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基础医学与临床 2022年第5期42卷 763-767页

作者：王志荣张婷许雪梅中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物物理及结构生物学系北京100005

目的探索利用昆虫杆状病毒表达系统(IBEVS)表达的重组人乳头瘤病毒(HPV)58型主要衣壳蛋白L1病毒样颗粒(VLP)的简单可行的层析分离方法。方法收集高水平表达HPV-58 L1的昆虫细胞并制备裂解上清,建立硫酸铵沉淀(ASP)联合层析法纯化L1蛋白... 详细信息

目的探索利用昆虫杆状病毒表达系统(IBEVS)表达的重组人乳头瘤病毒(HPV)58型主要衣壳蛋白L1病毒样颗粒(VLP)的简单可行的层析分离方法。方法收集高水平表达HPV-58 L1的昆虫细胞并制备裂解上清,建立硫酸铵沉淀(ASP)联合层析法纯化L1蛋白的最佳条件,对纯化后的蛋白进行体外组装。对L1蛋白的纯化各个阶段中的组分、最终产品(纯品蛋白)及组装状态进行理化性质鉴定,分析其免疫原性。结果30%饱和硫酸铵(AS)分级分离后,L1蛋白得率为72%,纯度为9.34%;阴离子交换层析经300 mmol/L NaCl缓冲液洗脱后,L1蛋白得率>90%,纯度为13.6%;进一步经羟基磷灰石层析收获流穿液后,L1蛋白得率>80%,宿主蛋白质残留(HCPs)分析和L1蛋白的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色显示蛋白纯度>99%。经上述3步分离纯化的L1蛋白,其总得率为55.7%,每升细胞悬浮培养液(约3.0×10^(9)个细胞)产量为57~65 mg。动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)分析显示,L1蛋白组装成了形状均一、直径约55 nm的VLPs。该法制备HPV-58 L1 VLPs诱导小鼠免疫系统产生的中和抗体水平与超离法制备的相当。结论本研究所建立的HPV58-L1 VLPs分离纯化方法是一套具有蛋白得率高、活性好,且操作简单等特点的成熟方案,为利用IBEVS生产成本低的HPV多价预防性疫苗奠定基础。

关键词：人乳头瘤病毒58型主要衣壳蛋白L1 病毒样颗粒(VLP) 昆虫细胞纯化

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CLIP-PCR直接检测血液中疟原虫雌性配子体特异转录产物s25 mRNA

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基础医学与临床 2022年第1期42卷 139-144页

作者：杨珺源骈红茹杨明珠郑直中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系北京100005

目的建立一种疟原虫雌性配子体的分子检测法。方法根据疟原虫雌性配子体特异性mRNA靶标(待测靶序列)即动合子表面蛋白(s25)的转录产物,设计特异性的捕获探针和连接探针。血液样品经裂解释放的mRNAs,无需核酸提取,通过“三明治”杂交被... 详细信息

目的建立一种疟原虫雌性配子体的分子检测法。方法根据疟原虫雌性配子体特异性mRNA靶标(待测靶序列)即动合子表面蛋白(s25)的转录产物,设计特异性的捕获探针和连接探针。血液样品经裂解释放的mRNAs,无需核酸提取,通过“三明治”杂交被捕获到96孔板表面。洗去未结合探针后,将结合在mRNA靶标上的连接探针进行连接,得到两端为特殊设计序列的单链扩增模板。再用通用引物进行染料法qPCR扩增,或在端部设计TaqMan探针序列,用通用引物和通用TaqMan探针进行探针法qPCR扩增。评价这一基于捕获和连接扩增的方法(CLIP-PCR)的灵敏度、特异性和重复性并与普通的RT-qPCR方法进行比较,将其应用于临床样品的检测。结果该CLIP-PCR具有较高的灵敏度和特异性。与普通的RT-qPCR一样,均可检测低至11拷贝数的s25 mRNA靶标;而且该CLIP-PCR操作更简便。该CLIP-PCR可准确检测到疟疾患者血液中的雌性配子体。可将96个样品的检测时间缩短至3 h。结论建立了灵敏高效的染料法和通用TaqMan探针法CLIP-PCR检测疟原虫雌性配子体,为疟疾传播的控制、配子体大规模筛查奠定了基础。

关键词：疟原虫配子体检测方法捕获连接

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兔抗鼠MORF4L1 a多克隆抗体的制备与鉴定

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基础医学与临床 2022年第5期42卷 726-731页

作者：李芳章元张业中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系北京100005 中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院神经外科北京100730

目的制备兔抗鼠MORF4L1 a变体的多克隆抗体以区分MORF4L1的a、b变体。方法根据对小鼠MORF4L1 a、b变体差异序列的抗原性、同源性的分析结果,合成MORF4L1 a的N端第52~66位的序列作为抗原肽(15肽,KSAVRPRRSEKSLKT),偶联KLH载体作为抗原免... 详细信息

目的制备兔抗鼠MORF4L1 a变体的多克隆抗体以区分MORF4L1的a、b变体。方法根据对小鼠MORF4L1 a、b变体差异序列的抗原性、同源性的分析结果,合成MORF4L1 a的N端第52~66位的序列作为抗原肽(15肽,KSAVRPRRSEKSLKT),偶联KLH载体作为抗原免疫家兔,用Dot blot鉴定抗血清的特异性。对特异性良好的1号家兔抗血清进行抗原亲和层析纯化,用间接ELISA测定抗体效价。此外,构建MORF4L1 a、b变体的原核表达质粒和真核表达质粒。利用原核表达系统表达纯化后和在细胞中表达的MORF4L1 a、b蛋白进行Western blot鉴定抗体的特异性。结果1号免疫兔抗血清能特异性识别多肽;纯化后抗体的效价达到1∶512000;成功构建pGEX-4T-2-M4S、pGEX-4T-2-M4L原核表达质粒和pCMV-3Tag-6-M4S、pCMV-3Tag-6-M4L真核表达质粒,并在原核系统和真核系统中成功表达。该抗体能与MORF4L1 a特异结合。结论成功制备了效价高、特异性较强的兔抗鼠MORF4L1 a抗体,为进一步揭示MORF4L1可变剪接的生物学意义和不同变体的生物学功能奠定了实验基础。

关键词： MORF4L1 多克隆抗体变体

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敲除基因Pabpc6对雄性小鼠精子发生的影响

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基础医学与临床 2023年第4期43卷 560-567页

作者：汤洁琳柳俊邹定峰缪时英宋伟李凯中国医学科学院基础医学研究所、北京协和医学院基础学院、生物化学与分子生物学系、医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的探究小鼠细胞质多聚腺苷酸结合蛋白-6(PABPC6)在雄性小鼠精子发生中的作用。方法利用CRISPR/Cas9靶向敲除C57BL/6J小鼠基因Pabpc6,通过PCR鉴定Pabpc6的敲除情况。通过交配繁殖得到Pabpc6^(+/+)、Pabpc6^(+/-)、Pabpc6^(-/-)3种不同... 详细信息

目的探究小鼠细胞质多聚腺苷酸结合蛋白-6(PABPC6)在雄性小鼠精子发生中的作用。方法利用CRISPR/Cas9靶向敲除C57BL/6J小鼠基因Pabpc6,通过PCR鉴定Pabpc6的敲除情况。通过交配繁殖得到Pabpc6^(+/+)、Pabpc6^(+/-)、Pabpc6^(-/-)3种不同基因型的小鼠,进行睾丸称重、形态学观察和精子计数。RT-qPCR和Western blot检测不同组织中Pabpc6在mRNA和蛋白的表达水平;通过免疫荧光和苏木精-伊红染色观察该基因的定位以及睾丸曲细精管内部形态学变化。结果成功鉴定出敲除Pabpc6的小鼠;Pabpc6在睾丸组织中高表达(P<0.001)。免疫荧光显示该基因主要表达于精母细胞和早期精子阶段,基因敲除小鼠与野生型小鼠相比在睾丸外形、精子形态、精子数量和曲细精管内部形态上没有明显差异。结论Pabpc6在小鼠睾丸组织中高表达,敲除该基因后对雄性小鼠的精子发生无明显影响,说明该基因所编码的蛋白对于小鼠精子发生过程可能是非必需的。

关键词：精子发生 PABPC6 雄性生殖

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CLOCK氧化还原修饰介导内源性H_(2)O_(2)对小鼠细胞呼吸的调节作用

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基础医学与临床 2023年第5期43卷 745-750页

作者：常薇薇李勋凯张祝琴陈厚早刘德培中国医学科学院基础医学研究所、北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室生物化学与分子生物学系北京100005

目的探究生物钟核心转录因子昼夜节律运动输出周期蛋白(CLOCK)介导内源性过氧化氢(H_(2)O_(2))对细胞呼吸的调节作用和机制。方法利用Seahorse细胞能量代谢分析仪检测Clock^(C195S)小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)和成体成纤维细胞(MAFs)细胞... 详细信息

目的探究生物钟核心转录因子昼夜节律运动输出周期蛋白(CLOCK)介导内源性过氧化氢(H_(2)O_(2))对细胞呼吸的调节作用和机制。方法利用Seahorse细胞能量代谢分析仪检测Clock^(C195S)小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)和成体成纤维细胞(MAFs)细胞氧耗能力和糖酵解能力;通过q-PCR检测细胞呼吸关键代谢酶基因表达水平;MEFs进行抗氧化剂Trolox处理后,用Amplex■ Red试剂盒检测内源性H_(2)O_(2)的含量,并通过生物素碘乙酰胺(BIAM)探针标记检测CLOCK蛋白氧化还原修饰的改变,进一步检测处理后的细胞氧耗能力和细胞呼吸关键代谢酶基因表达水平。结果Clock^(C195S)细胞氧耗能力和糖酵解能力下降,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)合成关键酶烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(NMNAT2)表达降低(P<0.05),NAD含量下降;Trolox处理导致细胞内源性H_(2)O_(2)含量降低,Clock wt MEFs氧耗能力降低而Clock^(C195S) MEFs变化无统计学意义。结论CLOCK蛋白可以通过195位点半胱氨酸氧化还原修饰介导内源性H_(2)O_(2)对细胞呼吸的调节作用。

关键词：细胞呼吸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)合成 CLOCK氧化还原修饰

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河北省汉族和满族成人高血压家族史与超重/肥胖对高血压发病的交互作用

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基础医学与临床 2023年第7期43卷 1053-1059页

作者：蒋晨晨崔泽潘利孙纪新何慧婧胡耀达单广良中国医学科学院基础医学研究所、北京协和医学院基础学院流行病与卫生统计学系北京100005 河北省疾病预防控制中心河北石家庄050000

目的探讨河北省汉族和满族成人高血压家族史、超重/肥胖以及二者的交互作用对高血压发病的影响,为河北省预防和控制高血压提供参考依据。方法于2017年7~8月在河北省采用多阶段分层整群抽样的方法对河北省4633名20~80岁汉族和满族进行横... 详细信息

目的探讨河北省汉族和满族成人高血压家族史、超重/肥胖以及二者的交互作用对高血压发病的影响,为河北省预防和控制高血压提供参考依据。方法于2017年7~8月在河北省采用多阶段分层整群抽样的方法对河北省4633名20~80岁汉族和满族进行横断面调查,包括问卷调查和体格检查。采用多因素非条件Logistic回归模型分析高血压家族史和超重/肥胖对高血压的作用。结果在校正了民族、性别、年龄、城乡、收入、教育程度、吸烟、饮酒、身体锻炼和体力劳动后,有高血压家族史人群患高血压的风险是无高血压家族史人群的3.60倍(95%CI:2.51~5.18),超重/肥胖人群患高血压的风险是非超重/肥胖人群的2.90倍(95%CI:1.92~4.37),二者同时存在时患高血压的风险是二者皆不存在时的9.78倍(95%CI:6.86~13.95)。交互作用超额相对危险度(RERI)为4.28(95%CI:2.59~5.96),交互作用指数(SI)为1.95(95%CI:1.54~2.47),交互作用归因比(AP)为0.44(95%CI:0.33~0.54)。结论高血压家族史和超重/肥胖均与高血压患病风险增加有关,二者存在正向的加法交互作用。

关键词：高血压家族史超重/肥胖交互作用

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基因Cdca2敲除对小鼠精子发生和生育力无明显影响

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基础医学与临床 2023年第5期43卷 717-723页

作者：柳俊邹定峰缪时英宋伟李凯中国医学科学院基础医学研究所、北京协和医学院基础学院、生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的探究睾丸高表达细胞分裂周期相关蛋白2基因(Cdca2)在小鼠精子发生和生育力中的生理功能。方法通过Q-PCR和Western blot检测Cdca2在小鼠不同组织部位的表达情况;利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和Cre-loxP介导的重组系统构建Cdca2组织... 详细信息

目的探究睾丸高表达细胞分裂周期相关蛋白2基因(Cdca2)在小鼠精子发生和生育力中的生理功能。方法通过Q-PCR和Western blot检测Cdca2在小鼠不同组织部位的表达情况;利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和Cre-loxP介导的重组系统构建Cdca2组织特异性敲除的小鼠品系;通过苏木精-伊红(HE)染色和形态学分析了解小鼠CDCA2缺失对精子发生的各个阶段生精细胞形态的影响;通过精子全自动检测分析系统检测小鼠CDCA2缺失对精子活率及运动参数的影响;通过生育力测试实验检测CDCA2缺失对雄性小鼠生育能力的影响。结果Cdca2是一个睾丸高表达的基因;利用CRISPR/Cas9技术和生殖系统特异性Cre的工具鼠,成功获得了Cdca2生殖细胞特异性敲除的小鼠;小鼠CDCA2缺失对精子发生中各阶段生精细胞、精子运动参数及雄性生育能力的影响改变无统计学意义。结论基因Cdca2对于小鼠精子发生和雄性生育力的维持可能是非必需的。

关键词：细胞分裂周期相关蛋白2(CDCA2) RNA结合蛋白生殖细胞生育力精子发生

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烯醇化酶1通过影响mRNA定位调节人胚胎干细胞自我更新能力

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基础医学与临床 2023年第6期43卷 867-874页

作者：赫佳音杨嘉宾陈仲扬马艳妮余佳中国医学科学院基础医学研究所、北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系、医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的探究烯醇化酶1(ENO1)的表达对维持人胚胎干细胞(hESCs)自我更新能力的影响,并揭示其机制。方法预测与ENO1结合的RNA和蛋白质,并进行GO富集分析。在hESCs中通过shRNA抑制ENO1内源表达,集落形成实验及碱性磷酸酶染色(AP)检测hESCs的... 详细信息

目的探究烯醇化酶1(ENO1)的表达对维持人胚胎干细胞(hESCs)自我更新能力的影响,并揭示其机制。方法预测与ENO1结合的RNA和蛋白质,并进行GO富集分析。在hESCs中通过shRNA抑制ENO1内源表达,集落形成实验及碱性磷酸酶染色(AP)检测hESCs的集落形成能力,荧光定量PCR检测hESCs的多能性及分化标志基因的表达变化,RNA荧光原位杂交技术检测带有polyA尾的RNA的定位变化。结果抑制ENO1的内源表达后,hESCs的集落形成能力得到了显著抑制(P<0.05),同时分化标志基因表达水平升高(P<0.001),带polyA尾的RNA的定位由分散在细胞质中变为集中在核内(P<0.001)。结论ENO1通过影响mRNA在细胞内的定位调控hESCs自我更新能力。

关键词：人胚胎干细胞烯醇化酶1 RNA结合蛋白多能性 mRNA定位

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富媒体导课法在人体寄生虫学教学中的应用

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寄生虫与医学昆虫学报 2021年第1期28卷 61-66页

作者：魏春燕王振生张连惠王恒中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院病原学系北京100005

为探讨富媒体导课(Rich-media Based Lead-in,RBL)教学法在临床医学专业人体寄生虫学教学中的应用效果,选取北京协和医学院2017级临床医学专业的86名学生作为研究对象,将RBL教学法应用于人体寄生虫学课程部分章节教学中,通过问卷调查评... 详细信息

为探讨富媒体导课(Rich-media Based Lead-in,RBL)教学法在临床医学专业人体寄生虫学教学中的应用效果,选取北京协和医学院2017级临床医学专业的86名学生作为研究对象,将RBL教学法应用于人体寄生虫学课程部分章节教学中,通过问卷调查评价教学效果。学生的反馈结果显示,RBL教学法可提升学生对人体寄生虫学课程的兴趣,促进学生对所学内容的理解与掌握,有助于鼓励学生主动学习与独立思考,从而提高课堂教学效率和教学质量。结果表明,RBL教学法有助于提高课堂教学效率和教学质量,值得深入研究与推广。

关键词：人体寄生虫学富媒体导课教学法效果

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靶向BCMA的CAR-γδT细胞抗多发性骨髓瘤的疗效

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基础医学与临床 2024年第6期44卷 763-771页

作者：李盈辉许依张建民陈慧何维中国医学科学院基础医学研究所、北京协和医学院基础医学院免疫学系T细胞与免疫治疗重点实验室重大疾病共性机制研究全国重点实验室北京100005 常州西太湖细胞治疗前沿技术研究院江苏常州213000

目的构建靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体γδT细胞(BCMA CAR-γδT),在体外初步评价其抗多发性骨髓瘤的疗效。方法构建包含BCMA单链抗体序列的三代CAR分子的慢病毒载体,瞬时转染293T细胞,荧光显微镜和Western blot验证外源基因... 详细信息

目的构建靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体γδT细胞(BCMA CAR-γδT),在体外初步评价其抗多发性骨髓瘤的疗效。方法构建包含BCMA单链抗体序列的三代CAR分子的慢病毒载体,瞬时转染293T细胞,荧光显微镜和Western blot验证外源基因的表达情况;包装慢病毒,用流式细胞术测定病毒滴度;分别感染人外周血αβT细胞和γδT细胞,检测感染效率;LDH法检测BCMA CAR-γδT细胞对人多发性骨髓瘤细胞系的体外细胞毒活性,并用Incucyte实时细胞分析系统比较BCMA CAR-γδT细胞与BCMA CAR-T细胞的细胞毒活性差异。结果将BCMA-CAR慢病毒载体转入293T细胞24 h后,荧光显微镜观察到外源ZsGreen的表达;Western blot检测CD3ζ证明BCMA-CAR能顺利表达。慢病毒包装后,收集感染上清浓缩,测得病毒滴度为2.23×10^(8)Tu/mL。用MOI=5感染人外周血αβT细胞与γδT细胞,流式检测结果显示αβT细胞感染效率为59.18%±2.56%,γδT细胞感染效率为48.15%±9.86%。LDH杀伤实验结果显示,CAR-γδT细胞对BCMA高表达的人骨髓瘤细胞系MM1.S、H929和过表达BCMA的K562细胞的细胞毒活性较空载体对照γδT细胞显著增强(P<0.001),而对BCMA表达阴性的细胞系无差异;活细胞时程分析系统结果显示,BCMA CAR-γδT细胞与BCMA CAR-αβT细胞在体外对H929的细胞毒活性均显著优于其空载体对照细胞,且均对BCMA表达阴性的细胞系的细胞毒活性无差异。结论BCMA CAR-γδT细胞在体外显示出明显增强的靶向BCMA的细胞毒活性,有望作为新型同种异体γδT细胞产品,用于多发性骨髓瘤的细胞过继免疫治疗。

关键词： B细胞成熟抗原多发性骨髓瘤嵌合抗原受体 γδT细胞

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