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中国生物化学与分子生物学报 2022年第6期38卷 742-748页

作者：马孟杰彭小忠舒鹏程中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室医学灵长类研究中心神经科学中心北京100005 中国医学科学院医学实验动物研究所北京100021

为探究Ash2l(absent,small,or homeotic 2-like,Ash2l)对小鼠大脑皮质神经祖细胞(neural progenitor cells,NPCs)的增殖能力和细胞周期的影响。本研究利用NPCs标志物PAX6和TBR2,检测NPCs数量和分布的改变情况。结果显示,Ash2l敲除导致NPCs数量显著减少(P<0.05),且分布紊乱。对E16.5小鼠进行在体30 min EdU标记实验,检测NPCs增殖能力,Ash2l敲除导致30 min EdU几乎无法进入NPCs(P<0.001)。结果表示,NPCs增殖能力受到严重的影响。用细胞周期M期标志物pH3,检测大脑皮质中处于M期的NPCs分布情况,同时提取了E16.5小鼠大脑皮质蛋白质,检测细胞周期蛋白A的表达量。Ash2l敲除的NPCs的M期细胞核分布紊乱,G_(2)期标志蛋白质细胞周期蛋白A表达量减少。利用EdU和BrdU双标记法,计算NPCs的S期长度。Ash2l敲除后的NPCs的S期长度缩短(P<0.05)。因此,Ash2l调控NPCs细胞周期进程,进而影响NPCs的增殖能力,敲除小鼠大脑皮质发育异常。本研究强调了表观遗传调控对胚胎期神经系统发育的重要作用,并对表型进行了深入探索。

关键词： Ash2l 神经祖细胞细胞周期

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基于3D U-Net实现人体耳软骨MRI图像的解剖结构分割

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中国生物医学工程学报 2021年第5期40卷 531-539页

作者：孙若凡张唯唯中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室北京100005

自体肋软骨雕刻法是目前治疗先天性小儿畸形的临床标准疗法,而耳软骨组织工程和3D生物打印是有前景的治疗方案。可是,这些治疗方案的核心—(复合物)支架构造缺乏基于医学图像的耳软骨自动分割方法。基于3D U-Net提出改进的网络模型,能... 详细信息

自体肋软骨雕刻法是目前治疗先天性小儿畸形的临床标准疗法,而耳软骨组织工程和3D生物打印是有前景的治疗方案。可是,这些治疗方案的核心—(复合物)支架构造缺乏基于医学图像的耳软骨自动分割方法。基于3D U-Net提出改进的网络模型,能够实现MRI图像的人体耳软骨解剖结构的自动分割。该网络模型结合残差结构和多尺度融合等设计,在减少网络参数量的同时实现12个耳软骨解剖结构的精确分割。首先,使用超短回波时间(UTE)序列采集40名志愿者单侧外耳的MRI图像;然后,对所采集的图像进行预处理、耳软骨和多解剖结构手动标注;接下来,划分数据集训练改进的3D U-Net模型,其中32例数据作为训练集、4例为验证集、4例为测试集;最后,使用三维全连接条件随机场对网络输出结果进行后处理。模型经过10折交叉验证后,耳软骨12个解剖结构的自动分割结果的平均Dice相似度系数(DSC)和平均95%豪斯多夫距离(HD95)分别为0.818和1.917,相比于使用基础的3D U-Net模型,DSC指标分别提高6.0%,HD95指标降低了3.186,其中耳软骨关键结构耳轮和对耳轮的DSC指标达到了0.907和0.901。实验结果表明,所提出的深度学习方法与专家手动标注两者之间的结果非常接近。在临床应用中,根据患者健侧UTE核磁图像,本研究提出的方法既可以为现有自体肋软骨雕刻法快速、自动生成三维个性化雕刻模板,也可以为组织工程或者3D生物打印技术构建耳软骨复合物支架提供高质量的可打印模型。

关键词：耳软骨超短回波时间 3D U-Net 自动分割

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K562细胞中N-乙酰基转移酶10的RNA结合图谱分析

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基础医学与临床 2023年第5期43卷 739-744页

作者：李高原王妍然王芳余佳中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的对N-乙酰基转移酶10(NAT10)在人慢性髓原白血病细胞系K562中的RNA结合图谱进行描绘。方法利用紫外交联免疫沉淀技术(eCLIP)捕获NAT10在K562细胞中结合的转录本集合,对其进行高通量测序,并对数据进行生物信息学分析。通过peak-callin... 详细信息

目的对N-乙酰基转移酶10(NAT10)在人慢性髓原白血病细胞系K562中的RNA结合图谱进行描绘。方法利用紫外交联免疫沉淀技术(eCLIP)捕获NAT10在K562细胞中结合的转录本集合,对其进行高通量测序,并对数据进行生物信息学分析。通过peak-calling分析和对peaks进行注释,鉴定NAT10结合位点。并对所结合基因的类型和结合区域进行分析。进一步通过基因功能富集分析,探索其结合的RNA的功能。结果NAT10主要结合于蛋白质编码基因的转录本,并在3′非翻译区域(3′UTR)富集,预测显示其结合的转录本与DNA损伤修复等功能相关。结论NAT10可能通过与DNA损伤修复相关信使RNA(mRNA)的3′UTR区域结合,实现基因表达调控作用。

关键词： N-乙酰基转移酶10 K562细胞紫外交联免疫沉淀测序技术(eCLIP-seq)

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基于自转运蛋白Ag43的HPV16L1蛋白的细菌表面展示

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中华微生物学和免疫学杂志 2022年第3期42卷 178-184页

作者：蔡锟王哲黄丕英韦良婉王星媛许雪梅储引娣朱沛沛范恩国中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院病原学系医学分子生物学国家重点实验室北京100005 中国人民解放军总医院第二医学中心神经内科二病区国家老年疾病临床医学研究中心北京100036

目的:通过构建含有不同大小乘客结构域的Ag43表面展示载体,观察其将外源蛋白HPV16L1展示在细菌细胞表面的效率。方法:(1)利用基因工程手段将不同长度的Ag43基因序列连接到pET22b载体,获得4种Ag43表面展示载体:Ag43/138、Ag43/551、Ag43/... 详细信息

目的:通过构建含有不同大小乘客结构域的Ag43表面展示载体,观察其将外源蛋白HPV16L1展示在细菌细胞表面的效率。方法:(1)利用基因工程手段将不同长度的Ag43基因序列连接到pET22b载体,获得4种Ag43表面展示载体:Ag43/138、Ag43/551、Ag43/552、Ag43/700;(2)克隆HPV16L1编码基因序列,利用基因工程手段将其分别连接到上述4种Ag43表面展示载体,获得4种重组蛋白表达载体;(3)HPV16L1-Ag43融合蛋白表达及SDS-PAGE分析;(4)利用胰蛋白酶消化验证HPV16L1蛋白在大肠埃希菌的表面展示。结果:琼脂糖凝胶电泳结果显示PCR扩增获得的Ag43和HPV16L1条带与预期大小一致,表面展示载体和重组蛋白表达载体的基因序列均通过基因测序验证无误。经IPTG诱导后,构建的4种Ag43表面展示载体均能表达HPV16L1蛋白。胰蛋白酶消化后,4种重组蛋白条带均减弱,且Ag43/700-HPV16L1条带减弱最明显。结论:成功构建了基于自转运蛋白Ag43的细菌表面展示载体,HPV16L1蛋白可通过构建的4种Ag43表面展示载体表达并展示在大肠埃希菌表面,且仅保留α-螺旋和β-桶状结构域部分的Ag43表达载体即Ag43/700的表面展示效果最优。

关键词：自转运蛋白细菌表面展示 HPV16L1 Ag43

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PABPC1对人单核白血病细胞系THP-1翻译活性的影响

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基础医学与临床 2023年第5期43卷 751-754页

作者：翟雪莹王芳余佳中国医学科学院基础医学研究所、北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的研究细胞质多聚腺苷酸结合蛋白-1(PABPC1)对人单核细胞白血病细胞系THP-1翻译活性的影响。方法在THP-1细胞中转染shPABPC1,Western blot验证敲低效率,多聚核糖体分析技术检测细胞翻译活性变化。结果转染后THP-1细胞中PABPC1表达被抑... 详细信息

目的研究细胞质多聚腺苷酸结合蛋白-1(PABPC1)对人单核细胞白血病细胞系THP-1翻译活性的影响。方法在THP-1细胞中转染shPABPC1,Western blot验证敲低效率,多聚核糖体分析技术检测细胞翻译活性变化。结果转染后THP-1细胞中PABPC1表达被抑制(P<0.001);与对照组相比,敲低PABPC1组的翻译活性减弱。结论敲低PABPC1可抑制THP-1细胞翻译活性,PABPC1可能成为治疗急性髓系白血病(AML)的潜在靶点。

关键词：急性髓系白血病(AML) 细胞质多聚腺苷酸(A)结合蛋白-1 翻译

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基因Cdca2敲除对小鼠精子发生和生育力无明显影响

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基础医学与临床 2023年第5期43卷 717-723页

作者：柳俊邹定峰缪时英宋伟李凯中国医学科学院基础医学研究所、北京协和医学院基础学院、生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的探究睾丸高表达细胞分裂周期相关蛋白2基因(Cdca2)在小鼠精子发生和生育力中的生理功能。方法通过Q-PCR和Western blot检测Cdca2在小鼠不同组织部位的表达情况;利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和Cre-loxP介导的重组系统构建Cdca2组织... 详细信息

目的探究睾丸高表达细胞分裂周期相关蛋白2基因(Cdca2)在小鼠精子发生和生育力中的生理功能。方法通过Q-PCR和Western blot检测Cdca2在小鼠不同组织部位的表达情况;利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和Cre-loxP介导的重组系统构建Cdca2组织特异性敲除的小鼠品系;通过苏木精-伊红(HE)染色和形态学分析了解小鼠CDCA2缺失对精子发生的各个阶段生精细胞形态的影响;通过精子全自动检测分析系统检测小鼠CDCA2缺失对精子活率及运动参数的影响;通过生育力测试实验检测CDCA2缺失对雄性小鼠生育能力的影响。结果Cdca2是一个睾丸高表达的基因;利用CRISPR/Cas9技术和生殖系统特异性Cre的工具鼠,成功获得了Cdca2生殖细胞特异性敲除的小鼠;小鼠CDCA2缺失对精子发生中各阶段生精细胞、精子运动参数及雄性生育能力的影响改变无统计学意义。结论基因Cdca2对于小鼠精子发生和雄性生育力的维持可能是非必需的。

关键词：细胞分裂周期相关蛋白2(CDCA2) RNA结合蛋白生殖细胞生育力精子发生

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敲除基因Pabpc6对雄性小鼠精子发生的影响

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基础医学与临床 2023年第4期43卷 560-567页

作者：汤洁琳柳俊邹定峰缪时英宋伟李凯中国医学科学院基础医学研究所、北京协和医学院基础学院、生物化学与分子生物学系、医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的探究小鼠细胞质多聚腺苷酸结合蛋白-6(PABPC6)在雄性小鼠精子发生中的作用。方法利用CRISPR/Cas9靶向敲除C57BL/6J小鼠基因Pabpc6,通过PCR鉴定Pabpc6的敲除情况。通过交配繁殖得到Pabpc6^(+/+)、Pabpc6^(+/-)、Pabpc6^(-/-)3种不同... 详细信息

目的探究小鼠细胞质多聚腺苷酸结合蛋白-6(PABPC6)在雄性小鼠精子发生中的作用。方法利用CRISPR/Cas9靶向敲除C57BL/6J小鼠基因Pabpc6,通过PCR鉴定Pabpc6的敲除情况。通过交配繁殖得到Pabpc6^(+/+)、Pabpc6^(+/-)、Pabpc6^(-/-)3种不同基因型的小鼠,进行睾丸称重、形态学观察和精子计数。RT-qPCR和Western blot检测不同组织中Pabpc6在mRNA和蛋白的表达水平;通过免疫荧光和苏木精-伊红染色观察该基因的定位以及睾丸曲细精管内部形态学变化。结果成功鉴定出敲除Pabpc6的小鼠;Pabpc6在睾丸组织中高表达(P<0.001)。免疫荧光显示该基因主要表达于精母细胞和早期精子阶段,基因敲除小鼠与野生型小鼠相比在睾丸外形、精子形态、精子数量和曲细精管内部形态上没有明显差异。结论Pabpc6在小鼠睾丸组织中高表达,敲除该基因后对雄性小鼠的精子发生无明显影响,说明该基因所编码的蛋白对于小鼠精子发生过程可能是非必需的。

关键词：精子发生 PABPC6 雄性生殖

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CLOCK氧化还原修饰介导内源性H_(2)O_(2)对小鼠细胞呼吸的调节作用

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基础医学与临床 2023年第5期43卷 745-750页

作者：常薇薇李勋凯张祝琴陈厚早刘德培中国医学科学院基础医学研究所、北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室生物化学与分子生物学系北京100005

目的探究生物钟核心转录因子昼夜节律运动输出周期蛋白(CLOCK)介导内源性过氧化氢(H_(2)O_(2))对细胞呼吸的调节作用和机制。方法利用Seahorse细胞能量代谢分析仪检测Clock^(C195S)小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)和成体成纤维细胞(MAFs)细胞... 详细信息

目的探究生物钟核心转录因子昼夜节律运动输出周期蛋白(CLOCK)介导内源性过氧化氢(H_(2)O_(2))对细胞呼吸的调节作用和机制。方法利用Seahorse细胞能量代谢分析仪检测Clock^(C195S)小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)和成体成纤维细胞(MAFs)细胞氧耗能力和糖酵解能力;通过q-PCR检测细胞呼吸关键代谢酶基因表达水平;MEFs进行抗氧化剂Trolox处理后,用Amplex■ Red试剂盒检测内源性H_(2)O_(2)的含量,并通过生物素碘乙酰胺(BIAM)探针标记检测CLOCK蛋白氧化还原修饰的改变,进一步检测处理后的细胞氧耗能力和细胞呼吸关键代谢酶基因表达水平。结果Clock^(C195S)细胞氧耗能力和糖酵解能力下降,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)合成关键酶烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT2)表达降低(P<0.05),NAD含量下降;Trolox处理导致细胞内源性H_(2)O_(2)含量降低,Clock wt MEFs氧耗能力降低而Clock^(C195S) MEFs变化无统计学意义。结论CLOCK蛋白可以通过195位点半胱氨酸氧化还原修饰介导内源性H_(2)O_(2)对细胞呼吸的调节作用。

关键词：细胞呼吸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)合成 CLOCK氧化还原修饰

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烯醇化酶1通过影响mRNA定位调节人胚胎干细胞自我更新能力

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基础医学与临床 2023年第6期43卷 867-874页

作者：赫佳音杨嘉宾陈仲扬马艳妮余佳中国医学科学院基础医学研究所、北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系、医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的探究烯醇化酶1(ENO1)的表达对维持人胚胎干细胞(hESCs)自我更新能力的影响,并揭示其机制。方法预测与ENO1结合的RNA和蛋白质,并进行GO富集分析。在hESCs中通过shRNA抑制ENO1内源表达,集落形成实验及碱性磷酸酶染色(AP)检测hESCs的... 详细信息

目的探究烯醇化酶1(ENO1)的表达对维持人胚胎干细胞(hESCs)自我更新能力的影响,并揭示其机制。方法预测与ENO1结合的RNA和蛋白质,并进行GO富集分析。在hESCs中通过shRNA抑制ENO1内源表达,集落形成实验及碱性磷酸酶染色(AP)检测hESCs的集落形成能力,荧光定量PCR检测hESCs的多能性及分化标志基因的表达变化,RNA荧光原位杂交技术检测带有polyA尾的RNA的定位变化。结果抑制ENO1的内源表达后,hESCs的集落形成能力得到了显著抑制(P<0.05),同时分化标志基因表达水平升高(P<0.001),带polyA尾的RNA的定位由分散在细胞质中变为集中在核内(P<0.001)。结论ENO1通过影响mRNA在细胞内的定位调控hESCs自我更新能力。

关键词：人胚胎干细胞烯醇化酶1 RNA结合蛋白多能性 mRNA定位

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AHR抑制剂CH223191提高辐照小鼠骨髓移植效果

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基础医学与临床 2023年第2期43卷 233-240页

作者：庞瑞洋周力吕家迪中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院免疫学系医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的探究骨髓移植过程中辐射诱导的旁观者效应对供体骨髓细胞的影响以及芳香烃受体(AHR)抑制剂CH223191对供体骨髓细胞的保护作用。方法将小鼠分为9 Gy辐照组和12 Gy辐照组,不同辐照剂量辐射后移植相同数量供体骨髓细胞,流式细胞术检测... 详细信息

目的探究骨髓移植过程中辐射诱导的旁观者效应对供体骨髓细胞的影响以及芳香烃受体(AHR)抑制剂CH223191对供体骨髓细胞的保护作用。方法将小鼠分为9 Gy辐照组和12 Gy辐照组,不同辐照剂量辐射后移植相同数量供体骨髓细胞,流式细胞术检测外周血细胞总数、外周血供体细胞嵌合率及数量;ELISA检测未辐照小鼠和辐照小鼠血清活性氧(ROS)水平;将供体骨髓细胞分为对照组、9 Gy辐照组和12 Gy辐照组体外培养,分别加入未辐照小鼠血清、9 Gy和12 Gy辐照小鼠血清处理,ATP活力测定法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,RT-qPCR检测Cyp1a1与Cyp1b1的mRNA表达;将辐照血清处理后的骨髓细胞分为CH223191治疗组与对照组,加入CH223191处理后,比较细胞活力、细胞凋亡、细胞内ROS水平,RT-qPCR检测Cyp1a1与Cyp1b1的mRNA表达;将骨髓移植小鼠分为CH223191治疗组和对照组,治疗组腹腔注射CH223191,记录小鼠体质量、外周血供体细胞嵌合率及数量、骨髓内供体细胞嵌合率及数量。结果小鼠经9 Gy或12 Gy辐照后,12 Gy辐照组外周血细胞总数少于9Gy辐照组(P<0.05),而骨髓移植后外周血供体细胞嵌合率无明显差异,并且12 Gy辐照组外周血供体细胞数明显少于9Gy辐照组(P<0.05);小鼠经辐照后,血清内ROS水平上升(P<0.01);经辐照小鼠血清处理的供体骨髓细胞活力降低,凋亡比例升高(均P<0.01),辐照小鼠血清处理的供体骨髓细胞中Cyp1a1与Cyp1b1 mRNA均升高(P<0.05);辐照小鼠血清处理的供体骨髓细胞加入CH223191后,Cyp1a1与Cyp1b1 mRNA水平降低(P<0.05),细胞活力升高,细胞内ROS水平降低,细胞凋亡比例减少(均P<0.01);骨髓移植后,CH223191治疗组小鼠体质量相对于对照组减轻较少,外周血供体细胞嵌合率与细胞数高于对照组,骨髓内供体细胞比例与数量均高于对照组(均P<0.05)。结论CH223191通过抑制AHR激活,减少辐射诱导的旁观者效应对移植骨髓细胞的损伤,提升小鼠骨髓移植效果。

关键词：骨髓移植辐射诱导的旁观者效应芳香烃受体活性氧

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