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2009医学前沿论坛暨第十一届全国肿瘤药理与化疗学术会议

作者：刘娟妮高瀛岱王金宏邵晓枫范冬梅纪庆熊冬生杨纯正周圆中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室

目的:我们实验室已经构建并表达了抗CD3/抗Pgp(P-glycoprotein)微型双功能抗体(Diabody),体内外实验均证实对耐药肿瘤的生长具有良好的抑制作用。但是,动物实验发现抗CD3/抗Pgp Diabody治疗后,肿瘤于一周后复发,而且治疗用量相对较高。... 详细信息

目的:我们实验室已经构建并表达了抗CD3/抗Pgp(P-glycoprotein)微型双功能抗体(Diabody),体内外实验均证实对耐药肿瘤的生长具有良好的抑制作用。但是,动物实验发现抗CD3/抗Pgp Diabody治疗后,肿瘤于一周后复发,而且治疗用量相对较高。这可能与Diabody的两条链是非共价结合,容易解离有关。为了增强抗CD3/抗Pgp Diabody的抗瘤活性,我们向抗CD3/抗PgP Diabody引入二硫键,使两条链共价键交联,增强其稳定性。方法:用重叠PCR(Overlap PCR)和PCR方法,将抗CD3/抗PgP Diabody表达载体中抗CD3 VL(100)和VH(44)两个位点定点突变成半胱氨酸,转化大肠杆菌,进行原核表达。表达产物经抗Etag亲和层析柱分离纯化,通过还原性和非还原性SDS-PAGE电泳鉴定。应用流式细胞分析技术(FCM)检测与靶抗原的直接结合及竞争结合活性。将改造前后的两种抗体分别置37℃含0.2%人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)的PBS中孵育,取多个时间点比较两者与两种靶抗原的结合能力,检测其体外稳定性。用Promeg公司非放射性细胞毒实验试剂盒,比较改造前后的两种抗体对耐药细胞株K562/A02的杀伤作用。为了比较两种抗体在体内的抗瘤活性,我们用K562/A02细胞株建立了Pgp高表达的裸鼠耐药实体瘤模型,分别用两种Diabody(各设三个浓度梯度)联合人外周血T细胞(PBL)进行治疗,观察肿瘤大小。将两种Diabody用GE公司Cy5荧光标记试剂盒标记后,通过尾静脉注射给前述荷瘤裸鼠,在柯达小动物成像仪下观察抗体到达肿瘤部位及在肿瘤部位的停留时间。结果:表达载体经测序证实序列正确。改造后的Diabody能够在原核表达系统中进行可溶性表达,SDS-PAGE显示纯化后的蛋白二硫键正确配对。与改造前的Diabody相比,二硫键稳定的Diabody(ds-Diabody)抗原结合特异性没有改变,抗原结合和竞争活性均无下降,两者对耐药肿瘤细胞的杀伤活性无明显差异。改造前的Diabody在37℃PBS(0.2%HBS)中孵育1小时后活性即开始下降,24小时后活性完全丧失;而ds-Diabody孵育72小时后活性并无明显下降。两种Diabody对裸鼠耐药肿瘤的疗效呈剂量依赖性,相同剂量下ds-Diabody较改造前的Diabody疗效更好,当ds-Diabody剂量是Diabody剂量的一半时,两者疗效相当。Cy5标记的两种Diabody在注射后2小时即能靶向到肿瘤部位,但改造前Diabody较ds-Diabody荧光弱,而且ds-Diabody在注射后72小时肿瘤部位荧光仍较强,但改造前Diabody在注射后24小时肿瘤部位荧光不能被检测到。结论:我们成功构建了ds-Diabody原核表达载体,并且能够进行可溶性表达。与改造前的Diabody相比,Ds-Diabody在结合和杀伤活性没有明显下降的情况下,稳定性有显著提高;Ds-Diabody靶向性更好,在肿瘤部位的停留时间明显延长,并且在体内对耐药肿瘤的抑瘤活性增强,用量可以减半。因此,ds-Diabody较Diabody具有更好的治疗耐药肿瘤的临床应用前景。

关键词：双功能抗体 Pgp CD3 二硫键活性研究体内外

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慢性淋巴细胞白血病与第二肿瘤的研究进展

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临床血液学杂志 2009年第6期22卷 629-631页

作者：吴瞳李增军邱录贵中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室天津300020 江西省肿瘤医院南昌330029

近10余年随着核苷类似物和单克隆抗体的应用,慢性淋巴细胞白血病(CLL)的预后有了明显改善,5年的总生存率从54.2%提高到60.2%,10年总生存率从27.8%上升到34.8%。随着生存期的延长,各种并发症逐渐成为关注的焦点。CLL的免疫缺陷状态及化... 详细信息

近10余年随着核苷类似物和单克隆抗体的应用,慢性淋巴细胞白血病(CLL)的预后有了明显改善,5年的总生存率从54.2%提高到60.2%,10年总生存率从27.8%上升到34.8%。随着生存期的延长,各种并发症逐渐成为关注的焦点。CLL的免疫缺陷状态及化疗药和靶向治疗药物导致的免疫抑制使CLL患者的免疫监视功能减弱,成为并发多种第二肿瘤的高危人群。并发第二肿瘤的患者预后差,是CLL的主要死因之一。[第一段]

关键词：白血病淋巴细胞性慢性第二肿瘤

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慢性淋巴细胞白血病203例相关并发症研究

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白血病．淋巴瘤 2009年第4期18卷 210-212页

作者：吴瞳李增军王亚非邹德慧齐军元邱录贵中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室天津300020 江西省肿瘤医院 330029

目的探讨慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者并发症的临床特点。方法回顾性分析就诊于中国医学科学院血液病医院并获得有效随访的203例CLL患者并发症的临床表现及其预后价值。结果40例（19．7％）患者发生部位明确的感染，最常见感染部位为... 详细信息

目的探讨慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者并发症的临床特点。方法回顾性分析就诊于中国医学科学院血液病医院并获得有效随访的203例CLL患者并发症的临床表现及其预后价值。结果40例（19．7％）患者发生部位明确的感染，最常见感染部位为肺部（75．6％）。15例（7．4％）患者发生自身免疫性疾病（AID），最常见的AID为自身免疫性溶血性贫血（AIHA）（31．3％）。8例（3．94％）患者并发第二肿瘤，包括肺癌等多种肿瘤。3例（1．48％）患者发生类型转化，其中，2例向幼淋巴细胞白血病（PLL）转化，1例向弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）转化（Richter综合征）。预后分析显示并发感染、第二肿瘤或转化与不良预后有关，并发AID与预后无明显相关。结论CLL患者常见并发症包括感染、AID、第二肿瘤或转化，其中，以肺部感染及AIHA最为常见，未见明显高发的第二肿瘤类型。并发感染、并发第二肿瘤或转化为不良预后因素。

关键词：白血病淋巴细胞慢性并发症预后

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骨髓增生异常综合征RAEB、RAEB-T和老年急性髓系白血病的临床对照分析

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临床血液学杂志 2009年第4期22卷 339-341页

作者：张战强杨艺红张悦杨琳刘亮聂玲李璘王建祥郝玉书肖志坚中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室天津300020 北京解放军305医院血液科北京100017

目的：在WHO分类中，FAB分型中的骨髓增生异常综合征一难治性贫血伴原始细胞增多转化型（MDS—RAEBT）被划分为急性髓系白血病（AML），本文探讨该划分的合理性。方法：采用病例对照研究比较58例老年AML患者、88例骨髓增生异常综合征-... 详细信息

目的：在WHO分类中，FAB分型中的骨髓增生异常综合征一难治性贫血伴原始细胞增多转化型（MDS—RAEBT）被划分为急性髓系白血病（AML），本文探讨该划分的合理性。方法：采用病例对照研究比较58例老年AML患者、88例骨髓增生异常综合征-难治性贫血伴原始细胞增多（MDS-RAEB）10％～19％（骨髓原始细胞10％～19％）患者和37例MDS-RAEBT患者在临床和染色体核型及共同累及的染色体异常类型上的区别。结果：MDS-RAEBT和MDS-RAEB在病程、WBC、Hb、肝脾肿大比例、正常核型和复杂核型比例及共同累及的染色体异常类型上差异无统计学意义，而和老年AMI，患者比较差异有统计学意义。结论：MDS-RAEBT应该划分为MDS，该结论有待于前瞻性实验进一步验证。

关键词：白血病急性骨髓增生异常综合征难治性贫血伴原始细胞增多

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人4-1BBL胞外区/抗CD20融合蛋白的构建和表达

人4-1BBL胞外区/抗CD20融合蛋白的构建和表达

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天津市生物医学工程学会第29届学术年会暨首届生物医学工程前沿科学研讨会

作者：刘荣姜文国刘芳张砚君范冬梅杨铭邵晓枫王金宏熊冬生杨纯正中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室滨州医学院药理教研室

目的构建和表达人4-1BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白,并测定该融合蛋白的生物学活性。方法采用PCR和ovelapPCR方法构建人4-1BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白,并用双脱氧终止法测定DNA序列。采用亲和层析法纯化该产物,并用150 g/L SDS-P... 详细信息

目的构建和表达人4-1BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白,并测定该融合蛋白的生物学活性。方法采用PCR和ovelapPCR方法构建人4-1BBL胞外区/抗CD20双功能融合蛋白,并用双脱氧终止法测定DNA序列。采用亲和层析法纯化该产物,并用150 g/L SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化产物。采用FACS法鉴定纯化产

关键词：胞外区功能融合

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慢性淋巴细胞白血病并发自身免疫性血细胞减少症7例

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临床血液学杂志 2009年第5期22卷 491-492页

作者：吴瞳李增军王亚非赵耀忠钱林生邱录贵中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室天津300020 江西省肿瘤医院内一科南昌330029

目的:报道7例慢性淋巴细胞白血病(CLL)并发自身免疫性血细胞减少症,提高对CLL并发自身免疫性血细胞减少症的认识。方法:回顾性分析2000-2007年就诊于中国医学科学院血液病医院的7例CLL并发自身免疫性血细胞减少症患者的症状和体征、实... 详细信息

目的:报道7例慢性淋巴细胞白血病(CLL)并发自身免疫性血细胞减少症,提高对CLL并发自身免疫性血细胞减少症的认识。方法:回顾性分析2000-2007年就诊于中国医学科学院血液病医院的7例CLL并发自身免疫性血细胞减少症患者的症状和体征、实验室检查、治疗及转归,并复习相关文献。结果:6例患者诊断为自身免疫性溶血性贫血(AIHA),1例患者为Evans综合征。3例患者在诊断CLL的同时发现有溶血发作,另4例患者在CLL诊断后中位20.5个月出现溶血。5例患者用瘤可宁加激素的方案治疗,1例患者单用激素治疗,1例患者用单克隆抗体及联合化疗方案治疗。治疗有效6例,无效1例。3例在随访中溶血复发,再次治疗仍有效。1例患者对治疗反应不佳,需输血维持。随访至2008年4月,除1例患者失访外,其余6例患者全部存活。结论:自身免疫性血细胞减少症是CLL较常见的并发症。尽管激素加烷化剂的常规治疗疗效较好,但复发率较高。并发自身免疫性血细胞减少症无明显预后意义。

关键词：白血病淋巴细胞性慢性血细胞减少症免疫性

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干细胞在血栓性血管病中的治疗作用

干细胞在血栓性血管病中的治疗作用

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中华医学会血液学分会第十二届全国血栓与止血学术会议

作者：韩忠朝中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院、实验血液学国家重点实验室国家干细胞工程技术研究中心

血栓性血管疾病是常见疾病，其治疗仍依赖各类药物融栓和扩张血管，这并不能阻断病程的发展，往往最后不得不施行血管再通或旁路搭桥手术。本文介绍了干细胞在血栓性血管疾病中的治疗作用。

关键词：血栓性血管病药物融栓扩张血管干细胞

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急性移植物抗宿主病对正常造血干/祖细胞功能的影响

急性移植物抗宿主病对正常造血干/祖细胞功能的影响

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第12届全国实验血液学会议

作者：庄晓萌胡晓霞张薇薇龚胜兰程辉黄崇媚程涛王健民第二军医大学附属长海医院血液科第二军医大学附属长海医院中心实验室中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室

目的:急性移植物抗宿主病(aGVHD)是影响异基因造血干细胞移植成功最常见的并发症,急性GVHD患者出现造血功能障碍从而引起全血细胞减少已为临床所证实,疗效不佳,并影响造血干细胞移植患者的生存。有关aGVHD引起宿主造血功能障碍的机制目... 详细信息

目的:急性移植物抗宿主病(aGVHD)是影响异基因造血干细胞移植成功最常见的并发症,急性GVHD患者出现造血功能障碍从而引起全血细胞减少已为临床所证实,疗效不佳,并影响造血干细胞移植患者的生存。有关aGVHD引起宿主造血功能障碍的机制目前仍不清楚,阐明aGVHD时正常HSC的功能障碍的机理,具有重要的理论

关键词： aGVHD 供体来源 HSC HPC 急性移植物抗宿主病干/祖细胞

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抗抗CD3 ScFv单克隆抗体的制备和活性检测

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中国医学科学院学报 2008年第3期30卷 354-359页

作者：邵晓枫高灜岱刘娟妮王金宏许元富范冬梅杨纯正熊冬生中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所实验血液学国家重点实验室天津300020

目的制备抗抗CD3ScFv单克隆抗体,用以抗CD3抗体的亲和层析纯化及血清中该类抗体浓度的检测。方法采用常规免疫学方法制备抗抗CD3ScFv单克隆体并制备抗抗CD3ScFv单克隆抗体免疫亲和层析柱,用于抗CD3ScFv蛋白和去除E-tag的Diabody[CD3... 详细信息

目的制备抗抗CD3ScFv单克隆抗体,用以抗CD3抗体的亲和层析纯化及血清中该类抗体浓度的检测。方法采用常规免疫学方法制备抗抗CD3ScFv单克隆体并制备抗抗CD3ScFv单克隆抗体免疫亲和层析柱,用于抗CD3ScFv蛋白和去除E-tag的Diabody[CD3×Pgp]的分离纯化。采用FACS法测定分别经抗抗CD3ScFV抗体免疫亲和层析柱及抗E-tag亲和层析柱纯化的抗CD3ScFv蛋白和Diabody[CD3×Pgp]对K562/A02和Jurkat细胞特异结合活性。采用间接ELISA法进行抗抗CD3ScFv抗体特异性结合活性的检测。结果抗抗CD3ScFV单克隆抗体能特异性地与抗CD3ScFv蛋白结合而不与血清发生反应。经抗抗CD3ScFV抗体免疫亲和层析柱和经抗E-tag亲和层析柱纯化后的抗CD3ScFv蛋白均能与Jurkat细胞特异结合。经抗抗CD3ScFV抗体免疫亲和层析柱纯化的去除E-tag的Diabody[CD3×Pgp]与K562/A02和Jurkat细胞结合的阳性率分别为89.87%和83.95%;与其亲代抗体竞争结合K562/A02和Jurkat细胞后,结合率分别下降为56.30%和43.78%。结论制备了抗抗CD3单克隆抗体和亲和层析柱,可用于抗CD3抗体的亲和层析纯化及血清中该类抗体浓度的检测。

关键词：抗CD3ScFv蛋白单克隆抗体免疫亲和层析 Diabody[CD3×Pgp]

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PHⅡ—7增强阿霉素杀伤HL-60／ADR细胞的作用及机制研究

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中华血液学杂志 2008年第9期29卷 599-602页

作者：张砚君王锐邵晓枫范冬梅许元富周圆刘芳苏晔熊冬生中国医学科学院、北京协和医学院血液学研究所实验血液学国家重点实验室

目的研究PHⅡ-7增强阿霉素杀伤HL-60／ADR细胞的作用及其相关机制。方法用MTT法测定阿霉素、PHⅡ-7单独及联合用药对阿霉素杀伤人急性髓系白血病耐药细胞株（HL-60／ADR）及其亲代细胞系（HL-60）作用的，IC50值，提取不同浓度PHⅡ-7处... 详细信息

目的研究PHⅡ-7增强阿霉素杀伤HL-60／ADR细胞的作用及其相关机制。方法用MTT法测定阿霉素、PHⅡ-7单独及联合用药对阿霉素杀伤人急性髓系白血病耐药细胞株（HL-60／ADR）及其亲代细胞系（HL-60）作用的，IC50值，提取不同浓度PHⅡ-7处理不同时间后HL-60和HL-60／ADR细胞的RNA，RT—PCR法分析PHⅡ-7对MRP基因表达水平的影响，通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术观察PHⅡ-7处理前后HL-60和HL-60／ADR细胞内阿霉素浓度的改变。结果PHⅡ-7本身具有抗肿瘤活性，对HL-60和HL-60／ADR的，IC50值分别为（0．83±0．08）μmol／L，（1．74±0．56）μmoL／L。PHⅡ-7还能协同提高阿霉素的细胞毒作用，HL-60组两药相互作用指数（CDI）值为0．7，HL-60／ADR组CDI值为0．43，其对耐药细胞的协同作用更为显著。随PHⅡ-7作用时间延长及剂量增加，细胞MRP基因表达水平逐渐下降，细胞内阿霉素浓度逐渐提高，可达敏感细胞的55％。结论PHⅡ-7是有效的肿瘤细胞化疗药物，还具有下调MRP耐药基因表达的作用，从而有效逆转HL-60／ADR细胞的耐药现象，协同增强化疗药物对细胞的杀伤作用。

关键词：抗药性多药 PHⅡ-7 MRP基因阿霉素 HL-60细胞

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