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RNA m6A去甲基化酶ALKBH5基因敲除对老年小鼠小脑形态和功能的影响

中华病理学杂志 2023年第6期52卷 606-611页

作者：费祎马春卉李晴宋伟佟伟民牛亚梅中国医学科学院基础医学研究所暨北京协和医学院基础学院病理学系北京100005 中国医学科学院基础医学研究所暨北京协和医学院基础学院、医学分子生物学国家重点实验室、生物化学与分子生物学系北京100005

目的观察RNA m6A去甲基化酶ALKBH5基因敲除之后对老年小鼠小脑形态和功能的影响,探究ALKBH5在小脑退行性病变中的作用。方法免疫印迹实验检测不同年龄C57BL/6野生型小鼠(包括2月龄、6月龄、12月龄、18月龄)小脑中ALKBH5的蛋白水平。通... 详细信息

目的观察RNA m6A去甲基化酶ALKBH5基因敲除之后对老年小鼠小脑形态和功能的影响,探究ALKBH5在小脑退行性病变中的作用。方法免疫印迹实验检测不同年龄C57BL/6野生型小鼠(包括2月龄、6月龄、12月龄、18月龄)小脑中ALKBH5的蛋白水平。通过免疫组织化学实验检测中年(12月龄)及老年(18月龄)野生型小鼠和ALKBH5基因敲除(ALKBH5^(-/-))小鼠中NeuN、Calbindin-D28K、MAP2、胶质纤维酸性蛋白等蛋白的表达情况。平衡木实验和步态实验检测小鼠平衡能力以及运动协调能力。结果ALKBH5蛋白在小脑中的表达水平随着小鼠生理性衰老的进行而逐渐升高。在中年小鼠中,野生型和ALKBH5^(-/-)小鼠的体重、脑重以及小脑的形态大小没有明显差别,同时颗粒神经元、浦肯野细胞及神经元树突的形态和数量均未见明显改变。在老年小鼠中,相较于野生型小鼠,ALKBH5^(-/-)小鼠的体重、全脑重和小脑重分别下降15%、10%和21%(P<0.05)。ALKBH5在浦肯野细胞中的表达高于其他类型的神经细胞,与之对应在老年ALKBH5^(-/-)小鼠中浦肯野神经元的数量下降40%,树突的长度和密度也明显减少(P<0.01)。老年ALKBH5^(-/-)小鼠通过平衡木相较于同龄的野生型小鼠所用的时间增加70%,且出现步态不稳的情况(P<0.01)。结论RNA m6A去甲基化酶ALKBH5缺失会造成老年小鼠小脑萎缩、浦肯野神经元缺失与受损,进而损害其运动协调和平衡能力。上述结果提示RNA m6A甲基化失衡会导致小脑的神经退行性病变。

关键词：小脑浦肯野细胞 RNA m6A甲基化 ALKBH5

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异质性细胞核核糖蛋白A2B1在小鼠小脑发育与人髓母细胞瘤中的表达

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中华病理学杂志 2019年第9期48卷 694-699页

作者：赵顺莉赵赋李晴张晶张至玮李春德刘丕楠佟伟民牛亚梅中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院病理学系中国医学科学院分子病理中心100005 首都医科大学附属北京天坛医院神经外科 100050

目的探讨异质性细胞核核糖蛋白(HNRNP)A2B1在小鼠小脑发育及髓母细胞瘤中的表达模式及意义。方法从数据库查询小鼠小脑及人脑中基因的RNA水平。免疫印迹实验与免疫组织化学实验检测不同年龄C57BL/6野生型小鼠小脑中HNRNPA2B1的蛋白水平... 详细信息

目的探讨异质性细胞核核糖蛋白(HNRNP)A2B1在小鼠小脑发育及髓母细胞瘤中的表达模式及意义。方法从数据库查询小鼠小脑及人脑中基因的RNA水平。免疫印迹实验与免疫组织化学实验检测不同年龄C57BL/6野生型小鼠小脑中HNRNPA2B1的蛋白水平。通过免疫组织化学实验检测对照人小脑样本与人髓母细胞瘤中HNRNPA2B1的蛋白水平。m6A-IP-qPCR检测Daoy细胞中HNRNPA2B1 RNA m6A甲基化水平;利用人髓母细胞瘤Daoy细胞检测蛋白酶抑制剂MG132对HNRNPA2B1蛋白丰度的影响。结果小鼠小脑发育期HNRNPA2B1的RNA及总体蛋白水平高于成年小鼠小脑;原位水平上HNRNPA2B1低表达于含有增殖细胞的外颗粒层,而在浦肯野细胞与分子层细胞中高表达。HNRNPA2B1在髓母细胞瘤中的RNA水平显著高于正常人小脑,但免疫组织化学染色阳性强度明显降低,且差异具有统计学意义(P<0.05)。人髓母细胞瘤及Daoy细胞中HNRNPA2B1 RNA上含有m6A修饰;10 μmol/L或20 μmol/L的MG132处理均可引起Daoy细胞中HNRNPA2B1蛋白水平升高。结论HNRNPA2B1在小鼠小脑发育过程中的表达呈动态变化;与对照组相比,人髓母细胞瘤中HNRNPA2B1的RNA水平显著上升,而蛋白水平明显降低,提示HNRNPA2B1可能与小脑发育及髓母细胞瘤进程相关。HNRNPA2B1 RNA m6A修饰及蛋白的泛素化修饰可能是导致其在髓母细胞瘤中RNA丰度升高而蛋白水平降低的原因。

关键词：髓母细胞瘤核糖核蛋白类小脑皮质动物替代试验小鼠,近交C57BL

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抗CD20单链抗体融合显性抗原肽的原核表达和其抑瘤活性研究

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中国免疫学杂志 2015年第4期31卷 501-508页

作者：孙蕊朱琰冯海凉卞晓翠顾蓓王春景刘玉琴中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院病理学系和细胞资源中心北京100005

目的:人工设计并表达美罗华(C2B8)单链可变区抗体与李斯特菌溶细胞素O(Listeriolysin O,LLO)显性抗原表位构成的重组融合蛋白(Sc Fv-p LLO),初步分析其抗淋巴瘤细胞活性。方法:查询数据库获得美罗华(C2B8)单抗VH和VL基因序列,构建抗CD2... 详细信息

目的:人工设计并表达美罗华(C2B8)单链可变区抗体与李斯特菌溶细胞素O(Listeriolysin O,LLO)显性抗原表位构成的重组融合蛋白(Sc Fv-p LLO),初步分析其抗淋巴瘤细胞活性。方法:查询数据库获得美罗华(C2B8)单抗VH和VL基因序列,构建抗CD20单链抗体(Sc Fv)基因序列,选取LLO的2个CD4+T细胞表位,构建单链抗体融合抗原表位的重组蛋白基因序列,克隆至原核表达载体,经诱导表达纯化,流式细胞术和免疫共沉淀分析其与淋巴瘤细胞结合能力,细胞增殖实验测定其对淋巴瘤细胞生长的影响,凋亡实验分析其诱导淋巴瘤细胞凋亡的能力,淋巴细胞增殖实验分析其免疫原性。结果:成功诱导表达重组蛋白Sc Fv-p LLO。Sc Fv-p LLO可不同程度地靶向结合不同淋巴瘤细胞系,并明显抑制Raji细胞生长和诱导其凋亡。Sc Fv-p LLO可刺激免疫小鼠脾细胞增殖。结论:重组蛋白Sc Fv-p LLO保留了Sc Fv的功能,可靶向结合和抑制CD20阳性淋巴瘤细胞的生长,同时可激活机体免疫应答,为进一步研究其模拟瘤细胞表面抗原和作为瘤细胞疫苗佐剂的功能奠定基础。

关键词： CD20 单链抗体 B细胞淋巴瘤抗原表位李斯特菌溶细胞素O

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坎地沙坦预防家兔动脉粥样硬化斑块破裂的研究

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中华病理学杂志 2010年第2期39卷 106-111页

作者：周新福尹洪超朱文玲沈莉于涛李尚艾孟子敏吴爱山钱焕德中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院心内科 100730 中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院病理学系山东省威海市立医院心内科

目的检测坎地沙坦是否具有稳定动脉粥样硬化斑块、预防斑块破裂的作用，并探讨其机制。方法34只新西兰雄性大白兔，随机分为正常组、模型组、坎地沙坦干预组。正常组普通饲料喂养，后两组高胆固醇（1％胆固醇）喂养，一周后行腹主动脉... 详细信息

目的检测坎地沙坦是否具有稳定动脉粥样硬化斑块、预防斑块破裂的作用，并探讨其机制。方法34只新西兰雄性大白兔，随机分为正常组、模型组、坎地沙坦干预组。正常组普通饲料喂养，后两组高胆固醇（1％胆固醇）喂养，一周后行腹主动脉内膜剥脱术，坎地沙坦组于腹主动脉内膜剥脱术前2d给予坎地沙坦（0．5mg·k^-1·d^-1）干预。12周末对模型组和干预组行药物诱发不稳定粥样斑块破裂，取腹主动脉行病理形态学观察和基质金属蛋白酶9（MMP-9）、巨噬细胞、胶原的免疫组织化学分析，Westernblot法测定主动脉斑块内MMP-9蛋白表达。结果模型组9个主动脉血管标本中有7个标本共12处发生斑块破裂及血栓形成，干预组lO个标本中有2个标本3处发生斑块破裂，两组斑块破裂数量差异有统计学意义（P〈0．05），正常组中未见斑块破裂及血栓形成；干预组斑块内MMP-9面积比较模型组显著降低（12．35％±4．28％比32．58％±9．16％，P〈0．05）；干预组斑块内巨噬细胞面积比较模型组显著降低（13．87％±4．91％比23．8％±7．45％，P〈0．05）；干预组斑块内胶原面积比较模型组显著增加（30．27％±11．36％比4．18％±1．28％，P〈0．01）；干预组斑块中MMP-9蛋白表达水平较模型组明显降低（P〈0．01）。结论坎地沙坦具有稳定斑块、预防斑块破裂的作用，其机制可能是坎地沙坦降低粥样斑块内MMP-9的表达、减少斑块内巨噬细胞聚集和增加斑块内胶原含量。

关键词：动脉粥样硬化基质金属蛋白酶9 巨噬细胞模型动物坎地沙坦

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长链非编码RNA Gm15577参与小鼠小脑神经元增殖与分化

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中华病理学杂志 2015年第7期44卷 504-508页

作者：岳永松张伟龙刘春英牛亚梅佟伟民中国医学科学院基础医学研究所神经科学中心北京协和医学院基础学院病理学系 100005 北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室

目的鉴定新的参与奈美亨综合征（NBS）小鼠模型中与小脑发育缺陷相关的长链非编码RNA（1ncRNA），并探讨其与小脑增殖分化相关的功能。方法利用芯片技术分析野生型（野生组，Nbsl^CNS-ctr）小鼠及Nbs1神经元特异性敲除（突变组，Nbsl^CN... 详细信息

目的鉴定新的参与奈美亨综合征（NBS）小鼠模型中与小脑发育缺陷相关的长链非编码RNA（1ncRNA），并探讨其与小脑增殖分化相关的功能。方法利用芯片技术分析野生型（野生组，Nbsl^CNS-ctr）小鼠及Nbs1神经元特异性敲除（突变组，Nbsl^CNS-ctr）小鼠小脑中RNA的表达差异；利用即时荧光定量PCR技术对芯片结果加以验证；针对目的RNA，检测其全身表达及小脑中表达模式、细胞内定位以及对母基因的表达调控模式。结果IncRNA Gm15577是由神经生长调节因子一1（Negrl）基因内部的内含子区反向转录而成，特异性表达于小脑，且在其发育过程中呈动态变化趋势，而Nbs1缺失之后整体表达水平显著降低；同时，与未分化期比较，分化后的小鼠小脑原代神经前体细胞中Gm15577及其母基因Negrl均有显著升高；Gm15577敲低之后导致Negr1以及小脑增殖分化相关因子Shh与β-catenin在RNA水平的表达显著下调；人髓母细胞瘤临床样本数据分析表明Negr1基因在正常人群与肿瘤患者之间有显著的表达差异。结论从神经特异性敲除Nbs1小鼠模型出发报道了一个新的与小鼠小脑发育相关的IncRNA Gm15577，初步结果表明Gm15577通过调控Negr1进而影响小脑神经元增殖与分化进程中的Shh与β—catenin信号通路，其基因行为异常有可能与髓母细胞瘤发病有一定的相关性。

关键词：小脑 Nbs1 细胞增殖细胞分化长链非编码RNA

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靶向HER2嵌合抗原受体修饰T细胞的构建及其特异性杀伤肿瘤的作用

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中华病理学杂志 2017年第10期46卷 714-720页

作者：唐海军刘玉琴卞晓翠冯海凉顾蓓孙昊左春霞周芳颖刘兢中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院病理学系细胞资源中心 100005 中国科学技术大学生命科学学院

目的以靶向HER2的人源化单克隆抗体H1．2scFv为基础构建第三代嵌合抗原受体（CAR），并探讨CAR修饰的T淋巴细胞（CAR—T）对HER2高表达肿瘤的杀伤作用。方法运用分子克隆方法将CAR的表达框和H1．2scFv装人慢病毒表达载体，利用慢病毒载... 详细信息

目的以靶向HER2的人源化单克隆抗体H1．2scFv为基础构建第三代嵌合抗原受体（CAR），并探讨CAR修饰的T淋巴细胞（CAR—T）对HER2高表达肿瘤的杀伤作用。方法运用分子克隆方法将CAR的表达框和H1．2scFv装人慢病毒表达载体，利用慢病毒载体将H1—2CAR基因转导至T淋巴细胞构建CAR．T细胞，通过酶联免疫吸附测定检测细胞因子白细胞介素2的表达，通过LDH释放实验检测CAR—T细胞杀伤肿瘤细胞的效率。最后用NOD／SCID小鼠移植瘤模型来检测CAR．T细胞在体内杀伤肿瘤细胞的能力。结果成功构建了靶向HER2的第三代嵌合抗原受体H1—2CAR表达载体，该载体转染的H1—2CAR—T细胞能与HER2’的肿瘤细胞结合并提高了细胞因子白细胞介素2的释放。在本研究中Hi一2CAR—T细胞与HER2高表达的肿瘤细胞相互作用时白细胞介素2分泌量可达到1000¨g／L以上，而外周血单个核细胞与肿瘤细胞相互作用时基本上不分泌白细胞介素2。在体外肿瘤细胞培养体系中，H1—2CAR—T细胞对HER2高表达肿瘤细胞的杀伤率明显高于HER2低／不表达的细胞。当效靶比为20：1时，H1—2CAR—T细胞对HER2高表达的乳腺癌细胞SK—BR-3的杀伤率可以达到（90．1±2．8）％．而H1．2CAR—T对HER2阴性的乳腺癌细胞MDA—MB-231的杀伤率只有（13．5±4．7）％。在NOD／SCID小鼠体内，CAR．T细胞治疗组乳腺癌移植瘤的生长速度减慢，实验结束时H1-2CAR—T细胞治疗组肿瘤质量平均为（0．74-0．1）g，未转染T细胞治疗组为（1．2±0．2）g，PBS组为（1．2±0．2）g。H1—2CAR—T治疗组与未转染T细胞治疗组相比较有明显差异（P〈0．05），而未转染T细胞治疗组与PBS治疗组相比差异无统计学意义（P〉0．05）。结论靶向HER2的H1．2CAR．T细胞能特异性杀伤HER2高表达的肿瘤细胞，为CAR—T靶向治疗HER2’的肿瘤提供了研究基础。

关键词：基因 erbB.2 T淋巴细胞分子靶向治疗

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小鼠髓母细胞瘤细胞系的建立与鉴定

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基础医学与临床 2009年第7期29卷 737-741页

作者：王月圆高云周汪兆琦沈岩佟伟民中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室德国耶纳07745 Leibniz衰老研究所德国耶纳07745 中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院病理学系德国耶纳07745 中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院实验动物中心北京100005

目的建立表达PARP-1和P53基因双缺失的小鼠髓母细胞瘤细胞系,为研究髓母细胞瘤(MB)发生机制提供细胞模型。方法对小鼠髓母细胞瘤细胞进行原代培养,体外传代观察,传代30次以上对培养细胞进行形态学观察及细胞标志性蛋白的免疫荧光分析,用... 详细信息

目的建立表达PARP-1和P53基因双缺失的小鼠髓母细胞瘤细胞系,为研究髓母细胞瘤(MB)发生机制提供细胞模型。方法对小鼠髓母细胞瘤细胞进行原代培养,体外传代观察,传代30次以上对培养细胞进行形态学观察及细胞标志性蛋白的免疫荧光分析,用Western blot法检测PARP-1蛋白的表达,用含有PARP-1蛋白功能区域的重组质粒pEGFP-C1-Hparp-1和绿色荧光蛋白空质粒pEGFP-C1转染细胞进行检测。结果新建立的小鼠髓母细胞瘤细胞系呈多角形、短梭形,免疫荧光分析可见未成熟神经元标志性蛋白Vimentin、Dcx、βⅢ-Tubulin等表达阳性,Western blot检测PARP-1蛋白阴性,导入外源PAPR-1基因后呈阳性。结论成功建立了DNA损伤修复蛋白功能缺陷的小脑神经源性髓母细胞瘤细胞系,有助于深入研究髓母细胞瘤的病因及发病机制。

关键词：基因敲除 PARP—I 髓母细胞瘤细胞神经标记物

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小鼠病毒性面神经炎模型中面神经元凋亡的研究

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中华耳鼻咽喉头颈外科杂志 2011年第9期46卷 742-746页

作者：刘稳高志强神平冯国栋查洋张彦东刘佩毛徐州医学院附属医院耳鼻咽喉科江苏省221002 中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院耳鼻咽喉科 100730 中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所病理学系

目的探讨1型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus type 1，HSV-1）性面神经炎动物模型中面神经运动神经元（facial motor neurons，FMN）的凋亡情况以及凋亡相关基因bcl-2和bax的表达。方法Balb／c小鼠84只，分别进行HSV-1接种和面神经... 详细信息

目的探讨1型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus type 1，HSV-1）性面神经炎动物模型中面神经运动神经元（facial motor neurons，FMN）的凋亡情况以及凋亡相关基因bcl-2和bax的表达。方法Balb／c小鼠84只，分别进行HSV-1接种和面神经切断处理。在操作后第1、3、7、10、15、20及30天分批处死动物，对面神经核进行HE染色、尼氏染色；采用原位末端转移酶标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling, TUNEL）技术检测FMN的凋亡；免疫组化染色检测凋亡相关基因bcl-2和bax在FMN中的表达。结果面神经切断后，同侧FMN出现凋亡，在第10、15天达高峰，Bcl-2表达降低，Bax表达升高，Bcl-2／Bax比值下降；接种病毒后，同侧FMN没有明显的细胞凋亡，Bcl-2表达增高，在第15天达高峰，Bcl-2／Bax比值上升。结论小鼠面神经接种HSV-1后FMN没有明显凋亡，可能与神经损伤程度轻以及HSV-1抑制宿主细胞凋亡有关，Bcl-2、Bax可能参与调控FMN的凋亡。

关键词：疱疹病毒1型,人 Bell麻痹运动神经元细胞凋亡 bcl-2相关X蛋白质疾病模型,动物

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4.1B 基因降低乳腺癌细胞系MDA-MB-231侵袭能力

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中华病理学杂志 2011年第2期40卷 108-109页

作者：安超陈勃孙翠翠杜红禹高志安辽宁医学院病理学教研室第一附属医院病理科锦州121001 中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所细胞生物学系

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,其发生侵袭转移的具体机制仍不清楚.4.1蛋白超家族是一组和红细胞膜蛋白4.1R结构类似的蛋白质.我们将4.1B基因稳定整合到4.1B 缺失的乳腺癌细胞系MDA-MB-231,探讨其对乳腺癌细胞增殖和侵袭能力的影响.

关键词： MDA-MB-231 乳腺癌细胞系侵袭能力 B基因红细胞膜蛋白癌细胞增殖恶性肿瘤侵袭转移

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载有槲皮素的PEG-PE胶束对乳腺癌细胞耐药性的逆转效应

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基础医学与临床 2015年第2期35卷 174-177页

作者：吴金花段金虹许海燕杨先达中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所病理学与病理生理学系北京100005 中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所生物医学工程学系北京100005

目的探索载有槲皮素的PEG-PE聚合物胶束(M-Q)能否在体外逆转耐阿霉素人乳腺癌细胞(MCF-7 ADRr)的耐药性。方法将PEG-PE聚合物与槲皮素混合制备脂膜,加0.9%氯化钠注射液形成胶束,用动态光散射粒径仪表征其尺寸分布,并将其和阿霉素与MCF-7... 详细信息

目的探索载有槲皮素的PEG-PE聚合物胶束(M-Q)能否在体外逆转耐阿霉素人乳腺癌细胞(MCF-7 ADRr)的耐药性。方法将PEG-PE聚合物与槲皮素混合制备脂膜,加0.9%氯化钠注射液形成胶束,用动态光散射粒径仪表征其尺寸分布,并将其和阿霉素与MCF-7 ADRr细胞共孵育72 h,用MTS方法检测对肿瘤细胞的杀伤率。结果PEG-PE聚合物胶束能有效运载槲皮素,其包封率高达74%以上,平均粒径为11.11 nm左右,与游离槲皮素相比,M-Q能在体外更大程度地逆转MCF-7 ADRr细胞对于阿霉素的耐药性(P<0.05),且PEG-PE胶束自身对靶细胞无明显杀伤作用。结论载有槲皮素的PEG-PE胶束在逆转肿瘤耐药性方面具有应用潜能。

关键词： PEG-PE 胶束槲皮素 MCF-7 ADRr细胞

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