检索结果-内蒙古大学图书馆

基础医学与临床 2018年第12期38卷 1702-1707页

作者：朱基彦瞿思遥张祝琴刘德培中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室生物化学与分子生物学系北京100005

目的利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统构建针对人肝豆状核变性R778L突变类型的R780L突变小鼠。方法通过BLAST比对人和小鼠中ATP7B基因和蛋白的序列,证明二者保守性。通过CRISPR/Cas9系统进行小鼠受精卵显微注射,并对小鼠肝豆状核变性... 详细信息

目的利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑系统构建针对人肝豆状核变性R778L突变类型的R780L突变小鼠。方法通过BLAST比对人和小鼠中ATP7B基因和蛋白的序列,证明二者保守性。通过CRISPR/Cas9系统进行小鼠受精卵显微注射,并对小鼠肝豆状核变性症状进行病理和生理学检测。结果人和小鼠中ATP7B基因和蛋白的序列高度保守。通过CRISPR/Cas9技术成功获得纯合的R780L突变小鼠,该小鼠存在明显的肝脏铜离子淤积以及血清ALT、AST的升高且未发现有可检测出的脱靶效应。结论成功利用CRISPR/Cas9介导的基因敲入系统构建了针对人肝豆状核变性R778L类型的R780L突变小鼠模型。

关键词：肝豆状核变性 CRISPR/Cas9 点突变R778L 小鼠模型

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Zika病毒NS3具有依赖于ATP水解的dsDNA解链活性

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基础医学与临床 2018年第5期38卷 674-678页

作者：徐杉王蕾杰石磊中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的研究Zika病毒NS3蛋白是否具有依赖于ATP水解的ds DNA解链活性。方法构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21菌株中表达带有His标签的Zika NS3蛋白,并用Ni琼脂糖珠进行纯化;利用ATPase检测试剂盒对NS3的ATP水解活性进行检测;利用荧光共振... 详细信息

目的研究Zika病毒NS3蛋白是否具有依赖于ATP水解的ds DNA解链活性。方法构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21菌株中表达带有His标签的Zika NS3蛋白,并用Ni琼脂糖珠进行纯化;利用ATPase检测试剂盒对NS3的ATP水解活性进行检测;利用荧光共振能量转移(FRET)原理,对NS3的ds DNA解链活性进行实时动力学检测;利用定点突变方法将NS3蛋白的第198位甘氨酸(G)突变为丙氨酸(A),得到G198A突变体,检测其是否影响NS3解旋酶活性。结果 Zika NS3蛋白在体外可以水解ATP,酶解最大反应速率为2.76μmol/(L·min),Km值为0.11 mmol/L;Zika NS3蛋白在体外可以解链ds DNA;G198A突变体与野生型相比,ATP水解速率和ds DNA的解链速率均明显减弱。结论 Zika NS3蛋白在体外具有ATP水解活性以及ds DNA解链活性,且第198位甘氨酸对于NS3酶活性至关重要。

关键词： Zika病毒 NS3蛋白 ATP dsDNA 解旋酶

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基于微小RNA架构的新型随机短发夹RNA文库构建

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中国医学科学院学报 2017年第4期39卷 518-524页

作者：郭倩朱宁卜萌萌郭思超闫雪静陈倩陈梅红中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础医学院生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的构建高效发夹状随机短发夹RNA(shRNA)文库。方法构建由polⅡ启动子(CMV)驱动的增强绿色荧光蛋白(EGFP)下游连接shRNA的表达载体,转染细胞后收取蛋白,用Western blot和荧光素酶报告基因系统检测该载体表达的shRNA对靶基因表达的抑制... 详细信息

目的构建高效发夹状随机短发夹RNA(shRNA)文库。方法构建由polⅡ启动子(CMV)驱动的增强绿色荧光蛋白(EGFP)下游连接shRNA的表达载体,转染细胞后收取蛋白,用Western blot和荧光素酶报告基因系统检测该载体表达的shRNA对靶基因表达的抑制效率。在由CMV启动的EGFP下游连接shRNA的表达载体基础上,构建EGFP下游连接基于微小RNA(miRNA)架构的shRNA表达载体,转染细胞后收取RNA,用实时定量荧光PCR法检测该载体表达的shRNA对靶基因表达的抑制效果。基于EGFP下游连接基于miRNA架构的shRNA表达载体实时定量荧光PCR的检测结果,构建基于miRNA架构的大容量随机shRNA文库。结果由polⅡ启动子(CMV)驱动发夹状shRNA转录时,shRNA要位于一个大的转录本之后才能被有效转录。基于miRNA架构环境可提高shRNA的干扰效率。构建了一个容量为1.8×10~7的基于miRNA架构的大容量随机shRNA文库。结论构建了一个大容量的新型随机shRNA文库。

关键词：微小RNA 短发夹RNA 随机文库

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Dysbindin-1B^(+/+)小鼠海马凋亡及认知功能

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中国医学科学院学报 2017年第3期39卷 307-311页

作者：杨微许琪中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的观察人源特异性表达dysbindin-1B^(+/+)(dys1B)小鼠的组织学及行为学表现。方法建立dys1B转基因小鼠,采用TUNEL法检测野生型(WT)和dys1B小鼠海马脑区凋亡情况,并在电镜下观察WT和dys1B小鼠海马区的凋亡情况,旷场实验和T迷宫实验观... 详细信息

目的观察人源特异性表达dysbindin-1B^(+/+)(dys1B)小鼠的组织学及行为学表现。方法建立dys1B转基因小鼠,采用TUNEL法检测野生型(WT)和dys1B小鼠海马脑区凋亡情况,并在电镜下观察WT和dys1B小鼠海马区的凋亡情况,旷场实验和T迷宫实验观测小鼠在新环境中的自主活动能力、焦虑程度及空间记忆能力。结果 dys1B小鼠海马区神经元凋亡率明显高于WT小鼠(t=12.98,P<0.0001),且在电镜下有凋亡中期和晚期表现。旷场实验结果显示,dys1B小鼠的总运动距离为(2887±376)cm,明显低于WT小鼠的(3632±606)cm(t=2.993,P=0.0122);中心活动时间为(64.22±14.67)s,明显少于WT小鼠的(114.00±34.09)s(t=4.649,P=0.0023)。T迷宫实验结果显示,forced run与test run间隔60和180 s时,dys1B小鼠的正确率分别为(70.40±15.17)%和(59.28±9.10)%,明显低于WT小鼠的(91.67±13.94)%(t=3.261,P=0.0258)和(83.33±14.89)%(t=3.687,P=0.0291);间隔15 s时,dys1B小鼠和WT小鼠的正确率差异无统计学意义[100%比(94.45±6.08)%;t=0.851,P=0.0756]。结论 dys1B表达可引起小鼠海马区细胞凋亡并可导致自主活动能力降低,焦虑程度增加,空间记忆能力障碍。

关键词： dysbindin-1 细胞凋亡自主活动焦虑程度认知障碍

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低氧微环境下胶质瘤干细胞表型的改变与RNA结合蛋白相关

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基础医学与临床 2018年第6期38卷 793-797页

作者：李珊珊胡佩珊韩为彭小忠中国医学科学院基础医学研究所、北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室、生物化学与分子生物学系医学灵长类研究中心神经科学中心北京100005

目的研究低氧微环境下胶质瘤干细胞表型变化与RNA结合蛋白表达之间的关系。方法 1%O_2的低氧条件培养胶质瘤干细胞U87MG-SLC和GSC5,20%O_2为常氧对照。分别利用MTS实验和肿瘤球形成实验检测其增殖能力和自我更新能力;Western blot检测... 详细信息

目的研究低氧微环境下胶质瘤干细胞表型变化与RNA结合蛋白表达之间的关系。方法 1%O_2的低氧条件培养胶质瘤干细胞U87MG-SLC和GSC5,20%O_2为常氧对照。分别利用MTS实验和肿瘤球形成实验检测其增殖能力和自我更新能力;Western blot检测干性相关蛋白和RNA结合蛋白表达水平的变化;通过吸光度扫描进行统计分析。结果低氧条件下肿瘤干细胞的增殖能力下降(P<0.05),自我更新能力上升(P<0.05),HIF-1α和干性标志物Nestin和SOX2上调(P<0.01;P<0.05)。与常氧组相比,低氧组胶质瘤干细胞的多种RNA结合蛋白表达水平发生变化:hnRNPF、UNRIP以及Hu D表达水平上调(P<0.05),PCBP2和UNR表达水平下调(P<0.01;P<0.05),而其他RNA结合蛋白(hnRNPK、ADAR1、PCBP1、CIRP、EBP1、e EF1A、PTBP1、PTBP2)表达水平没有显著性变化。结论低氧微环境下,胶质瘤干细胞的表型变化与RNA结合蛋白hnRNPF、UNRIP、Hu D、PCBP2和UNR表达水平相关。

关键词：低氧胶质瘤干细胞 RNA结合蛋白增殖自我更新

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CRISPR/Cas9基因编辑系统研究进展

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基础医学与临床 2018年第4期38卷 543-547页

作者：程成舒鹏程彭小忠中国医学科学院北京协和医学院北京100005 中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室中国医学科学院医学灵长类研究中心神经科学中心北京100005

CRISPR/Cas9基因编辑系统被广泛应用于生物学及医学各领域。该系统可在RNA的引导下对特定DNA位点进行靶向编辑。脱靶效应和编辑效率是该系统面临的两大问题。目前已有诸多研究从减少脱靶效应和提高编辑效率的方面对该系统进行优化,将有... 详细信息

CRISPR/Cas9基因编辑系统被广泛应用于生物学及医学各领域。该系统可在RNA的引导下对特定DNA位点进行靶向编辑。脱靶效应和编辑效率是该系统面临的两大问题。目前已有诸多研究从减少脱靶效应和提高编辑效率的方面对该系统进行优化,将有助于其安全性的提升及应用范围的拓展。

关键词： CRISPR/Cas9 基因编辑脱靶效应编辑效率

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miR-130b促进小鼠胚胎发育过程中大脑皮质神经元的迁移

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基础医学与临床 2017年第7期37卷 959-962页

作者：刘佳辰许琪中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院国家医学分子生物学重点实验室生物化学与分子生物学系北京100005

目的通过胚胎在体电转染技术,在胚胎小鼠大脑皮质神经元中过表达miR-130b,探讨其对神经元迁移的影响。方法利用miR-130b过表达载体,在昆明小鼠E15.5胚胎大脑中电转染,并于E17.5处死母鼠,取胚胎进行冰冻切片,于荧光显微镜下观察阳性神经... 详细信息

目的通过胚胎在体电转染技术,在胚胎小鼠大脑皮质神经元中过表达miR-130b,探讨其对神经元迁移的影响。方法利用miR-130b过表达载体,在昆明小鼠E15.5胚胎大脑中电转染,并于E17.5处死母鼠,取胚胎进行冰冻切片,于荧光显微镜下观察阳性神经元的迁移情况。结果过表达miR-130b的小鼠胚胎,大脑皮质神经元的迁移速率上升,最终迁移到达MZ层的神经元占总阳性神经元的75.1%,远高于对照组的22.1%;且停留在VZ/SVZ层的神经元(7.9%)远低于对照组(69.3%)。结论 miR-130b在神经发育过程中能够促进神经元的迁移。在未来的研究中需要进一步探索其深层机制。

关键词： miR-130b 神经发育神经元迁移

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长链非编码RNA AK046999在小鼠大脑皮质发育中的表达及功能

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基础医学与临床 2017年第11期37卷 1513-1518页

作者：李嘉宁周俊洁刘伟彭小忠舒鹏程中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室生物化学与分子生物学系医学灵长类研究中心神经科学中心北京100005

目的检测长链非编码RNA AK046999在小鼠大脑皮质发育过程中的表达及作用。方法 1)通过UCSC基因组浏览器获取其基因组座位,利用Coding Potential Calculator工具对其编码能力进行预测;2)原位杂交及免疫荧光技术确定其在大脑皮质发育过程... 详细信息

目的检测长链非编码RNA AK046999在小鼠大脑皮质发育过程中的表达及作用。方法 1)通过UCSC基因组浏览器获取其基因组座位,利用Coding Potential Calculator工具对其编码能力进行预测;2)原位杂交及免疫荧光技术确定其在大脑皮质发育过程中的表达谱;3)TALEN技术构建AK046999完全敲除小鼠,并且在DNA及RNA水平对其进行敲除鉴定;4)免疫荧光及TUNEL技术对敲除小鼠大脑皮质在发育过程的功能进行检测。结果 1)AK046999可认为是非编码RNA(Coding Potential Score<-1);2)AK046999在小鼠大脑皮质发育过程中,前体区相对高表达;3)成功构建了AK046999敲除小鼠;4)与对照相比,AK046999敲除小鼠中表达PAX6、TBR2和NEUROD2的细胞数量无明显改变,并且在这两组小鼠中凋亡细胞的数量无明显改变。结论 AK046999在发育期的小鼠大脑皮质表达,但敲除后不影响小鼠大脑皮质中神经祖细胞的增殖、分化和细胞凋亡过程。

关键词： AK046999 长链非编码RNA 时空表达谱大脑皮质发育

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寨卡病毒NS4A蛋白影响小鼠大脑皮质神经元的迁移

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基础医学与临床 2017年第7期37卷 988-993页

作者：韦智钟阴彬彭小忠刘伟中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室生物化学与分子生物学系医学灵长类研究中心神经科学中心北京100005

目的在体研究寨卡病毒(Zika virus)NS3和NS4A蛋白对大脑皮质神经元迁移的影响。方法通过c DNA末端快速扩增技术(RACE)及反转录PCR测定Zika病毒SZ01株基因组的开放阅读框,确定NS3和NS4A蛋白编码序列,构建融合Flag标签的p CIG蛋白表达载... 详细信息

目的在体研究寨卡病毒(Zika virus)NS3和NS4A蛋白对大脑皮质神经元迁移的影响。方法通过c DNA末端快速扩增技术(RACE)及反转录PCR测定Zika病毒SZ01株基因组的开放阅读框,确定NS3和NS4A蛋白编码序列,构建融合Flag标签的p CIG蛋白表达载体。通过子宫内电转技术在E13.5 d小鼠的大脑皮质的神经前体细胞中表达病毒蛋白。免疫组化检测Flag标签、TBR1与e GFP,观察表达NS3和NS4A蛋白的细胞在E18.5 d大脑皮质中的分布,评估Zika病毒蛋白对大脑皮质神经元迁移的影响。结果 1)NS4A的氨基酸序列与NCBI数据库一致,NS3存在1处氨基酸位点突变。2)Flag标签荧光信号与e GFP荧光共定位,提示e GFP可以指示病毒蛋白在皮质中的表达。3)TBR1荧光显示在体表达NS4A后,神经元的分布与p CIG对照组及表达NS3相比有显著差异(P<0.001)。结论在体表达Zika病毒的NS4A蛋白可能影响神经元迁移。

关键词：寨卡病毒 NS4A蛋白子宫内电转神经元迁移

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CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白与钙联蛋白在内侧颞叶癫痫模型小鼠海马中的表达

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中国医学科学院学报 2016年第3期38卷 265-270页

作者：沙志强沙龙泽许琪中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的观察CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)及钙联蛋白(CNX)在内侧颞叶癫痫小鼠海马区域中表达的时间和空间分布。方法采用海人酸(KA)诱导内侧颞叶癫痫小鼠模型,免疫印迹和免疫荧光技术检测CHOP和CNX在急性期(12、24 h)小鼠海马CA3区... 详细信息

目的观察CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)及钙联蛋白(CNX)在内侧颞叶癫痫小鼠海马区域中表达的时间和空间分布。方法采用海人酸(KA)诱导内侧颞叶癫痫小鼠模型,免疫印迹和免疫荧光技术检测CHOP和CNX在急性期(12、24 h)小鼠海马CA3区的表达量及分布差异,并与注射PBS的正常小鼠进行对照。结果免疫印迹检测结果显示,KA注射后12 h小鼠海马中的CHOP(F=1.136,P=0.4069)和CNX表达量(F=2.378,P=0.2087)与对照组差异没有统计学意义,KA注射后24 h注射侧海马中的CHOP(F=8.510,P=0.0362)和CNX表达量(F=6.968,P=0.0497)明显高于对照组。免疫荧光结果显示,KA注射后12 h CHOP的表达主要集中于CA3区,注射后24 h在CA1和CA3区表达水平均升高;KA注射后24 h CHOP蛋白(F=24.480,P=0.0057)和CNX蛋白(F=7.149,P=0.0478)的表达量显著高于对照组。结论伴随着癫痫发作的产生,CHOP蛋白表达量上升,提示神经元内质网应激水平不断增加,可能需要更多CNX作为分子伴侣帮助更多未折叠蛋白完成折叠过程。

关键词：内侧颞叶癫痫内质网应激 CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白钙联蛋白

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