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中国比较医学杂志 2008年第5期18卷 41-44页

作者：杨帆刘先菊林树柱秦川张连峰中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室北京100021

目的制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗麻雀IgY抗体,为禽类血清学检测体系的建立提供技术储备。方法硫酸铵盐析法粗提麻雀血清IgY,进一步在SDS-PAGE上分离后,切下带有目的条带的凝胶作为免疫原,免疫实验兔制备抗血清,Protein-A柱亲和... 详细信息

目的制备辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗麻雀IgY抗体,为禽类血清学检测体系的建立提供技术储备。方法硫酸铵盐析法粗提麻雀血清IgY,进一步在SDS-PAGE上分离后,切下带有目的条带的凝胶作为免疫原,免疫实验兔制备抗血清,Protein-A柱亲和纯化兔抗IgY血清IgG,,使用改良过碘酸钠法制备酶结合物。ELISA检测酶标抗体的工作浓度,western blotting检测酶标抗体的特异性。结果硫酸铵盐析法粗提IgY,可去除部分杂蛋白,SDS-PAGE上分离后切下带有目的条带的凝胶,可以得到足够纯度的抗原,将带有IgY的凝胶作为抗原免疫后获得的抗血清经Protein-A纯化后,二抗在SDS-PAGE上鉴定,纯度达到99%以上。改良的过碘酸钠法标记获得的抗体浓度为1.008 mg/mL,ELISA检测酶标抗体效价为1∶1000。Western blotting鉴定抗体具有特异性。结论获得了优质可靠的兔抗麻雀IgY酶标抗体。

关键词：麻雀抗IgY HRP

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荧光标记技术在肿瘤模型研究中的应用

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中国比较医学杂志 2008年第5期18卷 59-61,I0007,I0008页

作者：高苒刘学丽冯娟张连峰中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室北京100021

目的利用绿色荧光小鼠和红色荧光蛋白标记肿瘤细胞,建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,并建立活体荧光成像和荧光显微镜成像在整体和细胞水平直接观察肿瘤的技术。方法将小鼠B16黑色素瘤细胞接种到绿色荧光蛋白转基因小鼠皮下,建立GFP小鼠肿... 详细信息

目的利用绿色荧光小鼠和红色荧光蛋白标记肿瘤细胞,建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,并建立活体荧光成像和荧光显微镜成像在整体和细胞水平直接观察肿瘤的技术。方法将小鼠B16黑色素瘤细胞接种到绿色荧光蛋白转基因小鼠皮下,建立GFP小鼠肿瘤模型。以红色荧光蛋白作为标记基因导入小鼠黑色素瘤细胞B16细胞,建立稳定表达红色荧光蛋白的细胞株。将表达红色荧光蛋白B16细胞接种到绿色荧光转基因小鼠皮下,建立双荧光小鼠肿瘤模型。用荧光显微镜和活体荧光成像系统检测小鼠肿瘤的发生发展。结果分别建立了GFP小鼠肿瘤模型和双色荧光小鼠肿瘤模型。利用活体荧光影像仪可以观察双色荧光小鼠模型中受体绿色荧光组织和红色荧光移植肿瘤相互融合。利用荧光显微镜,可以观察到肿瘤内绿色荧光标记的来源于受体小鼠的血管和免疫细胞。经香菇多糖刺激的GFP小鼠肿瘤模型的移植瘤组织中,来源于受体小鼠绿色荧光标记的免疫细胞明显多于经生理盐水刺激的对照小鼠。结论利用绿色荧光小鼠和红色荧光RFP标记肿瘤细胞建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,采用活体荧光成像仪和荧光显微镜可在整体和细胞水平直接观察肿瘤的生长以及肿瘤与宿主的相互作用。

关键词：绿色荧光蛋白红色荧光蛋白肿瘤模型,动物荧光显微镜

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动物与新发传染病

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实验动物与比较医学 2008年第3期28卷 133-137页

作者：秦川中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室北京100021

从最近几年发生的SARS、高致病性禽流感等新发传染病的流行病学调查结果来看,野生动物与新发传染病密切相关。许多因素可以导致人兽共患病或新发人兽共患病的发生,如环境改变、人类和动物的密切接触、病原因子的变异、农业行为方式改变... 详细信息

从最近几年发生的SARS、高致病性禽流感等新发传染病的流行病学调查结果来看,野生动物与新发传染病密切相关。许多因素可以导致人兽共患病或新发人兽共患病的发生,如环境改变、人类和动物的密切接触、病原因子的变异、农业行为方式改变等,社会和文化因素同样起到一定作用。人类与其他动物的和平共处,维护生态平衡,是控制新发传染病的重要方面。

关键词：动物人兽共患病新发传染病

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帕金森病α-Synuclein转基因小鼠模型的建立

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中国比较医学杂志 2008年第5期18卷 28-31,36,I0005页

作者：高宁全雄志陈炜李万波刘鹏冯娟张连峰秦川中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室北京100021 中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心遗传中心北京100021

目的建立人α-Synuclein野生型及两个突变型A53T和A30P基因的转基因动物模型,研究α-Synuclein在帕金森病发病过程中的作用。方法构建人α-Synuclein表达载体,利用显微注射法制备人α-Synuclein基因的转基因小鼠。通过PCR方法鉴定转基... 详细信息

目的建立人α-Synuclein野生型及两个突变型A53T和A30P基因的转基因动物模型,研究α-Synuclein在帕金森病发病过程中的作用。方法构建人α-Synuclein表达载体,利用显微注射法制备人α-Synuclein基因的转基因小鼠。通过PCR方法鉴定转基因首建鼠及其子代基因型。通过RT-PCR和Western blotting方法鉴定转基因小鼠脑组织中人α-Synuclein mRNA和蛋白表达情况。采用免疫组化鉴定人α-Synuclein在小鼠脑组织中的表达情况。通过Rotatingrod实验评价转基因小鼠的行为改变情况。结果得到表达水平不同的野生型人α-Synuclein转基因小鼠2个品系。得到表达水平不同的A53T突变型α-Synuclein转基因小鼠2个品系。得到表达水平不同的A30P突变型α-Synuclein转基因小鼠3个品系。免疫组化显示,转基因小鼠大脑海马、新皮层、纹状体区出现人α-Synuclein阳性标记的细胞。Rotating rod实验结果显示转基因小鼠表现出明显的进行性运动能力障碍。结论建立了转人α-Synuclein基因的帕金森病小鼠模型。

关键词：转基因模型 α-Synuclein 帕金森病突变

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活体荧光技术在肿瘤研究中的应用

活体荧光技术在肿瘤研究中的应用

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亚洲实验动物学会联合会（AFLAS）第三次会议暨中国实验动物学会（CALAS）第八届学术年会

作者：高苒刘学丽冯娟董伟全雄志张连峰中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室

目的建立绿色荧光(GFP)转基因小鼠模型,用GFP和DsRed标记肿瘤细胞,建立系统的活体光学成像技术所需标记动物和标记细胞。并且利用GFP小鼠和DsRed标记的肿瘤细胞,建立双荧光小鼠肿瘤模型,并建立活体荧光成像和荧光显微镜成像在整体和细... 详细信息

目的建立绿色荧光(GFP)转基因小鼠模型,用GFP和DsRed标记肿瘤细胞,建立系统的活体光学成像技术所需标记动物和标记细胞。并且利用GFP小鼠和DsRed标记的肿瘤细胞,建立双荧光小鼠肿瘤模型,并建立活体荧光成像和荧光显微镜成像在整体和细胞水平直接观察肿瘤的技术。方法把EGFP和DsRed基因插入chickenβ-actin强启动子下游构建转基因载体,并且用上述载体标记肿瘤细胞;利用显微注射转基因技术建立绿色荧光转基因C57BL/6J小鼠;将DsRed标记的B16小鼠黑色素瘤细胞接种到绿色荧光转基因小鼠皮下,建立双荧光小鼠肿瘤模型;用活体荧光成像仪和荧光纤维镜分别在整体和细胞水平观察肿瘤的生长。结果建立了绿色荧光转基因小鼠模型和荧光素酶转基因小鼠模型,标记了12种人和小鼠的肿瘤细胞。利用DsRed标记的B16小鼠黑色素瘤细胞和GFP转基因小鼠建立了双荧光小鼠肿瘤模型。利用活体荧光影像仪可以动态监测肿瘤的生长,可以观察到双色荧光小鼠模型中受体绿色荧光组织和红色荧光移植肿瘤相互融合。利用荧光显微镜,可以观察到肿瘤内绿色荧光标记的来源于受体小鼠的血管和免疫细胞。经香菇多糖刺激的GFP小鼠肿瘤模型的移植瘤组织中,来源于受体小鼠绿色荧光标记的血管明显少于经生理盐水刺激的对照组,而免疫细胞明显多于对照小鼠。结论成功建立了绿色荧光转基因小鼠,将成为活体荧光影像系统的重要实验动物模型;利用绿色荧光转基因小鼠和红色荧光DsRed标记的肿瘤细胞建立的双荧光小鼠肿瘤模型,采用活体荧光成像仪和荧光显微镜可在整体和细胞水平直接观察肿瘤的生长以及肿瘤与宿主的相互作用;而且香菇多糖治疗效果的观察也证实了活体光学成像技术的直观性和实用性。

关键词：活体荧光转基因小鼠肿瘤模型

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肝素结合类表皮生长因子参与DCM模型小鼠心脏间质纤维化

肝素结合类表皮生长因子参与DCM模型小鼠心脏间质纤维化

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亚洲实验动物学会联合会（AFLAS）第三次会议暨中国实验动物学会（CALAS）第八届学术年会

作者：冯娟彭健豪张连峰中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室

目的探讨肝素结合类表皮生长因子对DCM模型小鼠心脏间质纤维化的作用。方法 Western blotting检测野生型和DCM模型小鼠心脏中HB-EGF的表达,H&E和Masson染色检测DCM模型小鼠心脏组织学,Realtime PCR检测DCM模型小鼠心脏Ⅰ型胶原和Ⅲ... 详细信息

目的探讨肝素结合类表皮生长因子对DCM模型小鼠心脏间质纤维化的作用。方法 Western blotting检测野生型和DCM模型小鼠心脏中HB-EGF的表达,H&E和Masson染色检测DCM模型小鼠心脏组织学,Realtime PCR检测DCM模型小鼠心脏Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达。显微注射法建立HB-EGF转基因C57BL/6J小鼠,PCR鉴定基因表型,Western blotting检测表达水平。病理检测HB-EGF转基因小鼠心脏的组织学,Realtime PCR检测HB-EGF转基因小鼠心脏Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达。原代培养C57BL/6J小鼠心肌成纤维细胞,重组人HB-EGF(10ng/ml)刺激心肌成纤维细胞后,BrdU免疫组织化学法检测心肌成纤维细胞的增殖,Realtime PCR检测Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达,Western blot检测丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs),ERK1/2和JNK信号通路的变化。结果野生型小鼠心脏HB-EGF的表达随月龄增加而逐渐降低,而DCM转基因小鼠心脏中HB-EGF随月龄增加病情加重而增加,并伴随有间质纤维化以及Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达增加(1.7倍和1.6倍)。用HB-EGF转基因小鼠研究HB-EGF的功能,发现HB-EGF可增加心脏间质纤维化,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达(1.8倍)。用重组人HB-EGF刺激原代培养心肌成纤维细,30 min即引起Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达显著增加,24h引起心肌成纤维细胞明显增殖,10 min即可引起ERK1/2,JNK磷酸化水平增加。结论结果证实HB-EGF参与DCM模型小鼠心脏间质纤维化。HB-EGF促进Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达,可能通过MAPKs信号通路发挥上述作用。

关键词：肝素结合类表皮生长因子转基因模型心肌细胞成纤维细胞丝裂原活化蛋白激酶

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YCZX01对cTnTR141W转基因扩张型心肌病模型的治疗作用及机理研究

YCZX01对cTnTR141W转基因扩张型心肌病模型的治疗作用及机理研究

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亚洲实验动物学会联合会（AFLAS）第三次会议暨中国实验动物学会（CALAS）第八届学术年会

作者：赵海平吕丹冯娟张丽张伟董伟秦川张连峰中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室

目的观察YCZX01对遗传性扩张型心肌病模型的治疗作用,并研究其可能的药理机制。方法繁殖cTnT转基因扩张型心肌病小鼠,PCR法鉴定基因型,待小鼠到1.5月龄后进行心脏超声检测,根据体重、心功能将其分成三组:阴性鼠作为对照组,阳性鼠分为模... 详细信息

目的观察YCZX01对遗传性扩张型心肌病模型的治疗作用,并研究其可能的药理机制。方法繁殖cTnT转基因扩张型心肌病小鼠,PCR法鉴定基因型,待小鼠到1.5月龄后进行心脏超声检测,根据体重、心功能将其分成三组:阴性鼠作为对照组,阳性鼠分为模型组及YCZX01给药组（n=12）。将YCZX01（75mg/kg/d）放入动物饮水中,连续给药7个月。cTnT转基因小鼠在实验过程中有猝死,从给药开始记录各组的动物死亡数,七个月后用spss10.0统计软件进行生存率分析。每个月进行一次心脏超声检测,对左心室长轴M超结果进行分析,比较各组动物的心脏构型及心功能。给药7个月后,采用HE染色和Masson染色,光镜观察心脏的显微结构。透射电镜观察心肌的超微结构。RT-PCR法检测心脏缝隙连接蛋白Cx40、Cx43,钙粘蛋白N-cadherin、E-cadherin、P-cadherin,整合素Itga8、Itgb1bp3,成纤维生长因子FGF2以及ASK1的表达水平的变化。结果连续7个月的超声检测显示,cTnT转基因小鼠出现进行性的左心室扩张及收缩功能障碍。并有猝死发生;drug1减轻了扩心病小鼠的左心室扩张,改善了心功能,并降低了死亡率。心脏HE及Masson染色显示,cTnT转基因小鼠有心肌细胞的不均匀肥大及间质胶原的增生,透射电镜结果显示,cTnT转基因小鼠发生线粒体肿胀、嵴断裂,肌浆网扩张,闰盘连接破坏;YCZX01改善了心脏的结构。cTnT转基因小鼠心脏缝隙连接蛋白Cx40的表达降低,钙粘蛋白E-cadherin、P-cadherin的表达增加,整合素Itga8、Itgb1bp3的表达增加,成纤维生长因子FGF2及ASK1的表达增加,Cx43、N-cadherin的表达没有显著的变化。Drug1提高了Cx40的表达,降低了E-cadherin、P-cadherin、Itga8、Itgb1bp3的表达,降低了FGF2、ASK1的表达。结论 YCZX01对cTnT转基因扩张型心肌病小鼠有治疗作用,可能部分通过抑制FGF2、ASK1的表达发生作用。

关键词： YCZX01 遗传性扩张型心肌病治疗

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cTnTR92Q转基因小鼠肥厚型心肌病模型的建立

cTnTR92Q转基因小鼠肥厚型心肌病模型的建立

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亚洲实验动物学会联合会（AFLAS）第三次会议暨中国实验动物学会（CALAS）第八届学术年会

作者：董伟冯娟祝梅香全雄志张伟秦川张连峰中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室

目的建立cTnT肥厚型心肌病的转基因小鼠模型。方法把cTnT基因插入α-MHC启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立cTnT转基因C57BL/6J小鼠。PCR鉴定cTnT转基因小鼠的基因表型,RT-PCR检测基因表达,光学显微镜和超声检测cTnT转... 详细信息

目的建立cTnT肥厚型心肌病的转基因小鼠模型。方法把cTnT基因插入α-MHC启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立cTnT转基因C57BL/6J小鼠。PCR鉴定cTnT转基因小鼠的基因表型,RT-PCR检测基因表达,光学显微镜和超声检测cTnT转基因小鼠心脏的病理改变。结果建立了3个不同表达水平的cTnT转基因小鼠品系。转入的cTnT基因在心脏组织的表达水平高于内源性cTnT。组织学分析显示cTnT转基因小鼠心脏变大,心室壁肥厚,心腔变小,心肌细胞排列紊乱,心肌间质纤维增多。超声检查显示心室壁变厚,收缩期容积和舒张期容积显著缩小,射血分数、短轴缩短率明显增加。结论 cTnT转基因小鼠心脏变大,室壁变厚,心腔变小,心肌细胞排列紊乱,间质纤维化以及心肌舒张功能失调,说明成功建立了cTnT转基因小鼠肥厚型心肌病模型,为研究肥厚型心肌病发病机制和药物研发提供了有价值的动物模型。

关键词：心肌肌钙蛋白T 肥厚型心肌病转基因模型基因突变

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动物与新发传染病

动物与新发传染病

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中国科协第179次青年科学家论坛——传染病病原体变异和致病机制

作者：秦川中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室

野生动物源性传染性人兽共患病作为新发传染病已经成为威胁人类健康的重要因素。对人类健康造成了巨大的全球负担，其确切程度尚难统计。作者介绍了新发对传染病的种类，并对流行病学和新发传染病与野生动物的关系进行了详细的分析，同... 详细信息

野生动物源性传染性人兽共患病作为新发传染病已经成为威胁人类健康的重要因素。对人类健康造成了巨大的全球负担，其确切程度尚难统计。作者介绍了新发对传染病的种类，并对流行病学和新发传染病与野生动物的关系进行了详细的分析，同时，还对新发传染病的防治作了展望。

关键词：新发传染病流行病学野生动物

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Dkk3转基因模型

Dkk3转基因模型

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亚洲实验动物学会联合会（AFLAS）第三次会议暨中国实验动物学会（CALAS）第八届学术年会

作者：吕丹冯娟赵海平张丽张伟董伟秦川张连峰中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室

目的为在体内研究Dkk3对心脏功能的影响而建立心脏特异的Dkk3转基因小鼠。背景WNT家族WNT1、WNT3a、WNT8等成员对心脏发育具有重要的作用,Dkk3作为Wnt通路拮抗剂Dickkopf(Dkk)家族成员之一,目前发现其与肿瘤发生发展,细胞保护、凋亡等... 详细信息

目的为在体内研究Dkk3对心脏功能的影响而建立心脏特异的Dkk3转基因小鼠。背景WNT家族WNT1、WNT3a、WNT8等成员对心脏发育具有重要的作用,Dkk3作为Wnt通路拮抗剂Dickkopf(Dkk)家族成员之一,目前发现其与肿瘤发生发展,细胞保护、凋亡等病理进程关系密切,但对于Dkk3对心脏及心血管系统的生物学功能所知甚少,本研究特建立心脏特异的Dkk3转基因小鼠,为研究Dkk3对心脏功能的影响提供病理模型工具。方法利用基因克隆技术,构建α-MHC-m-Dkk3表达载体,经酶切及序列测序鉴定后,通过显微注射将制备好的片段注入受精卵,将注射后存活的受精卵移入ICR假孕母鼠,产下的仔鼠经聚合酶链反应(PCR)筛选出整合有外源目的基因的阳性转基因鼠;对转基因小鼠心脏组织RNA行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及RNA印迹(Northern blot)分析,检测Dkk3在转基因小鼠心脏中的表达水平;对转基因小鼠心脏进行超声波分析,观察转基因小鼠心脏结构形态及功能的变化情况;利用光镜观察转基因小鼠心脏整体结构形态及心肌细胞、胶原纤维等显微结构的改变;利用光镜观察转基因小鼠左心房及左心室等部位心肌纤维、肌质网及线粒体等超微结构的改变。结果重组质粒α-MHC-m-Dkk3中α-MHC启动子及Dkk3 cDNA序列正确,假孕鼠所产仔鼠经PCR检测,检出15只首建鼠;依RT-PCR和Northern blot分析结果筛出高、中、低不同表达水平的3个首建鼠用于其他实验研究;超声波检查发现Dkk3于心脏中过表达可引起转基因小鼠左心室心壁变厚,左心室心腔缩小,心重指数增加,射血分数增加,心肌收缩力增强等改变;光镜观察转基因小鼠整体心脏HE、Masson染色,可见左心室心腔及心肌细胞间间隙变小,心肌细胞增大等改变;电镜观察转基因小鼠心脏超微结构发现其心肌纤维排列轻度紊乱,肌质网轻度扩张,线粒体有增生等改变。结论 Dkk3对心脏的正常生理功能具有重要的影响,α-MHC-m-Dkk3转基因小鼠系的建立为深入研究Dkk3对心脏功能的影响提供了病理模型。

关键词： Dkk3转基因心脏模型

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