious和Mega5．05软件... 详细信息

目的分析2009年云南省脑炎患儿粪便标本分离的柯萨奇病毒B3型分离株A103／KM／09全基因序列，了解其遗传特性。方法设计针对柯萨奇病毒B3型引物，提取病毒RNA、RT-PCR扩增和产物直接测序获得全基因组序列，利用Geneious和Mega5．05软件进行核苷酸、氨基酸序列比对及其系统进化分析，应用RDP3和SimPlot3．5．1重组软件对序列进行重组分析。结果该分离株全基因组核苷酸序列长度为7389bp。其核苷酸和氨基酸序列与其原型株Nancy的同源性分别为81．0％和95．7％；与其他柯萨奇病毒B3型毒株的各区段核苷酸和氨基酸同源性分别为81．0％～88．0％和95．7％～98．0％；进化分析发现CVB3可分为5个分支（I～V），核苷酸之间的差异为16．2％-24．3％；中国分离株属V分支，又可分为A～D亚分支，核苷酸之间的差异为4．3％～11．4％。并发现A103／KM／09株基因序列在非结构区可能存在重组事件。结论柯萨奇病毒B3型分为5个基因型，云南分离株A103／KM／09属于V—D亚型，而中国分离株已经发生一定进化。

关键词：柯萨奇病毒B3型全基因序列序列分析

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