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2015医学前沿论坛暨第十四届全国肿瘤药理与化疗学术会议

作者：刘秀均郑艳波李毅吴淑英甄永苏中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所肿瘤研究室

目的肿瘤的发生发展是多阶段多因素的复杂过程,肿瘤细胞所处的微环境中各个因素都可以作为肿瘤综合治疗的靶点。利用同时针对肿瘤细胞以及调节肿瘤微环境双管齐下的策略,分析设计优选靶点网络的关键点,达到杀伤肿瘤细胞以及调节微环境... 详细信息

目的肿瘤的发生发展是多阶段多因素的复杂过程,肿瘤细胞所处的微环境中各个因素都可以作为肿瘤综合治疗的靶点。利用同时针对肿瘤细胞以及调节肿瘤微环境双管齐下的策略,分析设计优选靶点网络的关键点,达到杀伤肿瘤细胞以及调节微环境的目的,得到高疗效、安全性好、疗效持久的多功能靶向高效的新型抗肿瘤药物组合,提高临床的治疗水平,为肿瘤的综合治疗提供有价值的依据与参考。方法采用克隆形成法检测药物的体外细胞毒性,使用小鼠肿瘤模型和人体癌瘤裸鼠移植模型,观察药物的体内实验疗效。同时使用细胞学和分子生物学方法,研究有效药物的作用机制,用病理组织学方法研究其毒性作用特点。结果经过深入地研究和大量的筛选,得到了一种由低细胞毒性药物双嘧达莫(Dipyridamole)、乌苯美司(Ubenimex)和地塞米松(Dexamethasone)组成的具有高效广谱抗肿瘤作用的多功能药物组合(A multifunctional drug combination,DBDx)。大量试验验证,DBDx在体内有显著抗肿瘤活性,可耐受剂量抑瘤率可达90%以上,能有效地延长动物生存时间,对于人肝癌、肺癌、肠癌的治疗效果大大优于相应的一线药物5-氟尿嘧啶、吉西他滨、卡培他滨等,对于EGFR高表达的人鳞癌A431,其治疗效果与一线药物吉非替尼疗效相当。DBDx系统毒性极低,小鼠口服的LD50大于2g/kg。采用同时针对肿瘤细胞与肿瘤微环境的策略,将调节微环境的组合药物DBDx分别与临床常用化疗药物合用,其治疗效果大大优于相应的临床常用一线药物如紫杉醇、阿霉素、顺铂、丝裂霉素、氟尿嘧啶等。除了对化疗敏感的肿瘤有不错的疗效外,对于临床比较难治的肿瘤,如胰腺癌、结肠癌、多发性骨髓瘤等,均有不错的疗效。将DBDx分别与吉西他滨或卡培他滨合用对人胰腺癌裸鼠移植瘤有显著的抑制作用,抑瘤率可分别高达97.8%与94.9%,并能明显延长荷瘤小鼠的生存时间。尤其值得注意的是,病理切片中,肿瘤很小且大面积坏死,只有周边极少瘤组织存活。机制研究结果表明,DBDx通过影响血管生成及免疫、炎症反应,从而影响肿瘤的微环境而发挥抗肿瘤活性。结论 DBDx是一种由低细胞毒性药物组成的广谱、高效、以综合调节肿瘤微环境为基准的多功能药物组合,在动物体内具有显著的抗肿瘤活性,且系统毒性低,可望成为一种具有抗肿瘤活性的新药物。与化疗药物联用,同时针对肿瘤细胞以及调节肿瘤微环境,能够达到更好的疗效,具有更广的研究空间与应用前景。

关键词：多功能药物组合广谱抗肿瘤高疗效低细胞毒性调节肿瘤微环境

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CD47表达水平与胰腺癌细胞化疗药物敏感度相关性

CD47表达水平与胰腺癌细胞化疗药物敏感度相关性

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2015医学前沿论坛暨第十四届全国肿瘤药理与化疗学术会议

作者：王瑞琪江敏甄永苏中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所肿瘤研究室

目的 CD47是一种广泛表达于细胞膜表面的跨膜糖蛋白,据报告在多数实体瘤细胞均有较高表达,可与巨噬细胞表面的SIRα形成复合体,保护癌细胞逃避免疫系统监视和清除。不同肿瘤细胞CD47的表达水平存在差异。衣霉素(Tunicamyein,TNM)是一种... 详细信息

目的 CD47是一种广泛表达于细胞膜表面的跨膜糖蛋白,据报告在多数实体瘤细胞均有较高表达,可与巨噬细胞表面的SIRα形成复合体,保护癌细胞逃避免疫系统监视和清除。不同肿瘤细胞CD47的表达水平存在差异。衣霉素(Tunicamyein,TNM)是一种核苷类抗生素,可以抑制细胞糖蛋白合成,诱导内质网应激。平阳霉素(Pingyangmycin,PYM)和阿霉素(Doxorubicin,DXR)是临床用抗肿瘤抗生素。本研究目的是观察TNM对胰腺癌细胞CD47表达水平的影响;并通过TNM分别与PYM或DXR联合用药,观察对癌细胞的抑制增殖作用,探讨CD47表达水平与癌细胞对化疗药物敏感度的相关性。方法使用两种胰腺癌细胞株MIA PaCa-2和PANC-1。通过Western Blotting检测两种细胞株的CD47表达水平以及TNM对其CD47表达水平的影响。采用MTT法检测药物对肿瘤细胞的抑制增殖作用,设计YNM单药以及TNM分别与PYM或DXR两种化疗药物联合用药,以半数抑制浓度(IC50)和两药相互作用系数(CDI)作为细胞对药物敏感度的初步判断标准。结果 MIA PaCA.2细胞的CD47表达水平低于PANC-1细胞。TNM处理MIAPaCa-2细胞可以下调细胞CD47的表达水平,但PANC-1对相同浓度和时间的处理则不敏感。MIAPaCa-2细胞对TNM单药、TNM与DXR联合用药、YNM与PYM联合用药均明显表现出较高的敏感度。TNM单药在较低的浓度范围内对MIA PaCa-2和PANC-1细胞的增殖均有一定抑制作用;前者更为敏感,其IC50值约为后者的1/1O。MIA PaCa-2细胞在TNM与DXR或PYM联用的CDI值均小于1,呈现协同效应。然而PANC-1细胞对药物联用的敏感度低于MIA PaCa-2,不同浓度药物组的CDI值在1附近有波动,未见协同效应。结论初步结果表明,MIA PaCa-2和PANC-1两种胰腺癌细胞株的CD47表达水平存在差异。对于胰腺癌MIA PaCa-2细胞,TNM可下调其CD47表达水平并可增强PYM或DXR对癌细胞的增殖抑制作用。提示CD47表达水平不仅与巨噬细胞功能有关,还可能与癌细胞对化疗药物敏感程度存在相关性。

关键词：胰腺癌细胞 MIA TNM 化疗药物胰腺癌细胞株度相关性

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以CD30为靶点的抗体药物

以CD30为靶点的抗体药物

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2015医学前沿论坛暨第十四届全国肿瘤药理与化疗学术会议

作者：王蓉苗庆芳甄永苏中国医学科学院/北京协和医学院医药生物技术研究所肿瘤室

CD30是肿瘤坏死因子受体超家族(Tumor necrosis factor receptor superfamily,TNFRSF)成员之一,属于Ⅰ型跨膜糖蛋白,过表达于霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma,HL)和间变性大细胞淋巴瘤(Anaplastic large cell lymphomas,ALCL);低表达于正常激活的T细胞和B细胞表面;但在正常细胞不表达。早期研究指出CD30参与细胞的活化和分化、NF-κB等信号传导途径,以及T细胞等的免疫激活过程。近年研究发现CD30与细胞的增殖和死亡密切相关,特别是其胞内结构部分可与TNFR相关因子家族(TNFRassociated factor,TRAF)的多个成员相互作用,不仅能够通过JNK和p38途径诱导细胞凋亡,还可以依赖NF-κB途径介导细胞活化。临床上,对恶性和易复发性HL和ALCL的治疗一直未取得良好的效果,而对CD30生物学功能的进一步认识及其较高表达于HL和ALCL细胞表面的重要特征,为开展基于抗CD30的靶向性免疫治疗提供依据。自1997年美国食品药品监督管理局(FDA)批准的第一个单克隆抗体药物利妥昔单抗(Rituximab)用于肿瘤治疗后,基于抗体的免疫治疗逐渐成为该领域的重要策略之一。针对CD30的抗体研究始于20世纪90年代初,Falini等将抗CD30单克隆抗体Ber-H2应用于6位晚期HL患者的治疗性研究,发现放射性同位素标记的Ber-H2可特异性的靶向霍奇金淋巴瘤HRS细胞,但无明显的抗肿瘤效果。之后,Tarrari和Falini等又将Ber-H2与Ⅰ型核糖体失活蛋白Sapofin(S06)连接,获得一种新型的抗CD30的免疫毒素,并且取得较好的肿瘤治疗效果,但明显的人抗鼠抗体反应(HAMA)限制了其广泛的临床应用。为提高抗CD30抗体的临床治疗效果,随后又发展了许多修饰型抗体,包括双特异性抗体、抗体药物偶联物以及人源化抗体等;其中,以SGN-35为代表的抗CD30抗体药物偶联物在临床研究中表现出显著的抗肿瘤效果。2011年8月,FDA批准靶向CD30的SGN-35抗体药物偶联物(Brentuximab Vedotin,商品名为:Adcetris)用于治疗自体干细胞移植失败或两次既往化疗失败且不能接受自体干细胞移植的HL以及一次既往化疗失败的ALCL患者。CD30是恶性血液肿瘤的一个重要分子靶点,因此SGN-35的成功研制具有里程碑意义,为更多新型抗体药物偶联物的开发及应用奠定了重要的基础,并进一步促进免疫治疗研究的发展。基于以上背景并结合我室多年研究抗体药物的工作基础,我们成功的研发了一种新型抗CD30抗体药物偶联物,初步研究结果表明该偶联物与亲本抗体具有一致的抗原结合活性并对CD30阳性的肿瘤细胞有良好的靶向作用和强烈的杀伤活性。该偶联物的成功研发将为我国提供一种具有自主知识产权的新型淋巴瘤候选药物,目前相关研究正在进行中。

关键词：抗体药物偶联物细胞表面

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依博素生物合成基因ste22的异源置换研究

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中国医药生物技术 2015年第3期10卷 228-235页

作者：郭连宏张洋鲍勇刚白利平姜蓉李元中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室北京100050

目的依博素是由链霉菌产生的一种新型胞外多糖,具有显著抗类风湿性关节炎的作用,我们研究已确定了该多糖的生物合成基因簇(ste)。为了对依博素结构进行改造以提高其生物活性,对其生物合成基因ste22进行了异源置换研究。方法采用PCR扩增... 详细信息

目的依博素是由链霉菌产生的一种新型胞外多糖,具有显著抗类风湿性关节炎的作用,我们研究已确定了该多糖的生物合成基因簇(ste)。为了对依博素结构进行改造以提高其生物活性,对其生物合成基因ste22进行了异源置换研究。方法采用PCR扩增方法从乳酸菌获得了编码葡萄糖糖基转移酶的基因gtf,通过基因同源重组双交换,从链霉菌中置换了ste22基因。采用白细胞介素-1合成酶活性测定方法及小鼠巴豆油急性炎症模型,初步确定了基因置换株的依博素衍生物生物活性。结果获得了葡萄糖糖基转移酶基因置换株Streptomyces sp.139(gtf-22),产生了依博素新衍生物EPS-22g。研究表明该衍生物与依博素相比,葡萄糖比例从2.14%显著上升到48.64%,体外活性实验显示,其对炎症细胞因子白细胞介素-1合成关键酶ICE抑制率高于依博素,小鼠巴豆油急性炎症体内活性分析结果证明,该衍生物抑制活性亦高于依博素。结论采用异源基因置换生物合成基因的方法改造依博素产生菌,可能是获得生物活性较好新多糖衍生物的一种有效手段。

关键词：异源基因置换基因gtf 基因ste22 链霉菌乳酸菌

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小檗碱对转化生长因子β1诱导人胚肺成纤维细胞转分化及丝裂原活化蛋白激酶信号通路蛋白磷酸化水平的影响

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中国医药生物技术 2015年第4期10卷 340-345页

作者：任志涛游雪甫于会明杨信怡中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所药理室北京100050 北京大学肿瘤医院肿瘤放疗科 100142

目的探讨小檗碱对转化生长因子β1诱导的人胚肺成纤维细胞MRC-5转分化过程中细胞外羟脯氨酸和细胞内平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白及丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关蛋白磷酸化水平的影响。方法体外培养MRC-5细胞,采用MTT法检测不同浓度小... 详细信息

目的探讨小檗碱对转化生长因子β1诱导的人胚肺成纤维细胞MRC-5转分化过程中细胞外羟脯氨酸和细胞内平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白及丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关蛋白磷酸化水平的影响。方法体外培养MRC-5细胞,采用MTT法检测不同浓度小檗碱对细胞增殖的抑制作用,确定适合的作用范围;Western blot法检测不同浓度转化生长因子β1刺激MRC-5细胞转分化过程中平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白表达水平,确定适宜的转化生长因子β1诱导浓度。不同浓度小檗碱预处理的MRC-5细胞经转化生长因子β1刺激后,采用比色法测定细胞外羟脯氨酸水平,对于细胞内平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白表达水平以及丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关蛋白p38 MAPK、SAPK/JNK、ERK1/2的磷酸化水平采用Western blot法进行检测。结果参考MTT法检测结果 ,选定小檗碱适宜浓度(20、40、80μmol/L)进行研究。Western blot结果显示2 ng/ml浓度转化生长因子β1可明显诱导MRC-5细胞转分化。小檗碱预处理的MRC-5细胞,较单纯转化生长因子β1诱导细胞,培养液中羟脯氨酸水平明显降低。Western blot法检测结果显示,小檗碱预处理细胞较单纯转化生长因子β1诱导细胞,平滑肌肌动蛋白、纤连蛋白表达水平明显受到抑制,丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关蛋白p38 MAPK、SAPK/JNK、ERK1/2磷酸化水平亦受到不同程度抑制。结论小檗碱预处理对转化生长因子β1诱导的MRC-5细胞转分化过程有抑制作用,其机制可能与小檗碱下调丝裂原活化蛋白激酶信号通路相关蛋白的磷酸化水平有关。

关键词：小檗碱转化生长因子β1 特发性肺纤维化 p38丝裂原活化蛋白激酶类 MRC-5细胞

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BMP2表达上调剂E40071体外抗骨质疏松活性研究

BMP2表达上调剂E40071体外抗骨质疏松活性研究

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2015年中国药学大会暨第十五届中国药师周

作者：韩小婉宫世强李雪虹贺晓波姜威司书毅中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所国家新药(微生物)筛选实验室

骨形态发生蛋白Ⅱ(Bone morphogenetic protein 2, BMP2)在骨发育与重建中具有重要作用,本研究利用前期已构建的BMP2表达上调剂高通量筛选模型对20000个化合物进行了筛选,得到阳性化合物E40071[2-(4-(5-甲基-3-苯基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-... 详细信息

骨形态发生蛋白Ⅱ(Bone morphogenetic protein 2, BMP2)在骨发育与重建中具有重要作用,本研究利用前期已构建的BMP2表达上调剂高通量筛选模型对20000个化合物进行了筛选,得到阳性化合物E40071[2-(4-(5-甲基-3-苯基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)哌嗪-1-基)乙-1-醇],其EC50值为2.73μmol·L-1。体外活性研究表明,E40071能上调BMP2及其下游特异性转录因子Runx2、Osx的mRNA的表达,并通过促进Smad1/5/8蛋白磷酸化,上调Runx2蛋白的表达;对成骨细胞碱性磷酸酶活性具有一定的上调作用;茜素红染色结果表明,E40071能够促进成骨细胞钙化。进一步研究发现,E40071能够明显抑制RANKL诱导下小鼠巨噬细胞Raw264.7分化为破骨细胞,并降低破骨细胞分化标志MMP9和NFATc1蛋白的表达水平。研究结果表明,E40071可促进成骨细胞骨形成活性并抑制破骨细胞的分化。

关键词： 2-(4-(5-甲基-3-苯基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)哌嗪-1-基)乙-1-醇骨形态发生蛋白Ⅱ 骨质疏松成骨分化破骨分化

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北仑河红树林内生放线菌分离、鉴定及活性研究

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农业生物技术学报 2015年第7期23卷 894-904页

作者：杨桂柳杨立芳姜明国吴家法甘光华庹利孙承航广西民族大学海洋与生物技术学院/广西高校微生物与植物资源利用重点实验室广西民族大学化学化工学院/广西高校食品安全与药物分析化学重点实验室/广西林产化学与工程重点实验室中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所

放线菌是天然抗生素的重要来源,是寻找天然抗感染活性产物的出发菌。为了分离广西壮族自治区北仑河红树植物内生放线菌,检测其抗菌活性及初步确定活性菌株的分类地位,本研究采集5种红树植物共15份样品,用14种液体培养基富集培养4周后,... 详细信息

放线菌是天然抗生素的重要来源,是寻找天然抗感染活性产物的出发菌。为了分离广西壮族自治区北仑河红树植物内生放线菌,检测其抗菌活性及初步确定活性菌株的分类地位,本研究采集5种红树植物共15份样品,用14种液体培养基富集培养4周后,涂布于相应固体培养基进行分离纯化;以6种细菌和20株白色念珠菌(Candida albicans)为指示菌,采用点植法和滤纸片法对分离到的菌株进行抗菌活性检测;选取其中有抗菌活性的菌株进行16S r RNA基因测序,在属水平初步确定其分类地位。结果表明,共分离到菌株200株,其中从白骨壤(Avicennia marina)、秋茄(Kandelia candel)、红海榄(Rhizophora stylosa)、苦郎树(Clerodendrum inerme)和海漆(Excoecaria agallocha)中分别获得62、43、38、29和28株。根据培养和形态学特征初步剔除重复后得到106株,其中活性菌株52株,阳性率为49.1%,包括21株链霉菌属(Streptomyces)、26株拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、2株假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、2株壤球菌属(Agrococcus)和1株栖白蚁菌属(Isoptericola)。其中菌株UMBR 1016和UMBR 1034与已知菌株Nocardiopsis alba DSM 43377T的相似度分别为98.27%和98.37%;菌株UMBR 1008与Nocardiopsis flavescens SA6T的相似度为98.36%,菌株UMBR 1028与Streptomyces pratensis ch24T的相似度为98.49%,这4株内生放线菌的相似度都低于98.6%,可能为拟诺卡氏菌属和链霉菌属的潜在新种。有38株对至少一株细菌有抑菌作用,35株对至少一株白色念珠菌有抑菌作用,阳性率分别达到35.8%和33.0%。广西北仑河红树植物内生放线菌资源丰富,抗菌活性较高,值得深入研究。研究结果将促进我国红树林植物资源的保护与红树植物内生放线菌药用资源的深入开发。

关键词：红树植物内生放线菌分离抗菌活性

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广西红树林根际土壤放线菌的原位培养分离及其活性筛选

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海洋学报 2015年第2期37卷 55-64页

作者：姜明国甘光华杨立芳李西妮杨桂柳庹利孙承航黄玲蓝金枝广西红树林保护与利用重点实验室广西北海536000 广西民族大学广西高校微生物与植物资源利用重点实验室广西南宁530008 广西民族大学化学化工学院广西林产化学与工程重点实验室广西南宁530008 中国医学科学院/北京协和医学院医药生物技术研究所北京100050

为了发掘广西红树林根际土壤的放线菌资源,本文利用原位培养装置,埋于根际土壤中俘获放线菌,30d后取回实验室,采用平板涂布法对4个地点的原位培养样品于15种培养基上进行分离纯化;对分离株基于16SrRNA基因序列进行系统发育分析;进一步... 详细信息

为了发掘广西红树林根际土壤的放线菌资源,本文利用原位培养装置,埋于根际土壤中俘获放线菌,30d后取回实验室,采用平板涂布法对4个地点的原位培养样品于15种培养基上进行分离纯化;对分离株基于16SrRNA基因序列进行系统发育分析;进一步进行抗菌活性和产酶活性检测。共分离得到113株放线菌。对其中33株放线菌进行测序,结果表明20株属于链霉菌属,11株属于拟诺卡氏菌属,1株属于伦兹氏菌属,1株与拟诺卡氏菌属相似性最高为90%,很可能属于放线菌一个新属。抗菌实验结果显示其中有7株、4株、18株、6株、10株、3株实验菌株分别对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌、乙型溶血性链球菌和肺炎克雷伯氏菌具有抑制作用;有55株、62株、24株、72株的实验菌株分别具有纤维素酶活性、淀粉酶活性、胶原蛋白酶活性、酯酶活性。原位培养可以丰富对广西红树林根际土壤的认识,分离到了新种甚至可能是新属的放线菌,分离得到的部分放线菌菌株具有较高生物活性,为后续工作提供了良好的实验材料。

关键词：原位培养红树林根际土壤放线菌生物活性

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化合物IMB-1680体外抗动脉粥样硬化的活性研究

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药学学报 2014年第5期49卷 602-607页

作者：冯婷婷李永臻李霓刘畅王潇许艳妮司书毅中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所国家新药(微生物)筛选实验室北京100050

探讨化合物IMB-1680的体外抗动脉粥样硬化活性。利用已构建的高表达人CD36细胞株Sf9[hCD36]和CHO[hCD36]测定量效曲线,荧光显微照相法和流式细胞实验检测细胞对变性低密度脂蛋白(modified low density lipoprotein,mLDL)的摄取,巨噬细... 详细信息

探讨化合物IMB-1680的体外抗动脉粥样硬化活性。利用已构建的高表达人CD36细胞株Sf9[hCD36]和CHO[hCD36]测定量效曲线,荧光显微照相法和流式细胞实验检测细胞对变性低密度脂蛋白(modified low density lipoprotein,mLDL)的摄取,巨噬细胞泡沫化实验检测细胞内脂质积聚。结果表明:IMB-1680在Sf9[hCD36]、CHO[hCD36]模型上IC50值分别为2.80及8.79μmol·L-1;IMB-1680能显著抑制细胞摄取DiI-AcLDL,同时能显著减少巨噬细胞RAW264.7摄取脂质。本研究为开发新型抗动脉粥样硬化药物奠定了基础。

关键词： IMB-1680 CD36 拮抗剂动脉粥样硬化高通量筛选

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防御素融合蛋白Ec-LDP-D5抗胰腺癌研究

防御素融合蛋白Ec-LDP-D5抗胰腺癌研究

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2015医学前沿论坛暨第十四届全国肿瘤药理与化疗学术会议

作者：刘文娟宋现让甄永苏山东省肿瘤防治研究院山东省放射肿瘤学重点实验室中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所

目的构建人防御素HD5（D5）、力达霉素辅基蛋白（LDP）与EGFR配体寡肽（Ec）组合的融合蛋白,以期得到一种以防御素作为"效应"分子、以力达辅基蛋白为支架的、具有靶向EGFR功能的新型抗癌药物。方法主要采用基因工程的方法制... 详细信息

目的构建人防御素HD5（D5）、力达霉素辅基蛋白（LDP）与EGFR配体寡肽（Ec）组合的融合蛋白,以期得到一种以防御素作为"效应"分子、以力达辅基蛋白为支架的、具有靶向EGFR功能的新型抗癌药物。方法主要采用基因工程的方法制备融合蛋白基因并将其表达纯化,得到融合蛋白Ec-LDP-D5。融合蛋白与细胞表面EGFR的亲和活性主要采用了ELISA、细胞免疫荧光化学法;采用CCK-8法测定融合蛋白对人胰腺癌细胞PNAC-1和Aspc-1的体外杀伤活性。结果表达该重组蛋白的质粒pET30a（+）/Ec-LDP-D5经过酶切鉴定和序列测定后,转化于大肠杆菌BL21（DE3）中,进行诱导表达,产物主要以包涵体的形式存在,目的蛋白经纯化、复性后,每升发酵液可以获得1 mg纯度达到85%以上有活性的Ec-LDP-D5融合蛋白。ELISA和基于流式细胞术的荧光试验结果显示,Ec-LDP-D5融合蛋白对EGFR高表达的肿瘤细胞系,如PNAC-1和Aspc-1细胞均有很强的结合活性,而对不表达EGFR的J774A.1细胞则无结合活性。细胞免疫荧光化学试验证实Ec-LDP-D5可与PNAC-1和Aspc-1细胞表面结合。CCK-8法检测PNAC-1和Aspc-1细胞结果表明,融合蛋白Ec-LDP-D5IC值为2.1×10M和1.3×10M。结论本研究构建并制备了一种含有防御素HD5和EGFR配体寡肽以及力达霉素辅基蛋白的融合蛋白Ec-LDP-D5,该融合蛋白可特异地与EGFR高表达的PNAC-1和Aspc-1细胞结合,对人的胰腺癌细胞株有显著的生长抑制作用。结果表明,Ec-LDP-D5是以防御素为"效应"分子的、具有EGFR靶向功能的新型抗肿瘤融合蛋白。

关键词：力达霉素表皮生长因子受体防御素靶向治疗

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