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基础医学与临床 2018年第5期38卷 674-678页

作者：徐杉王蕾杰石磊中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的研究Zika病毒NS3蛋白是否具有依赖于ATP水解的ds DNA解链活性。方法构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21菌株中表达带有His标签的Zika NS3蛋白,并用Ni琼脂糖珠进行纯化;利用ATPase检测试剂盒对NS3的ATP水解活性进行检测;利用荧光共振... 详细信息

目的研究Zika病毒NS3蛋白是否具有依赖于ATP水解的ds DNA解链活性。方法构建原核表达载体,在大肠杆菌BL21菌株中表达带有His标签的Zika NS3蛋白,并用Ni琼脂糖珠进行纯化;利用ATPase检测试剂盒对NS3的ATP水解活性进行检测;利用荧光共振能量转移(FRET)原理,对NS3的ds DNA解链活性进行实时动力学检测;利用定点突变方法将NS3蛋白的第198位甘氨酸(G)突变为丙氨酸(A),得到G198A突变体,检测其是否影响NS3解旋酶活性。结果 Zika NS3蛋白在体外可以水解ATP,酶解最大反应速率为2.76μmol/(L·min),Km值为0.11 mmol/L;Zika NS3蛋白在体外可以解链ds DNA;G198A突变体与野生型相比,ATP水解速率和ds DNA的解链速率均明显减弱。结论 Zika NS3蛋白在体外具有ATP水解活性以及ds DNA解链活性,且第198位甘氨酸对于NS3酶活性至关重要。

关键词： Zika病毒 NS3蛋白 ATP dsDNA 解旋酶

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九例家族性高胆固醇血症患者的LDLR基因突变检测

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中华医学遗传学杂志 2018年第6期35卷 783-786页

作者：孟晓露司锘申育奇汪奇何疆春卢超霞吴炜张抒扬张学中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室麦库西克-张孝骞协和遗传医学中心北京100005 中国人民解放军总医院心血管内科北京100853 中国人民解放军海军总医院心脏中心北京100048 中国医学科学院北京协和医院心内科北京100730

目的检测9例家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia,FH)患者的LDLR基因突变情况,为临床诊断与遗传咨询提供依据。方法PCR扩增LDLR基因的全部编码及侧翼序列,对扩增产物进行直接测序。对携带纯合突变以及复合杂合突变的患者... 详细信息

目的检测9例家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia,FH)患者的LDLR基因突变情况,为临床诊断与遗传咨询提供依据。方法PCR扩增LDLR基因的全部编码及侧翼序列,对扩增产物进行直接测序。对携带纯合突变以及复合杂合突变的患者,通过父母样本测序或T克隆测序明确突变的双等位基因来源。结果在7例患者中检出了8个LDLR基因突变,分别为c.259T>G、c.513delC、c.530C>T、c.682G>T、c.763C>T、c.1187-10G>A、c.1948delG、c.1730G>A。4例患者携带杂合突变,2例患者携带纯合突变,1例患者携带复合杂合突变,携带双等位基因突变的患者较杂合突变的患者症状更加严重。结论9例FH患者中7例检出LDLR基因突变,同时新突变位点的检出丰富了LDLR基因突变谱。

关键词：家族性高胆固醇血症 LDLR基因基因检测突变

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CRISPR/Cas9基因编辑系统研究进展

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基础医学与临床 2018年第4期38卷 543-547页

作者：程成舒鹏程彭小忠中国医学科学院北京协和医学院北京100005 中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室中国医学科学院医学灵长类研究中心神经科学中心北京100005

CRISPR/Cas9基因编辑系统被广泛应用于生物学及医学各领域。该系统可在RNA的引导下对特定DNA位点进行靶向编辑。脱靶效应和编辑效率是该系统面临的两大问题。目前已有诸多研究从减少脱靶效应和提高编辑效率的方面对该系统进行优化,将有... 详细信息

CRISPR/Cas9基因编辑系统被广泛应用于生物学及医学各领域。该系统可在RNA的引导下对特定DNA位点进行靶向编辑。脱靶效应和编辑效率是该系统面临的两大问题。目前已有诸多研究从减少脱靶效应和提高编辑效率的方面对该系统进行优化,将有助于其安全性的提升及应用范围的拓展。

关键词： CRISPR/Cas9 基因编辑脱靶效应编辑效率

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Dysbindin-1B^(+/+)小鼠海马凋亡及认知功能

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中国医学科学院学报 2017年第3期39卷 307-311页

作者：杨微许琪中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的观察人源特异性表达dysbindin-1B^(+/+)(dys1B)小鼠的组织学及行为学表现。方法建立dys1B转基因小鼠,采用TUNEL法检测野生型(WT)和dys1B小鼠海马脑区凋亡情况,并在电镜下观察WT和dys1B小鼠海马区的凋亡情况,旷场实验和T迷宫实验观... 详细信息

目的观察人源特异性表达dysbindin-1B^(+/+)(dys1B)小鼠的组织学及行为学表现。方法建立dys1B转基因小鼠,采用TUNEL法检测野生型(WT)和dys1B小鼠海马脑区凋亡情况,并在电镜下观察WT和dys1B小鼠海马区的凋亡情况,旷场实验和T迷宫实验观测小鼠在新环境中的自主活动能力、焦虑程度及空间记忆能力。结果 dys1B小鼠海马区神经元凋亡率明显高于WT小鼠(t=12.98,P<0.0001),且在电镜下有凋亡中期和晚期表现。旷场实验结果显示,dys1B小鼠的总运动距离为(2887±376)cm,明显低于WT小鼠的(3632±606)cm(t=2.993,P=0.0122);中心活动时间为(64.22±14.67)s,明显少于WT小鼠的(114.00±34.09)s(t=4.649,P=0.0023)。T迷宫实验结果显示,forced run与test run间隔60和180 s时,dys1B小鼠的正确率分别为(70.40±15.17)%和(59.28±9.10)%,明显低于WT小鼠的(91.67±13.94)%(t=3.261,P=0.0258)和(83.33±14.89)%(t=3.687,P=0.0291);间隔15 s时,dys1B小鼠和WT小鼠的正确率差异无统计学意义[100%比(94.45±6.08)%;t=0.851,P=0.0756]。结论 dys1B表达可引起小鼠海马区细胞凋亡并可导致自主活动能力降低,焦虑程度增加,空间记忆能力障碍。

关键词： dysbindin-1 细胞凋亡自主活动焦虑程度认知障碍

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利用斑马鱼模型研究miR-191对髓系造血分化的调控

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中国实验血液学杂志 2017年第4期25卷 1172-1177页

作者：孙晨光陈明阮峥韩睿钦王文天王芳胡晓实验血液学国家重点实验室中国医学科学院协和医学院血液学研究所血液病医院天津300020 医学分子生物学国家重点实验室中国医学科学院协和医学院基础医学研究所北京100005

目的:利用斑马鱼造血发育模型探索microRNA-191(miR-191)对髓系造血分化的调控。方法:将miR-191和对照(cel-miR-67)通过显微注射斑马鱼受精卵,收集发育到10 s、24 hpf、36 hpf和48 hpf的胚胎,分别提取对照及实验组胚胎的RNA,利用荧光定... 详细信息

目的:利用斑马鱼造血发育模型探索microRNA-191(miR-191)对髓系造血分化的调控。方法:将miR-191和对照(cel-miR-67)通过显微注射斑马鱼受精卵,收集发育到10 s、24 hpf、36 hpf和48 hpf的胚胎,分别提取对照及实验组胚胎的RNA,利用荧光定量qRT-PCR比较斑马鱼胚胎红系细胞分化标记基因(gata1,scl,hbbe3,lmo2)和粒-单系细胞分化标记基因(pu.1,L-plastin,mpx,cebpα)的表达水平;选取24 hpf胚胎进行上述基因的整胚原位杂交,比较注射miR-191对髓系分化标记基因的原位时空表达的影响。结果:通过分子克隆及T7 RNA聚合酶体外转录成功制备了斑马鱼红系、粒-单系细胞分化标记基因的RNA探针且特异性良好;与注射对照的受精卵相比较,荧光定量qRT-PCR检测发现,注射miR-191的24 hpf和36 hpf斑马鱼胚胎整体中髓系分化基因的水平均有微弱的上调趋势;而发育10 s的胚胎中髓系基因mpx的mRNA表达出现10-20倍的显著上调;整胚原位杂交结果发现24 hpf的胚胎中髓系特异基因L-plastin的原位表达有所上调。结论:本研究建立了斑马鱼受精卵显微注射技术及分析胚胎髓系分化基因表达的两种方法;miR-191对斑马鱼胚胎髓系分化调控功能的研究结果显示,该miRNA可能参与调控粒-单核系和红系分化,其对髓系基因mpx表达调控的分子机制及相应功能有待进一步的研究。

关键词：斑马鱼模型 miR-191 髓系造血

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低氧微环境下胶质瘤干细胞表型的改变与RNA结合蛋白相关

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基础医学与临床 2018年第6期38卷 793-797页

作者：李珊珊胡佩珊韩为彭小忠中国医学科学院基础医学研究所、北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室、生物化学与分子生物学系医学灵长类研究中心神经科学中心北京100005

目的研究低氧微环境下胶质瘤干细胞表型变化与RNA结合蛋白表达之间的关系。方法 1%O_2的低氧条件培养胶质瘤干细胞U87MG-SLC和GSC5,20%O_2为常氧对照。分别利用MTS实验和肿瘤球形成实验检测其增殖能力和自我更新能力;Western blot检测... 详细信息

目的研究低氧微环境下胶质瘤干细胞表型变化与RNA结合蛋白表达之间的关系。方法 1%O_2的低氧条件培养胶质瘤干细胞U87MG-SLC和GSC5,20%O_2为常氧对照。分别利用MTS实验和肿瘤球形成实验检测其增殖能力和自我更新能力;Western blot检测干性相关蛋白和RNA结合蛋白表达水平的变化;通过吸光度扫描进行统计分析。结果低氧条件下肿瘤干细胞的增殖能力下降(P<0.05),自我更新能力上升(P<0.05),HIF-1α和干性标志物Nestin和SOX2上调(P<0.01;P<0.05)。与常氧组相比,低氧组胶质瘤干细胞的多种RNA结合蛋白表达水平发生变化:hnRNPF、UNRIP以及Hu D表达水平上调(P<0.05),PCBP2和UNR表达水平下调(P<0.01;P<0.05),而其他RNA结合蛋白(hnRNPK、ADAR1、PCBP1、CIRP、EBP1、e EF1A、PTBP1、PTBP2)表达水平没有显著性变化。结论低氧微环境下,胶质瘤干细胞的表型变化与RNA结合蛋白hnRNPF、UNRIP、Hu D、PCBP2和UNR表达水平相关。

关键词：低氧胶质瘤干细胞 RNA结合蛋白增殖自我更新

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青少年起病的成人型糖尿病相关基因新突变位点的发现

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基础医学与临床 2018年第4期38卷 470-474页

作者：李怡心李玉秀常永生中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室北京100005 中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院内分泌科卫生部内分泌重点实验室北京100730

目的发现新的青少年起病的成人型糖尿病(MODY)相关基因或已知的相关基因的新突变位点,为临床上MODY的诊断提供依据。方法以已知的MODY临床特征为筛选标准,从北京协和医院内分泌科就诊的患者中选取4例,提取其基因组DNA并进行全外显子组测... 详细信息

目的发现新的青少年起病的成人型糖尿病(MODY)相关基因或已知的相关基因的新突变位点,为临床上MODY的诊断提供依据。方法以已知的MODY临床特征为筛选标准,从北京协和医院内分泌科就诊的患者中选取4例,提取其基因组DNA并进行全外显子组测序,用PCR及Sanger测序法对测序结果进行验证。结果在2例患者中分别发现了MODY相关基因GCK和HNF4α的新的突变位点c.1348G>T(***450Thr)和c.758G>A(***253Gln)。结论 2例患者均为MODY患者,所发现的MODY相关基因中的突变位点均为首次发现。

关键词： MODY GCK HNF4α 突变

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两种台式高通量测序平台应用于癫痫患者基因突变检测的对比研究

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国际遗传学杂志 2018年第1期41卷 1-6页

作者：司锘王蓉蓉张俐俐李小玲汪涵卢超霞柳青张学中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室麦库西克-张孝骞协和遗传医学中心中国医科大学细胞生物学系中国医学科学院北京协和医院神经科

目的应用Illumina MiSeq和Ion Torrent PGM两种台式高通量测序平台,使用同样的序列捕获系统,结合两个平合各自配备的标准化试剂及软硬件设备,对癫痫患者进行突变检测,对比两个平台在使用成本、操作难易度、突变检测效果等方面的表现,从... 详细信息

目的应用Illumina MiSeq和Ion Torrent PGM两种台式高通量测序平台,使用同样的序列捕获系统,结合两个平合各自配备的标准化试剂及软硬件设备,对癫痫患者进行突变检测,对比两个平台在使用成本、操作难易度、突变检测效果等方面的表现,从而针对癫痫多基因诊断panel优化检测流程、指导测序平台选择。方法获取患者知情同意后采集30名癫痫患者外周血,提取基因组DNA。其中8名患者DNA采用Ion Xpress;Plus gDNA Fragment Library Preparation,另22名患者基因组DNA采用Dlumina TruSeq DNA LT sample prep kit进行文库制备,之后使用NimbleGen定制序列捕获系统对428个目的基因的编码区进行富集。构建完成的文库分别采用Ion Torrent PGM和Illumina MiSeq测序平台测序。Ion Torrent PGM平台产出数据用Ion Torrent Suite3. 2软件进行序列比对及SNPs和Indels提取,Illumina MiSeq平台产出数据用BWA-MEM和Samtools软件进行序列比对和变异提取。结果 Illumina MiSeq平台测序每次运行最多可完成12个样品的测序,总数据量超过5Gb,平均测序深度达137×,靶区域覆盖度为96.4%,平均每个样本提取2056±9. 042个变异,从样本制备到数据产出周期约6天。Ion Torrent PGM平台一张318 v2芯片可得到1. 4 Gb数据量,8个样本平均测序深度达70×,靶区域覆盖度为96. 1%,平均每个样本提取3028±678. 9个变异,从样品制备到数据产出周期约6天。PGM平台使用成本低于MiSeq,而MiSeq平台操作易用性及测序质量优于PGM平台。结论靶序列捕获结合下一代测序技术可以实现对癫痫致病基因的批量快速检测,两种台式高通量测序仪均可满足检测需求,Ion Torrent PGM平台应用灵活、成本经济。Iliumina MiSeq平台单次运行产出数据大,数据准确性高,适用于大批量样品检测。

关键词：台式高通量测序平台 MiSeq测序仪 PGM测序仪

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肥厚型心肌病患者的基因突变位点鉴定和基因型表型分析

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中国分子心脏病学杂志 2018年第4期18卷 2571-2575页

作者：肖嫣卢超霞刘芳田涛杨坤璂张莹孟旭范鹏刘亚欣王林平张学周宪梁中国医学科学院北京协和医学院国家心血管病中心阜外医院高血压中心心血管病国家重点实验室北京市100037 中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学遗传学系医学分子生物学国家重点实验室北京市100005

目的旨在明确肥厚性心肌病(HCM)的突变谱并探讨基因型与表型的关系。方法前瞻性纳入2010年11月至2012年11月在阜外医院确诊为肥厚型心肌病的71例患者,应用半导体靶向二代测序鉴定基因突变,对患者进行全面评估和随访,应用生存分析等明确... 详细信息

目的旨在明确肥厚性心肌病(HCM)的突变谱并探讨基因型与表型的关系。方法前瞻性纳入2010年11月至2012年11月在阜外医院确诊为肥厚型心肌病的71例患者,应用半导体靶向二代测序鉴定基因突变,对患者进行全面评估和随访,应用生存分析等明确基因型与短期预后的关系。结果 33例(46%)患者被检出34种突变位点,其中首次报道的突变位点占65%(22/34),MYH7和MYBPC3基因各占35%(12/34),多基因突变占12%(4/33)。与突变阴性患者相比较,突变阳性者的发病年龄早[(40±12)岁vs(49±11)岁,P=0.001];家族史和家族猝死史发生率高(52%vs 13%,P<0.001;50%vs 1%,P<0.001);非持续性室性心动过速多见(36%vs13%,P=0.022)。随访(36±8)个月,Kaplan-Meier生存分析显示突变阳性者较突变阴性患者心血管死亡发生率高(P=0.019)、心衰住院率高(P=0.037)和心脏性猝死发生率高(P=0.010)。除了年龄≤35岁的患者多见(39%vs 0%,P=0.041),MYH7突变携带者较MYBPC3突变携带者的表型和预后无统计学差异。在4例多基因突变携带者中,2例患者植入埋藏式心脏复律除颤器,其中1例发生适当放电;2例随访为终末期HCM并伴有左室血栓和心衰住院,其中1例列入心脏移植名单。结论囊括几乎所有致病基因的二代测序方法增加了基因突变的检出率。基因突变阳性预测不良预后,但与单个突变基因的类型无关。多基因突变可能预示左室收缩功能障碍。

关键词：肥厚型心肌病基因 MYH7 MYBPC3 多基因突变

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基于蛋白质谱鉴定的胰腺癌血清标志物同位素标记相对和绝对定量分析

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肿瘤研究与临床 2017年第2期29卷 98-103页

作者：贾凯耿超党学义山西省肿瘤医院普外科太原030013 中国医学科学院基础医学研究所、北京协和医学院基础学院、国家医学分子生物学重点实验室北京100730

目的通过蛋白质组学方法筛选胰腺癌患者的血清差异表达蛋白,探讨其临床意义,为生物标记物的发现及验证提供新的依据.方法采用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术和二维液相色谱-串联质谱（2D-LC-MS/MS）分析方法,对15例胰腺癌患者... 详细信息

目的通过蛋白质组学方法筛选胰腺癌患者的血清差异表达蛋白,探讨其临床意义,为生物标记物的发现及验证提供新的依据.方法采用同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术和二维液相色谱-串联质谱（2D-LC-MS/MS）分析方法,对15例胰腺癌患者与10名健康对照的血清进行差异蛋白分析.采用质谱分析并检索Panther、Mascot及Scaffold数据库,对结果进行Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析.结果从血清样品中共定量442个蛋白.胰腺癌患者与健康对照者血清中存在差异表达的蛋白有76个,并引起相应生物功能改变.胰腺癌患者转化生长因子β1（TGFβ1）、凋亡蛋白酶激活因子1（APAF1）等蛋白表达较健康对照有所下调,而DNA修复蛋白50（RAD50）的表达明显上调.以上三个蛋白与其他蛋白一起形成紧密作用的网络,影响胰腺癌患者的机体代谢.结论通过蛋白质组学方法筛选出的胰腺癌患者血清差异表达蛋白可能是潜在的胰腺癌标志物,可为临床早期诊断胰腺癌提供分子依据.

关键词：胰腺肿瘤肿瘤标记,生物学同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学血清

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