检索结果-内蒙古大学图书馆

作者：金利子北京协和医学院(清华大学医学部)&中国医学科学院

学位级别：博士

本文主要从以下几方面展开论述：　　第一部分液相色谱串联质谱快速测定人血清甲基丙二酸的方法建立与临床应用　　背景:甲基丙二酸(MMA)是遗传代谢病有机酸血症的重要特征指标。许多国内外研究曾经表明，MMA也是维生素B12 (VB12)缺乏... 详细信息

本文主要从以下几方面展开论述：　　第一部分液相色谱串联质谱快速测定人血清甲基丙二酸的方法建立与临床应用　　背景:甲基丙二酸(MMA)是遗传代谢病有机酸血症的重要特征指标。许多国内外研究曾经表明，MMA也是维生素B12 (VB12)缺乏症的重要指标。临床上并不缺少维生素B12缺乏症的指标，即VB12和总同型半胱氨酸(tHCY);但国内外研究早就表明MMA是优于VB12和tHCY的、更敏感的VB12缺乏的代表性生物标志物。然而当前MMA检测项目在国内医院或实验室并不流行，临床医生也较少申请该项测试，国内也未开展该项目的实验室间质量评价。其中原因主要与国内大部分实验室未建立简捷的MMA检测方法有关。　　方法:配制MMA及其同位素内标的标准溶液，摸索MMA及其内标的最优质谱参数和液相色谱条件。寻找到简单的流动相策略和蛋白沉淀体系，使得整个方法仅需少量有机溶剂而且无需固相萃取、衍生化、吹干复溶等步骤。根据CLSI C62-A文件指南确认了方法的特异性、敏感性、稳健性、准确性和临床适用性。调查了健康对照者、VB12充足者、VB12缺乏者、贫血患者、维生素缺乏患者、和结肠癌患者体内的MMA水平。　　结果:蛋白沉淀体系为50μL内标、50 μL血清和300 μL甲醇;流动相方案为含0.1％甲酸/5％异丙醇的水相，等度洗脱(100％水相)，流速0.45 mL/min。MMA能够与其内在的同分异构体——琥珀酸(SA) 完全分离。方法性能:3个浓度水平的平均加标回收率分别为101.51％、92.40％和105.95％。连续5日测量批内、批间和总不精密度分别为1.42-2.69％、3.09-5.27％和3.22-5.47％。两个月内测量校准曲线的斜率、截距和相关关系的平均值及其95％置信区间(95％ CI) 分别为 0.992 (0.926 - 1.059)、-0.004 (-0.012 -0.004)和 0.997 (0.995 -0.999)。检测限和定量限分别为＜ 0.058 μmol/L和0.085 μmol/L。内标校正的基质效应很小。临床检测结果:VB12缺乏者表现出比VB12充足者更高的MMA水平;一些贫血、维生素缺乏、结肠癌患者表现出比健康对照更高的MMA水平。　　结论:本研究建立了基于LC-MS/MS的血清MMA快速检测方法，并且实现了比以往方法都更加简捷的MMA检测，整个方法过程和所需试剂简单、所需样本量和试剂量也少，具有简捷、环保、经济、更高成本效益等既往MMA检测方法不可比拟的优点。本研究也为后续建立快速检测人血清多种有机酸的LC-MS/MS方法提供了良好基础。　　第二部分液相色谱串联质谱快速测定人血清有机酸的方法建立与临床应用　　背景:有机酸（organic acid,OA）分析是遗传代谢紊乱疾病（inherited metabolic disorders,IMDs）临床诊断的金标准。常规检测方法无法进行有机酸分析，所以大部分常规临床实验室鲜有甚至无法开展这个项目。目前，这个项目绝大部分是在特殊实验室（如新生儿筛查实验室）、遗传代谢实验室、第三方检测机构开展。上世纪90年代，由于国内技术条件不够成熟，这项检测在国内无法开展，经济较发达地区实验室会将样本送往国外进行检测。2000年开始，国内实验室陆续建立了基于气相色谱-质谱技术（GC-MS）的尿有机酸检测方法并一直沿用至今。这套检测方法在遗传代谢病筛查诊断和监测治疗中发挥了十分重要的作用。但现有的这个检测方法需要经历肟化、有机萃取、吹干、衍生、再吹干复溶等复杂过程，费时、费力、成本高，且一些危化品难以买到。在本实验室建立使用液相色谱串联质谱技术（ LC-MS/MS）检测有机酸的方法时，2021年日本团队就报道了他们建立的LC-MS/MS检测有机酸方法以及他们开发的偶联了 LC-MS/MS的前处理系统，降低了人力成本;这属于国际上首次报道的使用LC-MS/MS法检测有机酸的研究,且该套仪器和方法体系可能会投入市场，将具有很大的临床应用价值与商业前景。而本团队开发的人血清和尿液有机酸分析方法不仅比以往GC-MS法更加省时省力省成本，还比最新的日本团队的LC-MS/MS法更加省时省力省成本。　　方法:选取了国内较高发有机酸血症的特征标志物进行开发，即甲基丙二酸血症（甲基丙二酸）、丙酸血症（3-羟基丙酸）、异戊酸血症（异戊酸）、戊二酸血症（戊二酸）、3-羟基-3甲基戊二酸血症（3-羟基-3甲基戊二酸）。配制各酸的水性储备标液和混合工作液，在LC-MS/MS平台上陆续摸索各酸的质谱条件和液相色谱条件。在上一部分研究中得知，蛋白沉淀法和超滤法对甲基丙二酸检测友好，故尝试了蛋白沉淀和超滤法进行样本前处理。故根据CLSI C62-A文件确认了方法的特异性、灵敏度、稳健性、准确性。使用

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肿瘤性骨软化症患者的骨骼特征和基于代谢组学的致病机制探索

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作者：倪晓琳北京协和医学院(清华大学医学部)&中国医学科学院

学位级别：博士

第一部分肿瘤性骨软化症患者的骨骼特征　　[背景]　　肿瘤性骨软化症(tumor-inducedosteomalacia,TIO)是由于肿瘤组织分泌过量的成纤维细胞生长因子23(fibroblastgrowthfactor23,FGF23)所导致的副肿瘤综合征，是最常见的获得性低血磷... 详细信息

第一部分肿瘤性骨软化症患者的骨骼特征　　[背景]　　肿瘤性骨软化症(tumor-inducedosteomalacia,TIO)是由于肿瘤组织分泌过量的成纤维细胞生长因子23(fibroblastgrowthfactor23,FGF23)所导致的副肿瘤综合征，是最常见的获得性低血磷性骨软化症。骨活检显示TIO患者存在骨骼矿化障碍，且由双能X线吸收仪(dual-energyX-rayabsorptiometry,DXA)评估的面积骨密度(arealbonemineraldensity,aBMD)显著降低，但DXA无法评估骨骼的微结构。而高分辨外周定量计算机断层扫描(high-resolutionperipheralquantitativecomputedtomography,HR-pQCT)和基于腰椎DXA影像的骨小梁分数(trabecularbonescore,TBS)的出现，分别为外周骨和腰椎的骨微结构评估提供了可能。国内外文献中鲜见TIO患者的骨微结构相关研究。成功切除TIO肿瘤后，患者的生化指标及临床症状可逐步改善至恢复正常，但缺乏术后短期内BMD及骨微结构变化的相关研究。此外，TIO患者中身高变矮十分常见且多不可逆转。然而，与身高变矮密切相关的椎体形变，在TIO患者中尚无研究进行系统描述。鉴于骨微结构在多种疾病中与骨折密切相关，其与TIO患者中椎体形变的关系也值得进一步探索。　　[目的]　　1、通过横断面研究，在TIO队列中应用HR-pQCT和TBS分别评估TIO患者术前外周骨及中轴骨的骨微结构特征;分析骨微结构与临床特征、生化指标的相关性;探索HR-pQCT参数与TBS的相关性。　　2、通过纵向研究，评估TIO患者术后短期内(术后3个月)外周骨及中轴骨的骨密度和骨微结构的变化。　　3、通过横断面研究，明确TIO患者中椎体形变的发生率、分布、类型、与临床指标的相关性，尤其是与骨微结构受损的相关性。　　[方法]　　1、研究对象:2016年1月-2021年3月期间于北京协和医院就诊的术后血磷恢复且经病理证实的TIO患者。　　(1)TIO患者骨微结构横断面研究:术前进行了HR-pQCT或者DXA扫描;按年龄、性别、体重指数匹配的健康对照用于HR-pQCT参数的比较。　　(2)TIO患者肿瘤切除术后骨微结构变化纵向研究:术前及术后3个月进行了HR-pQCT及DXA扫描的患者;(3)TIO患者椎体形变及其与骨微结构的关系研究:术前进行了胸腰椎侧位片拍摄的患者。　　2、资料收集:通过病历系统收集患者的一般情况、病史、生化检查、术后病理等信息。并通过酶联免疫吸附试验测定血清全段FGF23(intactFGF23,iFGF23)　　3、影像学检查:(1)DXA扫描腰椎及右侧髋部评估中轴骨aBMD,并分析TBS;(2)HR-pQCT扫描桡骨和胫骨远端评估外周骨体积骨密度(volumetricBMD,vBMD)、骨微结构、骨强度;(3)胸腰椎侧位X线片用于评估椎体形变的类型和分级。　　[结果]　　1、TIO患者骨微结构横断面研究　　(1)临床特征:共纳入186例TIO患者，其中男性107例，女性79例。平均年龄为44.5岁，中位病程为42个月。多数患者出现身高变矮(中位数为3.0cm)。110例患者(59.1％)存在活动能力受损，112例患者(60.2％)有骨折史。实验室检查显示TIO患者血磷降低、肾脏排磷增多。　　(2)TIO患者与健康对照的HR-pQCT比较:共计113例TIO患者在术前进行了HR-pQCT扫描。骨几何学方面，患者桡骨皮质骨面积(p=0.028)和胫骨皮质骨面积(p＜0.001)显著低于对照，且胫骨的小梁骨面积显著高于对照(p=0.002)。体积骨密度方面，患者桡骨和胫骨的小梁骨体积骨密度和皮质骨体积骨密度均低于对照(所有p＜0.001)。小梁骨微结构方面，患者桡骨和胫骨的骨小梁数量和小梁骨体积分数显著低于对照，而骨小梁分离度显著高于对照(所有p＜0.001)。皮质骨微结构方面，患者桡骨(p=0.004)和胫骨(p＜0.001)的皮质骨厚度显著低于对照，而桡骨(p＜0.001)和胫骨(p=0.030)皮质骨孔隙度显著高于对照。骨强度方面，患者桡骨骨硬度(p=0.007)和骨破坏载荷(p=0.005),以及胫骨骨硬度和骨破坏载荷(p＜0.001),均显著低于对照。组间差异以胫骨更为明显。　　(3)DXA:TIO患者的TBS(1.15±0.16)低于正常界值(1.35)。根据TBS评判的骨微结构异常(TBS＜1.35)的比例显著高于根据L1-4aBMD评判的骨量异常(Z值≤-2.0)的比例(89.6％vs.43.9％,p＜0.001)。　　(4)骨微结构与临床指标的相关性:更高的iFGF23、甲状旁腺素(parathyro

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基于高通量测序对肺癌及肝癌肿瘤标志物的鉴定、验证及临床应用研究

基于高通量测序对肺癌及肝癌肿瘤标志物的鉴定、验证及临床应用研...

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作者：王雅茹北京协和医学院(清华大学医学部)&中国医学科学院

学位级别：博士

第一章SUMO修饰酶SAE1激活EMT促进NSCLC转移的分子机制研究　　背景:蛋白质SUMO化修饰对蛋白质稳定性和蛋白定位至关重要，已被证实在肿瘤发生发展中发挥重要功能。SAE1作为介导蛋白质SUMO化修饰的关键酶，在非小细胞肺癌(Non-smallcell... 详细信息

第一章SUMO修饰酶SAE1激活EMT促进NSCLC转移的分子机制研究　　背景:蛋白质SUMO化修饰对蛋白质稳定性和蛋白定位至关重要，已被证实在肿瘤发生发展中发挥重要功能。SAE1作为介导蛋白质SUMO化修饰的关键酶，在非小细胞肺癌(Non-smallcelllungcancer,NSCLC)进展中的功能尚无明确报道，值得进一步研究。　　目的:本研究旨在探究肿瘤标志物SAE1介导NSCLC恶性特征的分子机制，并验证SAE1在患者痰液中的表达水平作为NSCLC辅助诊断标志物的临床应用价值。　　材料及方法:本研究纳入103例NSCLC患者组织蛋白质组学数据、42例NSCLC患者单细胞转录组数据探索SAE1的表达情况及与临床预后相关性，通过细胞实验和动物实验在体内和体外水平表征SAE1的恶性表型及促癌潜在机制。并纳入NSCLC患者及慢性肺阻塞性肺病(chronicobstructivepulmonarydisease,COPD)患者痰细胞样本，从蛋白质组学及免疫细胞化学水平评价SAE1的表达水平及作为临床辅助诊断标志物的应用潜力。　　结果:SAE1在NSCLC组织中显著高表达并与患者预后相关。体内和体外实验均证实SAE1可促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，且SAE1作为介导蛋白质SUMO化过程的关键分子，可导致参与上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)途径的作用蛋白N-Cadherin发生SUMO化修饰，使N-cadherin分子表达量上升，促进NSCLC细胞发生EMT,在NSCLC侵袭转移中发挥功能。另外，SAE1在NSCLC患者痰样本中表达水平显著高于COPD患者，其表达特征可作为辅助诊断NSCLC的生物标志物。　　结论:SAE1作为NSCLC的生物标志物，能够通过介导EMT相关蛋白的SUMO化修饰，在NSCLC的发生发展中发挥功能，且其在NSCLC患者痰液中的高表达能够辅助诊断，具有较高的临床应用价值。　　第二章胚胎发育角度阐述AFP在肝细胞癌中作用机制　　背景:胚胎发育与肿瘤发生发展在许多生物学过程中表现出高度相似性，甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)作为胚胎发育相关蛋白，也是目前临床广泛用于肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)诊断的生物标志物。但AFP介导HCC进展的潜在机制及其作为药物靶点的可行性仍待探索，从胚胎发育角度阐述AFP的作用机制为研究AFP在HCC进展中的功能提供了新思路。　　目的:本研究旨在通过联合分析HCC患者及恒河猴胚胎发育不同阶段胎肝组织基因表达谱，探索AFP在胚胎发育及肿瘤进展中的作用机制。　　材料及方法:本研究纳入19例AFPlow(血清AFP表达量＜25ng/mL)及19例AFPhigh(血清AFP表达量≥25ng/mL)的HCC患者基因芯片测序数据，联合恒河猴胚胎发育不同阶段的肝组织转录组测序数据，分析AFPlow及AFPhigh的HCC组织中基因表达谱和分子机制差异。利用胚胎发育数据建立“发育地图”并表征AFP在地图中的相对位置及HCC组织与胚胎发育过程的相似性。　　结果:AFPhigh组的HCC具有更明显的恶性生物学特征。与AFPhigh组相比，AFPlow组肿瘤组织微环境中树突状细胞、中性粒细胞和自然杀伤细胞的浸润比例更高，即AFPhigh组肿瘤组织呈现肿瘤抑制性免疫微环境。随胚胎发育进程AFP表达水平逐渐降低，AFPhigh组HCC组织的基因特征与早期胚胎肝组织的基因特征相似。　　结论:AFP作为胚胎发育相关蛋白，在HCC诊断及预后监测中发挥重要功能。且其高表达肿瘤组织呈现更明显的恶性生物学特征及免疫抑制性肿瘤微环境，并与胚胎发育早期阶段类似。　　第三章非侵袭性尿蛋白特征与肝细胞癌患者MVI风险相关性研究　　背景:微血管侵犯(Microvascularinvasion,MVI)是影响HCC患者预后的主要因素，目前MVI的确诊依靠患者术后组织病理学诊断，对HCC患者MVI状态进行可靠的术前预测有助于临床制定合理治疗方案。　　目的:本研究旨在利用HCC患者尿蛋白组学数据，识别能够用于术前精准预测患者MVI状态的生物标志物。　　材料及方法:本研究针对91例HCC患者及22例健康对照者的尿样进行无标记定量蛋白质谱测序，加权基因共表达网络分析(weightedgeneco-expressionnetworkanalysis,WGCNA)用于识别健康对照队列和HCC患者队列之间的尿蛋白组学特征。使用LASSO回归来识别与患者MVI状态相关的候选生物标志物，并联合患者术前临床资料构建可用于术前精准预测患者MVI风险的列线图。使用ELISA实验在独立样本验证集HCC患者队列(n=57)中进一步验证特征蛋白的表

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单细胞水平解析患者异基因造血干细胞移植后的造血重建及调控

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作者：霍莹莹北京协和医学院(清华大学医学部)&中国医学科学院

学位级别：博士

目的:造血干细胞(HSCs)是一群具有自我更新和多潜能分化特征的稀有细胞群。1957年，HSCs为基础的造血干细胞移植(HSCT)取得了首次成功，期间经过60余年的实践和优化，已在再生医学治疗中发挥范式作用，有希望治愈多种血液系统及非血液... 详细信息

目的:造血干细胞(HSCs)是一群具有自我更新和多潜能分化特征的稀有细胞群。1957年，HSCs为基础的造血干细胞移植(HSCT)取得了首次成功，期间经过60余年的实践和优化，已在再生医学治疗中发挥范式作用，有希望治愈多种血液系统及非血液系统疾病。然而，HSCT虽然已在临床治疗中广泛应用，但我们对HSCT后的造血重建的认知仅停留在血细胞数量恢复，对移植后各类血细胞的生态重建以及复杂多变的造血调控过程仍未触及。近年来蓬勃发展的单细胞技术尤其是单细胞转录组技术(scRNA-seq),能够在分子水平上细化细胞群体间的异质性，在单细胞尺度比较不同条件下的转录调控差异。基于此，我们拟利用单细胞转录组学技术，全面复现并解析患者在异基因HSCT(allo-HSCT)后的动力学重建过程;明确allo-HSCT后造血重建的调控机制，从而能够尽早识别预后不良患者，将临床干预的时间窗口前移，为临床诊疗提供allo-HSCT后全面的见解及参考。　　方法:我们拟纳入原发病为获得性再生障碍性贫血(AA)或重型再生障碍性贫血(SAA)进行HSCT的患者入组。AA伴有全血细胞减少，为骨髓造血衰竭综合征，患者的血液系统中无白血病细胞存在，该疾病背景为研究患者HSCT后造血重建提供了理想的研究模型。在我国，AA及SAA患者的移植方式以亲缘的异基因外周血造血干细胞移植(allo-PBSCT)为主。在allo-PBSCT前，我们留取了配对供者和受者的外周血进行全外显子测序，为移植患者的嵌合分析提供必要的基因组信息。在接受allo-PBSCT治疗的过程中，对供者采集物(Donor)——外周血造血干细胞(G-PBSCs)和移植后第1天(d1)、中性粒细胞/血小板植入时间(d14)、移植后第21天(d21)移植后30天(d30)、移植后第60天(d60)、移植后第90天(d90)和移植后半年至一年(＞d180)各时间点的骨髓和外周血样本进行留取，裂解红细胞后流式分选Lin-CD34+造血干祖细胞(HSPCs)进行单细胞标记逆转录RNA测序法(STRT-seq),对裂红后的总有核细胞(TNCs)进行10×Genomics平台的3''端单细胞转录组测序。在经过原始数据处理、降维聚类后，对Lin-CD34+细胞和TNCs进行分群和注释。首先，在单细胞尺度上复现HSPCs和TNCs在allo-PBSCT后的转录组动力学图谱;利用主成分分析(PCA),明确各随访时间点HSPCs和TNCs各细胞组分的动态变化;应用FateID工具预测HSPCs在不同时间点时的谱系分化潜能。接着，我们提出了基于单细胞转录组的嵌合分析，利用Demuxlet算法和全外显子测序提供的单核苷酸多态性(SNPs)位点信息，对allo-PBSCT后各群细胞的供受者来源进行判断，明确移植后患者的嵌合比例及受者遗留细胞的转录组学特征。接下来，我们分别从位于造血层级顶端的造血干细胞/多潜能造血祖细胞(HSC/MPPs)、寡能祖细胞(MEPs、GMPs、EBMs和BNKs)和中性粒细胞祖细胞群体(NePs)切入，全面解析HPSCs层面的造血重建规律及动态调控。对HSC/MPPs各亚群谱系分化偏好和细胞周期的调控进行了动态追踪;在寡能祖细胞中，则主要利用Monocle2和SCENIC分析，识别出寡能祖细胞中一致的转录组调控特征;最后，我们发现NePs的亚群——S100Ahigh Neus在供者采集物和移植患者中明显富集，从基因集富集分析、转录组相似性和前瞻性临床队列等角度，深度挖掘了S100Ahigh Neus转录组特征和临床意义。　　结果:我们共纳入了10例原发病为AA接受了allo-PBSCT的患者，共计10776个Lin CD34+细胞和317677个TNCs,绘制了移植患者全面的重建动力学图谱。在深度分析前，我们充分评估了患者间及样本间的异质性以确保后续结论的可靠性。首先分析了HSPCs在组分上动力学变化。重建过程中HSC/MPPs和LMPPs比例逐渐下降，d1时HSPCs中MEPs明显增多，HSC/MPPs和LMPPs紧随其后;供者采集物(Donor)和d1样本中HSC/MPPs、LMPPs和MEPs占比较高，组分更加相似,d14和d30的HSPCs中以GMPs、MDs和NePs为主组分较为相似;自d60起，移植患者的HSPCs成分开始出现差异，主要是由于患者间BNKs数量差异所致。接着我们对6名移植患者进行单细胞转录组嵌合分析，在约有1％的Lin-CD34+细胞和0.6-1.5％的TNCs为受者遗留细胞，其中遗留的Lin-CD34+细胞中85.7％为基质细胞(Stromal cells)。d1样本的遗留细胞比例高于其它随访时间点。接着，我们对HSC/MPPs、寡能祖细胞和中性粒细胞上游祖细胞进行解析，发现HSC

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基于CRISPR系统的脓肿分枝杆菌基因组编辑技术的构建及应用

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作者：李斯尚北京协和医学院(清华大学医学部)&中国医学科学院

学位级别：博士

分枝杆菌属于抗酸染色阳性菌，有近200种，包括结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis)和麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)等多个菌种。非结核分枝杆菌(Non-tuberculousmycobacteria,NTM)是指除结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌以外的... 详细信息

分枝杆菌属于抗酸染色阳性菌，有近200种，包括结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis)和麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)等多个菌种。非结核分枝杆菌(Non-tuberculousmycobacteria,NTM)是指除结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌菌种，广泛存在于水和土壤等自然环境中。由于缺乏强制性报告，NTM导致疾病的流行病学研究报告数量较少，但NTM病的发病率和患病率总体呈上升趋势。其中典型的代表是属于快速生长分枝杆菌(RapidlygrowingMycobacterium,RGM)中的脓肿分枝杆菌(MycobacteriumAbscessus)。然而，脓肿分枝杆菌对许多抗菌药物具有天然耐药性，随着现有敏感药物的耐药性增加，缺乏新型治疗药物,其被描述为“抗生素的噩梦”。　　脓肿分枝杆菌的耐药机制包括:(1)较厚细胞壁降低药物的通透性;(2)药物降解酶的产生;(3)药物作用靶点的突变;(4)药物主动外排系统等。其中外排泵系统将菌体内的药物持续泵出，防止药物在细菌内积累，降低杀菌作用能力，从而发生耐药，是分枝杆菌重要的耐药机制之一，被喻为细菌抗生素耐药的第一道防线。脓肿分枝杆菌外排泵的种类和数量较多，但目前相关研究较少，主要受限于缺乏高效的遗传操作工具。目前常采用同源重组的方法构建突变株，但成功率非常低，这严重束缚了对外排泵相关的耐药机制展开研究。　　CRISPR-Cas系统自从问世以来，由于操作便捷，可特异性切割向导RNA(singleguideRNA,sgRNA)碱基互补的目标序列，形成DNA双链断裂(DSB),进而引发细胞基因组的修复调控，被广泛应用于基因编辑领域。在此基础上，我们课题组前期成功构建了基于CRISPR-Cas12a和重组系统的质粒编辑技术、分枝杆菌单碱基基因编辑系统以及实现了CRISPR-Cas辅助的非同源末端连接(NHEJ)在结核分枝杆菌中的应用，这为在脓肿分枝杆菌中构建基因编辑系统奠定了重要基础。　　本研究的主要内容是在脓肿分枝杆菌中构建基于CRISPR-Cas系统的基因编辑技术，并利用基因编辑系统对外排泵相关的耐药机制展开研究。第一部分主要讲述基因编辑系统的构建，包括CRISPR-Cas系统辅助的非同源末端连接技术和CRISPR-Cas系统辅助的同源重组技术。第一项技术将CRISPR-Cas系统与非同源末端连接相结合，Cas9蛋白在sgRNA引导下对目标位点剪切形成DSB,在抑制同源重组的同时，高表达NHEJ相关基因元件，来促进细菌基因组在DSB处发生非同源末端连接修复，由于非同源末端连接修复是非精确的修复方式，在修复末端可以产生碱基缺失或插入，从而实现基因敲除的目的，并且具有较高的效率。第二项技术将CRISPR-Cas9与同源重组酶gp60和gp61相结合，通过外源引入含同源臂的等位交换底物，在同源重组酶的作用下发挥同源重组作用，其中sgRNA引导的Cas9会对未发生重组的目标位点进行剪切，从而发挥筛选作用。综上，基于CRISPR-Cas系统的两项基因编辑技术均可成功应用于脓肿分枝杆菌，实现高效的大片段基因删除、精确删除、基因置换、插入和点突变。　　本文的第二部分是在构建基因编辑技术的基础上，对脓肿分枝杆菌外排泵相关的耐药机制展开研究。我们构建了脓肿分枝杆菌外排泵基因删除库，系统研究这些转运蛋白在耐药中发挥的作用。通过外排泵基因删除库对药物敏感性的检测，我们发现了多个与耐药相关的基因，如删除MAB_2440、MAB_2706c或MAB_3396会使脓肿分枝杆菌对克拉霉素变得敏感;MAB_2038与贝达喹啉的耐药相关;删除MAB_1396、MAB_0183c或MAB_4064会使脓肿分枝杆菌对多种药物变得敏感;△MAB_3142c敏感表型非常明显，提示对多种药物发挥转运外排作用。其中MAB_2806-2807突变株几乎对所有检测药物变得敏感，而且影响脓肿分枝杆菌的毒力及宿主的抗菌效应，将该基因删除后导致脓肿分枝杆菌对大蜡螟及小鼠的毒力显著降低。对这些外排泵基因的系统性研究，极大丰富了我们对脓肿分枝杆菌耐药和致病机制的认识，并为其感染、治疗及预防提供重要的支持。

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microRNA在癌症诊疗中的应用与基础研究

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作者：吴芃北京协和医学院(清华大学医学部)&中国医学科学院

学位级别：博士

第一部分免疫相关的循环microRNAs特征谱被确定为癌症早期诊断的可靠生物标志物　　背景:早期发现是降低癌症死亡率的关键。目前，人们一直在努力寻找癌症早期诊断的替代方法，液体活检技术以非侵入性方式在临床实践中前景最为广泛。由... 详细信息

第一部分免疫相关的循环microRNAs特征谱被确定为癌症早期诊断的可靠生物标志物　　背景:早期发现是降低癌症死亡率的关键。目前，人们一直在努力寻找癌症早期诊断的替代方法，液体活检技术以非侵入性方式在临床实践中前景最为广泛。由于血清中循环microRNAs(miRNAs)的稳定、丰富和独特性，使其成为癌症诊断和治疗监测中最有前途的候选者。考虑到免疫在癌症发生发展中的重要作用,我们推测免疫相关miRNAs可能会为泛癌的早期诊断提供新的见解。　　方法:在本研究中，我们整合来自(Geneexpressionomnibus,GEO)数据库13种癌症类型共15832例研究对象的循环miRNA表达谱数据，采用基因表达值进行成对比较形成miRNA对(miRNApairs)这种新型模型构建体系，基于生物信息学方法筛选在癌症发生发展过程中可能扮演重要角色的miRNApairs,并对其生物学相关功能和信号通路进行了富集分析。采用多种机器学习算法构建诊断分类器，比较不同算法下模型的诊断效能。模型评价指标包括受试者操作特征曲线下面积(AUC)、灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和约登指数等。　　结果:在本研究中，我们开发了一个名为XGBoost34的分类器，它由34个与免疫相关的miRNApairs组成，并用于实体瘤的早期诊断。进一步在验证集、测试集及外部测试集中评估了该分类器的性能，AUC值达到0.980到1.000之间。同时，模型在评估每种癌症类型的AUC、灵敏度和特异度均超过0.900。与既往研究miRNA分子模型相比，XGBoost34在癌症诊断中具有明显的优势。　　结论:据我们所知，这是首个基于免疫miRNApairs的泛癌早期诊断模型，其样本量远远超过以往任何研究。研究证明了循环免疫miRNApairs在泛癌诊断中的适用性，模型在癌症早期诊断方面具有强大而稳定的实用性，特别是在早期癌症中，这为癌症的早期诊断和筛查提供了新的见解。　　第二部分microRNA分子模型在预UJ食管鳞癌新辅助放化疗预后和疗效中的潜在价值研究　　背景:由于其高度侵袭性和常见性，食管鳞状细胞癌（ESCC）已经成为我国重要的疾病负担。目前，新辅助放化疗这一综合治疗方式已被纳入国内外食管鳞癌的规范化治疗指南，然而仍然有超过一半的接受患者无法从中获益。随着精准肿瘤学时代来临，如何筛选真正获得临床益处的食管鳞癌患者具有重要意义，也是我们本研究的重点。　　方法:回顾性收集2007年至2018年间，中国医学科学院肿瘤医院、河南省肿瘤医院和安阳省肿瘤医院的三个临床中心共215例接受新辅助放化疗的食管鳞癌患者初治内镜标本。采用小RNA测序和实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测样本中miRNAs（microRNAs）表达水平。研究过程分为发现阶段、训练阶段和验证阶段，在发现阶段采用Cox比例风险回归模型确定预后相关的候选miRNAs分子，训练阶段采用LASSOCox回归方法构建预后模型，验证阶段将模型在多中心队列中进行效能评估，以确保模型的稳定性与泛化能力。　　结果:在发现队列中，鉴定出58个与预后相关的miRNAs分子，进一步在训练阶段纳入模型中，采用LASSOCox回归筛选并构建出基于6个miRNAs分子的预后模型（miRNA-relatedsignature,MIRS）。在北京内部队列中根据MIRS评分可将研究对象分为低分组和高分组，两组在总体生存方面差异有统计学意义（HR:3.747,95％CI:3.392-4.843,P＜0.001）,预测1、3、5年总体生存状况的ROC达到0.79以上，且预后价值优于各临床病理特征。同时，模型在北京内部队列和河南外部队列中显示出较好的预测效能。　　结论:本研究系统揭示了ESCC患者miRNAs的表达模式和潜在的临床意义，筛选出具有预后价值的miRNAs分子，成功地识别并开发了一种基于miRNAs的分子模型，可以实现对接受NCRTESCC患者NCRT长期获益进行可靠的预测,并在多个独立的ESCC临床队列中进行系统和全面的验证。本研究的开展帮助并优化ESCC了患者个性化的治疗策略，以最大限度地提高每个患者治疗效果与生存获益。　　第三部分miR-1246介导食管鳞癌放化疗抵抗的机制研究　　背景:在前期工作中，我们基于接受新辅助放化疗前食管鳞癌(ESCC)内镜组织样本小RNA测序结果，鉴定出与放化疗抵抗相关密切相关的6个miRNAs分子，包括has-miR-502-5p、has-miR-548am-3p、has-miR-675-5p、has-miR-1246、has-miR-4448和has-miR-7704。本研究通过体内外实验筛选并验证参与放化疗抵抗的关键miRNA分子，以期揭示食管鳞癌放化疗抵抗机制,为食管鳞癌精准治疗提供理

来源：评论

食管鳞癌中APOBEC突变模式对免疫浸润和免疫治疗应答的作用及其机制

食管鳞癌中APOBEC突变模式对免疫浸润和免疫治疗应答的作用及其机...

引用

作者：杨洁北京协和医学院(清华大学医学部)&中国医学科学院

学位级别：博士

背景与目的:体细胞突变在整个肿瘤进化过程中逐步积累。肿瘤基因组表现出特定突变模式，称为突变特征，其反映了外源性和内源性突变过程的印迹。载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽(apolipoproteinBmRNAeditingenzymecatalyticpolypeptide,APO... 详细信息

背景与目的:体细胞突变在整个肿瘤进化过程中逐步积累。肿瘤基因组表现出特定突变模式，称为突变特征，其反映了外源性和内源性突变过程的印迹。载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽(apolipoproteinBmRNAeditingenzymecatalyticpolypeptide,APOBEC)相关突变特征，即SBS2和SBS13,在至少22种类型的肿瘤中存在。据报道SBS2和SBS13在食管鳞癌中几乎普遍存在，这表明APOBEC突变模式在食管鳞癌中是一个必不可少的强制性过程。此外，SBS2和SBS13存在于大多数食管鳞癌样本中，占总突变负荷的25％,揭示了APOBEC突变模式是食管鳞癌进化过程中的关键一步。APOBEC突变模式以TCW序列中C＞T或C＞G的改变(其中W指A或T)为特点。APOBEC3亚家族成员可催化胞嘧啶脱氨基为尿嘧啶，对于APOBEC突变模式的形成具有重要作用，但是其中哪一个成员在食管鳞癌中作为APOBEC突变模式的主要来源目前仍然是未知的。免疫治疗已在食管鳞癌中取得较大进展，已成为局部晚期或转移性患者的一线治疗方案。肿瘤免疫微环境的特点是患者免疫治疗疗效分层的先决条件。APOBEC突变模式的生物学功能在不同类型肿瘤中差异较大，但它在食管鳞癌中对肿瘤免疫原性和免疫治疗应答中的作用及其机制尚未得到充分了解。　　方法:在本研究中，我们从三个已发表的队列中收集了169例食管鳞癌患者的配对的多组学数据，包括体细胞突变数据、bulk转录组数据和单细胞转录组数据。为了剖析APOBEC突变模式对肿瘤免疫浸润的影响，我们使用体细胞突变数据进行突变富集分析，利用ESTIMATE和TMEscore算法对bulkRNA测序(RNAsequencing,RNA-seq)数据进行肿瘤微环境反卷积计算，并使用单细胞RNA测序(single-cellRNAsequencing,scRNA-seq)数据和多重免疫荧光进行验证。更重要的是，我们通过T＞C和T＞G的突变在突变碱基上下游20bp的碱基序列以及APOBEC3亚家族各个成员的表达情况确定了食管鳞癌中介导APOBEC突变模式的主要突变来源，阐明了食管鳞癌中APOBEC突变模式激活免疫的潜在分子机制。　　结果:我们发现APOBEC突变模式的富集可使食管鳞癌患者的总生存时间(overallsurvival,OS)延长，造成这种结果的原因可能是由于较高的抗肿瘤免疫细胞浸润,免疫检查点表达和抗肿瘤免疫相关通路的富集,包括干扰素(interferon,IFN)信号通路，固有免疫系统和适应性免疫系统的活化。A3A的活性升高对APOBEC突变模式至关重要。从机制上讲，A3A的表达上调会加剧胞质中双链DNA(double-strandedDNA,dsDNA)的积累，从而激活cGAS-STING通路。同时，使用肿瘤免疫功能异常和免疫逃避(TumorImmuneDysfunctionandExclusion,TIDE)算法预测A3A的表达水平与免疫治疗应答之间的关系，发现A3A高表达的患者免疫治疗效果好。另外我们在一个临床队列中验证了这个结论。这些结果系统阐明了APOBEC突变模式在食管鳞癌中的临床相关性、免疫学特征、免疫治疗的预后价值以及潜在机制，在临床应用上具有促进临床决策的巨大潜力。　　结论:总之，我们使用全基因组/全外显子组数据(wholegenome/exomesequencing,WGS/WES),bulk转录组和单细胞转录组数据以及功能实验阐明了APOBEC突变模式是否激活免疫及其潜在的具体机制。同时，我们揭示了A3A作为一种新的生物标志物，用于预测食管鳞癌免疫治疗效果。

来源：评论

生长抑素受体对G蛋白通路选择性的分子基础

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作者：陈思嘉北京协和医学院(清华大学医学部)&中国医学科学院

学位级别：博士

G蛋白偶联受体家族(Gprotein-coupledreceptors,GPCRs)是最大的膜蛋白受体家族，拥有超过800个膜蛋白成员。作为非常重要且有潜力的药物靶点，目前经FDA批准上市的药物中超过35％为靶向GPCRs类的药物，用于调控生长发育、肿瘤免疫、神... 详细信息

G蛋白偶联受体家族(Gprotein-coupledreceptors,GPCRs)是最大的膜蛋白受体家族，拥有超过800个膜蛋白成员。作为非常重要且有潜力的药物靶点，目前经FDA批准上市的药物中超过35％为靶向GPCRs类的药物，用于调控生长发育、肿瘤免疫、神经退行性疾病等多个方面。大多数GPCRs在结构上存在一定的保守性，即由胞外区，七次跨膜和胞内区组成。结合配体后的GPCRs产生构象变化，通过招募胞内G蛋白异源三聚体而产生不同类型的二级信使，从而介导多种信号分子由细胞外向细胞内传递。常见的G蛋白α亚基有Gs/olf,Gi/o,Gq/11和G12/13四种类型，分别负责不同的下游信号调控。同时，激活后的GPCRs招募阻遏蛋白β-arrestins,促进其和G蛋白的解离，并介导GPCRs的内吞过程。　　研究发现,大多数GPCRs在配体激活状态下能够招募多种不同的G蛋白亚型，并且激活G蛋白的能力也存在差异。因此，配体通路激活具有偏好性，而选择性激活所产生的潜在治疗效果也是当前研究的焦点。由于GPCRs构象的多样性，它们可以与下游效应因子结合并调节复杂的胞内响应过程。配体偏好性激活提供了新的思路来解决药物治疗中副作用和耐药机制问题。然而，目前仍存在关于偏好原理分子基础方面需要进一步探索。　　生长抑素受体(somatostatinreceptors,SSTRs)家族包含有五个成员SSTR1-5,由内源多肽类配体生长抑素-14和生长抑素-28(SST-14和SST-28)激活，招募Gi/o类型的G蛋白，进而抑制腺苷酸环化酶的活性，引起二级信使cAMP(cyclicAMP)水平的降低，从而抑制多种生长激素的释放。通过这一信号通路参与血糖调控，细胞繁殖，肿瘤免疫等生理功能，在肢端肥大症和神经内分泌瘤等多种类型的肿瘤疾病中有着重要的治疗作用。由于内源配体半衰期较短且不易成药，因此奥曲环肽(Octreotide)和兰瑞肽(Lanreotide),两种由生长抑素衍生的同源类似物因其高亲和力、特异性强以及稳定性好而广泛应用于临床疾病治疗。　　然而，我们通过对SSTRs家族的五种受体系统性的研究后发现，除了已知的Gi/o通路，SSTR2和SSTR5同样可以响应Gq/11通路，引起下游的二级信使钙离子浓度升高，同时产生肌醇三磷酸IP3。而且配体分子量越小，越倾向于激活Gi/o通路;分子量越大，越偏好于Gq/11通路。因此，我们利用冷冻电镜技术(cryo-electronicmicroscopy,cryo-EM)对SSTRs家族的亚型SSTR2进行更深入的结构解析，得到了SSTR2复合物在内源配体SST-14和外源配体奥曲环肽激活下分别招募下游的Gi/o和Gq/11所形成的复合物。通过序列比对和对电镜结构的差异分析，我们不仅清晰的解释了不同配体和受体的识别口袋，同时揭示了配体对于不同G蛋白通路选择偏好性的分子基础。　　根据两种G蛋白复合物的构象差异进行分子层面相互作用的分析，佐以多种细胞水平的多重互作实验验证，我们可以最终得出结论，SSTR2在结合不同G蛋白亚型（Gi/o和Gq/11）时产生的构象变化不同。SSTR2-Gq/11相对于SSTR2-Gi/0复合物而言，需要更大的空间和更多的相互作用来稳定该激活状态下的构象。即上游的配体大小和性质会影响其与受体结合口袋的空间构象，从而影响受体对下游G蛋白通路的选择性。我们基于冷冻电镜平台和多种细胞功能实验，对药物的偏好性分子基础进行独特的探索和研究，希望对于新型药物的开发和副作用的规避有着一定的指导意义。

来源：评论

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱδ在溃疡性结肠炎发病及其炎癌转化过程中的作用及机制研究;不同质子泵抑制剂和钾离子竞争性酸阻断剂对吲哚美辛诱导的小鼠小肠溃疡的影响

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱδ在溃疡性结肠炎发病及其炎癌转化...

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作者：李可敏北京协和医学院(清华大学医学部)&中国医学科学院

学位级别：博士

课题一钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱδ在溃疡性结肠炎发病及其炎癌转化过程中的作用及机制研究　　研究背景:　　溃疡性结肠炎(Ulcerativecolitis,UC)是肠道的一种病因复杂、机制不明的炎症性疾病，癌变是其最为严重的并发症。多项证据... 详细信息

课题一钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱδ在溃疡性结肠炎发病及其炎癌转化过程中的作用及机制研究　　研究背景:　　溃疡性结肠炎(Ulcerativecolitis,UC)是肠道的一种病因复杂、机制不明的炎症性疾病，癌变是其最为严重的并发症。多项证据表明细胞焦亡及肠道菌群与UC发病及其癌变过程密切相关，但具体机制尚未完全阐明。钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ家族(Ca2+/calmodulin-dependentproteinkinaseⅡ,CAMKⅡ)是一类丝氨酸-苏氨酸激酶，在UC及结肠癌发生发展过程中发挥重要作用，CAMKⅡδ作为其家族主要成员，其在UC发病以及炎癌转化过程中的作用尚未见报道。　　研究目的:　　探究CAMKⅡδ在UC及其炎癌转化过程中的作用及其可能机制。　　研究方法:　　临床水平上，通过公共数据库GEO(GeneExpressionOmnibus)分析健康人群与UC患者结肠组织中CAMKⅡδ表达水平，通过免疫组化检测临床UC患者及正常人群结肠组织CAMKⅡδ的表达。动物水平上，利用CAMKⅡδ基因敲除小鼠，构建DSS诱导的急性肠炎模型及AOM/DSS诱导的炎癌模型，通过检测小鼠体重变化、疾病活动度评分、组织病理评分、小鼠结肠长度及小鼠成瘤情况等指标评估CAMKⅡδ敲除对小鼠结肠炎症及其成瘤能力的影响;利用qPCR及ELISA技术检测炎症因子表达，通过Westernblot实验检测各组小鼠结肠细胞焦亡通路相关蛋白(NLRP3、GSDMD、Caspase1)的表达，研究CAMKⅡδ敲除对各组小鼠结肠组织内细胞焦亡水平的影响。此外，将CAMKⅡδ基因敲除小鼠与野生型小鼠平衡菌群1周后分开饲养6周，收集小鼠粪便进行宏基因组测序，探究CAMKⅡδ对肠道菌群的影响;利用共饲养模型、四联抗生素预处理的伪无菌小鼠，分别探究消除组间菌群差异及清除肠道菌群后，CAMKⅡδ敲除对DSS诱导的小鼠急性肠炎炎症程度的影响。细胞水平上，通过LPS联合nigericin诱导结肠上皮细胞焦亡模型，通过敲低及过表达策略研究CAMKⅡδ表达水平改变对细胞焦亡水平的影响。　　研究结果:　　公共数据库GSE47908分析发现CAMKⅡδ在UC患者结肠组织中表达显著下调，临床标本免疫组化染色及小鼠结肠组织Westernblot结果也显示CAMKⅡδ在UC患者及DSS诱导的小鼠急性肠炎结肠组织中表达降低。进一步发现，CAMKⅡδ敲除后，DSS诱导的小鼠结肠炎症明显加重，AOM/DSS诱导的小鼠成瘤能力增强。RNA-seq检测发现敲除CAMKⅡδ导致小鼠结肠组织内RNA表达谱显著改变，细胞焦亡通路相关基因显著上调;KEGG分析发现NOD样受体通路显著富集，Westernblot证实敲除CAMKⅡδ导致细胞焦亡相关蛋白(NLRP3、GSDMD-N和cleaved-Caspase1)表达水平明显升高。同时，在LPS联合nigericin诱导的结肠上皮细胞焦亡模型中，敲低CAMKⅡδ内源性表达明显促进细胞焦亡相关蛋白表达，而过表达CAMKⅡδ显著抑制细胞焦亡相关蛋白表达。宏基因测序结果发现与野生型小鼠相比，CAMKⅡδ敲除小鼠的肠道菌群基因数目明显下降，Metastat显示肠道菌群组成差异显著，具体表现为有益菌减少，比如:Lactobacillus、Eubacterium和Butyrivibrio,伴随有害菌增多，如:Proteobacteria、Sutterella和Parasutterella_excrementihominis。进一步研究发现，消除组间菌群差异和清除肠道菌群后，DSS诱导的急性肠炎炎症程度在野生型小鼠和CAMKⅡδ敲除鼠中无明显差异。　　研究结论:　　CAMKⅡδ在UC患者结肠组织中显著下调，可能通过调控细胞焦亡水平及肠道菌群参与UC发病及其癌变过程。　　课题二不同质子泵抑制剂和钾离子竞争性酸阻断剂对吲哚美辛诱导的小鼠小肠溃疡的影响　　研究背景及目的　　胃酸抑制剂(GAIs)对非甾体类抗炎药(NSAIDs)所致肠病的作用一直存在争议。本文阐明了不同种类的GAIs,包括不同种类的质子泵抑制剂和钾离子竞争性酸阻断剂对非甾体抗炎药所致小鼠小肠损伤的影响及其潜在的可能机制。　　方法　　通过吲哚美辛(Indomethacin,IND,10mg/kg/天)灌胃诱导小鼠小肠损伤。通过大体观察和组织学评估疾病活动度。通过Westernblot技术检测肠道紧密连接蛋白的表达水平，qPCR技术检测炎症因子的表达。通过测量血浆脂多糖(LPS)水平评估小肠黏膜的通透性。16SrDNA测序评估小鼠肠道菌群组成。　　结果　　在四种GAI中，艾普拉唑(Ilaprazole,IPZ)显著缓解IND诱导的小肠损伤，维持黏膜屏障的完整性。奥美拉唑(Omeprazole,OPZ)和伏诺

来源：评论

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