目的探讨人诱导性多能干细胞(hiPSCs)在神经分化因子作用下生成的间充质干细胞(N-MSCs)对成体造血的影响。方法 1)与神经发育相关的MSCs的获得:hiPSCs在向前脑类器官培养过程中分离纯化出1个性质稳定的细胞系,命名为N-MSCs,通过形态学观察、流式检测和脂肪、成骨、软骨细胞分化实验对其进行鉴定。2)N-MSCs对成体造血的影响:人胚胎干细胞(hESCs)与鼠AGM-S3细胞共培养获得的CD34^+细胞分别与AGM-S3、N-MSCs(2×10~4个)共培养,单独悬浮培养为对照组(CD34^+组,1×10~4个),流式检测关于造血干/祖细胞(CD34^+CD45^+)和巨噬细胞(Mφ)表面标记的变化。3)N-MSCs对人脐带血来源的巨噬细胞(CB-Mφ)的影响:Mφ分别与脐带MSCs(UC-MSCs)、N-MSCs(2.5×10~5个)在transwell中共培养,Mφ单独培养为对照组(5×10~5个),再用IL-4对Mφ做刺激试验。用MGG染色、流式检测、qRT-PCR等方法分析Mφ形态学、M2型Mφ相关表面标记CD206和IL-10基因表达情况。结果 CD34^+组及其分别与AGM-S3、N-MSCs 2个共培养组培养10 d时收获的CD34^+CD45^+细胞数量(×10~3个)分别为:0.44±0.045 vs 0.63±0.170 vs 2.93±0.190(P<0.01);Mφ数量(×10~4个)分别为1.70±0.046 vs 1.49±0.057 vs 2.46±0.086(P<0.05)。Mφ与UC-MSCs共培养组及与N-MSCs共培养组CB-Mφ的CD206占比(%)为56.1±1.15 vs 60.0±1.76(P<0.05)、IL-10的相对表达量为6.8±0.748 vs 8.10±0.804(P<0.01)。结论 N-MSCs能促进成体造血和CB-Mφ向M2型Mφ的转变。
目的改进和提高HIV体外扩增检测的灵敏度,缩短检测时间。方法 1)用Broad Institute gRNA设计工具选取HIV的长末端重复序列(LTR)段设计20条gRNA(引导RNA)。2)用含荧光素酶报告的基因HIV(HIV-Luc)感染具有dCas9基因激活系统的Jurkat6465...
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目的改进和提高HIV体外扩增检测的灵敏度,缩短检测时间。方法 1)用Broad Institute gRNA设计工具选取HIV的长末端重复序列(LTR)段设计20条gRNA(引导RNA)。2)用含荧光素酶报告的基因HIV(HIV-Luc)感染具有dCas9基因激活系统的Jurkat6465细胞系构建Jurkat6465-Luc细胞系,并将20条gRNA置于Jurkat6465-Luc细胞系中筛选出激活能力筛选,选取效率最高的gRNA-L,gRNA-L与dCas9基因激活系统包装成慢病毒感染Jurkat细胞系,建立可对HIV序列高效扩增的工作细胞系Jurkat6465-L。3)用HIV-Luc感染Jurkat细胞系构建HIV潜伏测试细胞系,设定其潜伏频率为1∶500,并与工作细胞Jurkat6465-L置于细胞培养箱中共同培养7和14 d观察工作细胞对HIV潜伏细胞系的激活能力。4)使用HIV激活剂SAHA和dCas9基因激活系统分别作用于设定潜伏频率为1∶500的潜伏细胞,分别比较对潜伏HIV的激活能力。结果首先,测定荧光素酶活性筛选出的2条具有高效HIV扩增能力的gRNA-L和gRNA-O,二者及对照组促进Jurkat6465-Luc的扩增效力(荧光素酶活性强度)(n=3,pg/mL),6 d分别为:85 530±979.2 vs 96 925±2 759 vs 9 876±437(P<0.01);选取gRNA-L与dCas9基因激活系统构建的Jurkat6465L细胞系作为工作细胞,测试设定潜伏频率为1/500的HIV潜伏测试细胞,在培养7、14 d激活HIV潜伏测试细胞的频率测定分别1/864和1/755,比培养14 d用SAHA激活HIV潜伏模型细胞频率1/1 180更接近设定潜伏频率值1/500;用HIV潜伏细胞测试dCas9基因激活系统激活HIV潜伏细胞频率1/615与对照SAHA激活剂激活HIV潜伏细胞频率1/749相比,更接近于设定频数1/500。结论 dCas9基因激活系统改进HIV体外扩增,可以提高HIV体外扩增检测的效率和灵敏度。
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