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2015医学前沿论坛暨第十四届全国肿瘤药理与化疗学术会议

作者：郭晓芳朱小飞钟根深曹海英苗庆芳新乡医学院基础医学院微生物学教研室新乡医学院医学检验学院临床免疫学教研室新乡医学院第一附属医院中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所肿瘤室

目的表皮生长因子受体（EGFR）和胰岛素样生长因子受体I（IGF-IR）在人非小细胞肺癌中呈过表达状态,且二者之间可发生多种形式的相互作用,是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）治疗的理想靶点;力达霉素（LDM）是一种强... 详细信息

目的表皮生长因子受体（EGFR）和胰岛素样生长因子受体I（IGF-IR）在人非小细胞肺癌中呈过表达状态,且二者之间可发生多种形式的相互作用,是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）治疗的理想靶点;力达霉素（LDM）是一种强效的抗肿瘤抗生素,它与抗体或配体的偶联物显示了良好的抗肿瘤疗效。本研究的目的是构建一种以EGFR和IGF-1R为靶点的双特异性融合蛋白,并探讨其对NSCLC的体内外抗肿瘤活性。方法将EGFR和IGF-1R的配体EGF和IGF-1基因与LDM辅基蛋白基因LDP通过拼接PCR进行连接,并克隆至pET30a得到重组表达载体pET-egf-ldp-igf,将其转化到大肠杆菌中进行诱导表达,获得融合蛋白EGF-LDP-IGF。采用ELISA检测融合蛋白与EGFR和IGF-1R的亲和活性。融合蛋白与LDM发色团分子（AE）体外组装,得到强化融合蛋白EGF-LDP-IGF-AE。采用MTT法检测强化融合蛋白EGF-LDP-IGF-AE对NSCLC细胞的体外杀伤活性,并与两种单靶向性强化融合蛋白EGF-LDP-AE和LDP-IGF-AE的体外细胞毒活性进行比较。PI染色法检测EGF-LDP-IGF-AE对细胞周期的影响以及Annexin V-FITC/PI双染法检测EGF-LDP-IGF-AE蛋白对细胞凋亡的诱导活性。结果重组载体pET-egf-ldp-igf转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,SDS-PAGE结果显示EGF-LDP-IGF以包涵体形式存在于大肠杆菌胞质中。提取包涵体组分采用Ni亲和层析技术对融合蛋白进行纯化,经复性后获得有活性的EGF-LDP-IGF蛋白。经ELISA检测EGF-LDP-IGF蛋白与EGFR和IGF-1R均有很高的亲和活性。将AE分子与EGF-LDP-IGF体外组装后,HPLC检测在350nm处出现了特定的吸收峰,表明分子组装成功获得了强化融合蛋白EGF-LDP-IGF-AE。MTT试验显示EGF-LDP-IGF-AE对A549、H520、H460和H1299细胞的IC值分别为:3.15×10mol/L、7.51×10mol/L、3.38×10mol/L和2.51×10mol/L,其杀伤活性显著高于LDM和两种单靶向性的强化融合蛋白EGF-LDP-AE和LDP-IGF-AE。细胞周期检测显示,EGF-LDP-IGF-AE导致细胞显著的G2/M期阻滞。细胞凋亡结果显示,EGF-LDP-IGF-AE在O.1nM、0.5nM、1nM和2nM的浓度下,A549细胞的凋亡比率分别为13.35%±1.39%、15.39%±0.81%、22.39%±3.35%、55.95%±9.26%,与对照组相比均具有显著性差异。结论本研究以EGFR和IGF-IR的天然配体EGF和IGF作为导向载体,以LDM作为弹头药物,制备了一种兼具双靶向、小型化和高效化的新型融合蛋白EGF-LDP-IGF-AE。该融合蛋白可高亲和性地与EGFR和IGF-1R结合,对体外培养的NSCLC细胞具有强烈杀伤作用,并可显著诱导NSCLC细胞发生周期阻滞与细胞凋亡。

关键词： EGFR IGF-1R 双特异性融合蛋白 NSCLC

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微生物来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的建立和初步应用

微生物来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的建立和初步应用

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第七届全国微生物资源学术暨国际微生物系统与分类学研讨会

作者：于彩云赵莉莉张晶晶赵建元丁寄葳魏涛北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室北京100191 中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所北京100050

[目的]建立α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型，应用此模型筛选微生物发酵液粗提物样品.[方法]应用昆明种小鼠十二指肠上段提取的α-葡萄糖苷酶，以4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷为反应底物，建立α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型，应... 详细信息

[目的]建立α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型，应用此模型筛选微生物发酵液粗提物样品.[方法]应用昆明种小鼠十二指肠上段提取的α-葡萄糖苷酶，以4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷为反应底物，建立α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型，应用此模型筛选得到具有α-葡萄糖苷酶抑制剂活性的微生物发酵液粗提物样品.[结果]经过评价确定所建模型稳定可行，可用于α-葡萄糖苷酶抑制剂的高通量筛选;用该模型对2560个微生物发酵液粗提物样品进行筛选，经过初筛及复筛，最终得到40个对α-葡萄糖苷酶抑制活性较好的阳性样品，复筛阳性率为1.56％.[结论]建立了灵敏度好、稳定性高的α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型.

关键词： α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型微生物发酵液粗提物糖尿病

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基因序列分析指导的海洋糖丝菌中特曲霉素X的发现

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药学学报 2014年第2期49卷 230-236页

作者：刘玢谭亿甘茂罗周红霞王以光平欲晖李斌杨兆勇肖春玲中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所北京100050 中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室北京100050 江西中医药大学江西南昌330004

一株海洋来源的稀有放线菌（Saccharothrix sp．10—10）发酵液粗提物显示出较强的抗革兰阳性耐药菌活性。对该产生菌中可能参与次级代谢产物生物合成的主要关键酶系基因保守序列的聚合酶链反应fpolymerase chain reaction，PCR）分析... 详细信息

一株海洋来源的稀有放线菌（Saccharothrix sp．10—10）发酵液粗提物显示出较强的抗革兰阳性耐药菌活性。对该产生菌中可能参与次级代谢产物生物合成的主要关键酶系基因保守序列的聚合酶链反应fpolymerase chain reaction，PCR）分析，发现其II型聚酮合酶基因片段，与特曲霉素生物合成基因簇中的相关序列具有较高的同源性。经活性追踪，利用多种色谱方法从Saccharothrixsp．10-10发酵液中分离纯化得到特曲霉素x（tetracenomycin X，1），同时还得到氧代托马霉素（oxotomaymycin，2），该两种化合物为首次从海洋糖丝菌属放线菌中发现，并利用2DNMR对这两个化合物的”CNMR数据进行了准确归属。体外活性结果表明，化合物1对甲氧西林耐药金葡菌（MRSA）和万古霉素耐药肠球菌（VRE）等耐药菌显示出显著的抗菌活性，最低抑菌浓度（MIC）为32-64μg·mL^-1；此外，化合物1还对多株人肿瘤细胞显示出较强的细胞毒活性，IC50值为5．1～18．0μmol·L^-1。

关键词：海洋放线菌糖丝菌基因探查耐药菌特曲霉素X 氧代托马霉素

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自噬影响衰老及老年病的研究进展

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药学学报 2014年第6期49卷 764-773页

作者：花芳余娇娇李珂胡卓伟中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室新药作用机制研究与药效评价北京市重点实验室(BZ0150)北京100050 中国医学科学院、北京协和医学院医药生物技术研究所北京100050

自噬是降解损伤及丧失功能的细胞器或蛋白,维持细胞更新和稳态的关键细胞机制。衰老是随时间逐渐出现的细胞修复机制障碍,导致损伤的分子、细胞大量堆积,并伴随功能障碍。衰老往往伴随自噬活性不足,而许多老年病受累组织也存在自噬功能... 详细信息

自噬是降解损伤及丧失功能的细胞器或蛋白,维持细胞更新和稳态的关键细胞机制。衰老是随时间逐渐出现的细胞修复机制障碍,导致损伤的分子、细胞大量堆积,并伴随功能障碍。衰老往往伴随自噬活性不足,而许多老年病受累组织也存在自噬功能异常。最近的研究证明,自噬缺失导致突变和错误折叠的蛋白质在细胞内聚集是神经退行性疾病产生和发展的物质基础,而自噬在肿瘤、组织纤维增生以及心血管等不同类型疾病或疾病的不同阶段发挥双重调节作用。本文综述了最近有关自噬参与调节衰老和几种老年病发病分子细胞机制方面的研究进展,并概述了通过调节自噬活性防治老年病的策略。

关键词：自噬衰老神经退行性疾病纤维化肿瘤心血管疾病

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海洋链霉菌7-145中洋橄榄叶素衍生物的分离鉴定

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中国抗生素杂志 2014年第3期39卷 186-192页

作者：吴春彦谭亿甘茂罗蒙建州关艳周红霞戴剑漉王以光尚小雅杨兆勇肖春玲北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室北京10083 中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所北京100050 天然药物活性物质与功能国家重点实验室中国医学科学院北京协和医学院药物研究所北京100050

目的分离鉴定海洋链霉菌Streptomyces sp．7-145产生的抗耐药菌活性成分。方法通过活性追踪，利用大孔吸附树脂、凝胶、正反相色谱等多种色谱技术分离纯化活性成分；通过紫外光谱、质谱、核磁共振谱等波谱学方法鉴定其结构。利用琼脂稀... 详细信息

目的分离鉴定海洋链霉菌Streptomyces sp．7-145产生的抗耐药菌活性成分。方法通过活性追踪，利用大孔吸附树脂、凝胶、正反相色谱等多种色谱技术分离纯化活性成分；通过紫外光谱、质谱、核磁共振谱等波谱学方法鉴定其结构。利用琼脂稀释法和微量肉汤稀释法分别测定所得化合物的抗耐药菌和抗结核活性，利用MTT法评价其细胞毒性。结果从中分离鉴定了4个活性化合物，其结构分别确定为洋橄榄叶素（1）、11-O-甲基洋橄榄叶素（2）、11，11’-O-二甲基洋橄榄叶素（3）、14’-去乙基-14＇-甲基洋橄榄叶素（4）。化合物1～4对甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌（MRSA）和万古霉素耐药的肠球菌（VRE）等革兰阳性耐药菌具有较强的抗菌活性，最低抑菌浓度（MIC）为1～16μg／mL；所有化合物对结核分枝杆菌H37Rv株显示出显著的抑制活性（MIC：0．5～4μg／mL），其中化合物1对结核分枝杆菌多重耐药（MDR）、广泛耐药（XDR）等耐药株也表现出较强的抑制活性（MIC：0．5～1μg／mL）；1和2对人肝细胞（L02）、肾上皮细胞（293T）和乳腺癌细胞（MCF-7）具有较强的细胞毒活性，IC50值200．14～0．28μmol／L。结论化合物1～4具有较强的体外抗MRSA、VRE等耐药菌活性。首次发现洋橄榄叶素（1）具有体外抗结核分枝杆菌标准株、多重耐药以及广泛耐药株活性。化合物1和2对人正常肝、肾上皮细胞具有细胞毒性。

关键词：海洋放线菌链霉菌洋橄榄叶素结核分枝杆菌耐药菌

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新疆黑果枸杞根际土壤稀有放线菌多样性及抗菌活性研究

新疆黑果枸杞根际土壤稀有放线菌多样性及抗菌活性研究

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第七届全国微生物资源学术暨国际微生物系统与分类学研讨会

作者：旭格拉哈布丁李小俊马丽娅刘少伟孙承航新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室新疆师范大学生命科学学院新疆乌鲁木齐830054 中国医学科学院&北京协和医学院医药生物技术研究所北京100050 中国药科大学生命科学与技术学院南京211198

从新疆黑果枸杞根际土壤中分离纯化得到22株稀有放线菌,它们分布于6个放线菌属,包括拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis,14株),拟无枝酸菌属(Amycolatopsis,3株),普氏菌属(Prauserella,2株),诺卡氏菌属(Nocardia,1株),乔治菌属(Georgenia,1株)... 详细信息

从新疆黑果枸杞根际土壤中分离纯化得到22株稀有放线菌,它们分布于6个放线菌属,包括拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis,14株),拟无枝酸菌属(Amycolatopsis,3株),普氏菌属(Prauserella,2株),诺卡氏菌属(Nocardia,1株),乔治菌属(Georgenia,1株)和糖多孢菌属(Saccharopolyspora,1株)。采用6种病原细菌共12个菌株(金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌的敏感株和耐药株)、2种真菌(白色念珠菌、罗伦隐球菌)为检定菌,对22株放线菌发酵液乙酸乙酯萃取浓缩物进行抗菌活性筛选,结果显示6株拟诺卡氏菌株(4GLHGGQ3-1,4MMHGGQ8-1,4BSNHGGQ8-1,4GLHGGQ9-1,3BSNHGGQ4-2和4BSNHGGQ6-1)在至少一个抗菌活性检测中显示为阳性,抗细菌活性主要集中在大肠杆菌敏感和耐药株,肺炎克雷伯菌敏感和耐药株以及罗伦隐球菌。在盐碱环境中,拟诺卡氏菌属菌株呈优势微生物群落被大量分离得到,目前该菌属放线菌已有37个典型种及2个亚种,其中一半以上从盐碱环境中分离得到,其产生的次级代谢产物活性涵盖抗肿瘤,抗菌,细菌群体感应抑制,神经原细胞保护等多个重要方面。以往研究表明拟诺卡氏菌有较强合成活性天然产物能力,是从稀有放线菌中发现微生物药物重要的来源,本研究获得的活性菌株将为具有生物活性次级代谢产物的发现奠定基础。

关键词：稀有放线菌抗菌活性根际

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TRAIL和EGFR配体寡肽与力达霉素辅基蛋白融合蛋白制备过程的优化

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中国医药生物技术 2014年第2期9卷 103-109页

作者：朱大强陈淑珍中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所肿瘤室北京100050

目的对以包涵体形式表达的TRAIL和EGFR配体寡肽与力达霉素辅基蛋白融合蛋白Ec-LDP-TRAIL的制备过程进行优化。方法对大肠杆菌原核表达Ec-LDP-TRAIL目的蛋白的温度、诱导物浓度、起始菌体密度及时间等条件进行优化;在Ni2+亲和层析纯化蛋... 详细信息

目的对以包涵体形式表达的TRAIL和EGFR配体寡肽与力达霉素辅基蛋白融合蛋白Ec-LDP-TRAIL的制备过程进行优化。方法对大肠杆菌原核表达Ec-LDP-TRAIL目的蛋白的温度、诱导物浓度、起始菌体密度及时间等条件进行优化;在Ni2+亲和层析纯化蛋白过程中对样品预处理以及纯化缓冲液成分进行优化;对纯化后蛋白的分步透析复性过程进行一系列优化,并通过基于ELISA的结合活性实验分析Ec-LDP-TRAIL与肿瘤细胞的结合能力。结果经过工艺优化后,纯化后的融合蛋白Ec-LDP-TRAIL纯度达95%以上,复性后LB培养基活性蛋白收率约为2.2 mg/L,与初始复性条件相比提高近2倍。复性后融合蛋白Ec-LDP-TRAIL显示出能够与人表皮癌A431和人大细胞肺癌H460细胞的结合活性。结论融合蛋白Ec-LDP-TRAIL制备过程的优化为后续研发和生产奠定了实验基础,同时也为其他以包涵体形式表达的基于TRAIL的抗肿瘤蛋白药物的制备提供借鉴。

关键词：包涵体重组融合蛋白质类蛋白质复性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体

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基于抗体和配体的肿瘤靶向肽药物研究进展

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中国医药生物技术 2014年第4期9卷 294-299页

作者：李斌郑艳波李良甄永苏中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所肿瘤室北京100050

过去的二十年，肿瘤治疗已经从非特异性的化疗向具有选择性的基于发病机制的疗法转变[1]。分子靶向治疗作为肿瘤治疗的新手段，正以其疗效高、不良反应少且轻等特点而备受瞩目，现已成为肿瘤治疗领域的研究热点。它以肿瘤微环境、肿瘤... 详细信息

过去的二十年，肿瘤治疗已经从非特异性的化疗向具有选择性的基于发病机制的疗法转变[1]。分子靶向治疗作为肿瘤治疗的新手段，正以其疗效高、不良反应少且轻等特点而备受瞩目，现已成为肿瘤治疗领域的研究热点。它以肿瘤微环境、肿瘤细胞细胞膜或细胞内特异性表达或高表达的分子为作用靶点，能够更加特异地作用于肿瘤细胞，阻断其恶性增殖、转移或诱导其凋亡，同时降低了对正常细胞的杀伤作用，因此是十分有前途的肿瘤治疗方法之一[2]。

关键词：肿瘤靶向分子靶向治疗药物配体抗体肿瘤治疗方法非特异性肿瘤细胞

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吉西他滨对肺微血管内皮细胞的损伤及表没食子儿茶素没食子酸酯的保护作用

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中国医药生物技术 2014年第6期9卷 438-445页

作者：刘旭杰秦烨陈淑珍中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所肿瘤室北京100050

目的观察吉西他滨对大鼠肺微血管内皮细胞的影响及表没食子儿茶素没食子酸酯的保护作用。方法利用植块法分离大鼠肺微血管内皮细胞。SRB法检测药物对肺微血管内皮细胞和A549增殖的影响。流式细胞仪用于检测细胞周期和细胞凋亡。Western ... 详细信息

目的观察吉西他滨对大鼠肺微血管内皮细胞的影响及表没食子儿茶素没食子酸酯的保护作用。方法利用植块法分离大鼠肺微血管内皮细胞。SRB法检测药物对肺微血管内皮细胞和A549增殖的影响。流式细胞仪用于检测细胞周期和细胞凋亡。Western blot法检测凋亡相关蛋白含量。测定细胞内活性氧和超氧化物歧化酶水平以及乳酸脱氢酶渗透情况。结果吉西他滨能显著减少肺微血管内皮细胞细胞增殖并将其阻滞于S期。吉西他滨引起肺微血管内皮细胞细胞凋亡具有时间依赖性,处理24、48、72 h后细胞凋亡率分别为7.2%、15.4%、23.3%。同时,吉西他滨作用后细胞内活性氧含量上升,而处理48 h后超氧化物歧化酶水平显著下降。进一步研究发现,表没食子儿茶素没食子酸酯能够提高吉西他滨处理后肺微血管内皮细胞的存活率,并且减弱吉西他滨造成的超氧化物歧化酶水平的下降。结论吉西他滨对肺微血管内皮细胞具有损伤作用,能够引起肺微血管内皮细胞的凋亡和氧化应激的发生,而表没食子儿茶素没食子酸酯对吉西他滨引起的肺微血管内皮细胞损伤具有保护作用。

关键词：内皮细胞氧化性应激儿茶酚类吉西他滨

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抗明胶酶单链抗体与力达霉素融合蛋白抗肿瘤作用机制及疗效研究

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中国医药生物技术 2014年第4期9卷 250-259页

作者：高瑞娟尚伯杨盛唯瑾赵春燕李电东甄永苏中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所肿瘤室北京100050

目的探讨抗明胶酶单链抗体Fv与力达霉素(LDM)融合蛋白的抗肿瘤作用机制及疗效。方法采用三联径向加压C4柱制备LDM发色团AE,体外分子重建将其装入融合蛋白Fv-LDP中,Superdex 75层析获得Fv-LDP-AE。反相HPLC测定纯度或相对含量。流式细胞... 详细信息

目的探讨抗明胶酶单链抗体Fv与力达霉素(LDM)融合蛋白的抗肿瘤作用机制及疗效。方法采用三联径向加压C4柱制备LDM发色团AE,体外分子重建将其装入融合蛋白Fv-LDP中,Superdex 75层析获得Fv-LDP-AE。反相HPLC测定纯度或相对含量。流式细胞术测定DNA含量;采用SA-β-gal染色、Western blot和细胞伤口愈合实验分别检测药物对细胞衰老、蛋白表达和迁移的影响;通过动物模型评价药物疗效。结果 Fv-LDP-AE承袭了LDM诱导肿瘤细胞周期阻滞、凋亡和裂亡的作用特点,并显示出更强的诱导衰老和抗迁移作用。Fv-LDP-AE诱导凋亡和抑制迁移依次与caspases通路激活和MMP-2降调节有关。Fv-LDP-AE可抑制小鼠和裸鼠移植瘤生长,抑制率分别可达到86.6%和82.5%。结论 Fv-LDP-AE对小鼠和裸鼠移植瘤有效,可能与其对细胞周期阻滞、凋亡、裂亡和衰老的诱导以及迁移的抑制有关。

关键词：明胶酶类单链抗体肿瘤微环境力达霉素

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