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基础医学与临床 2014年第6期34卷 834-839页

作者：韩为林细华阴彬彭小忠中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的通过核糖核蛋白免疫沉淀-芯片技术(RIP-Chip)在人正常神经胶质细胞(HA)和神经胶质瘤细胞(T98G和U87MG)中筛选与多聚胞嘧啶结合蛋白2(PCBP2)相互作用的microRNA(miRNA)。方法选择兔抗人PCBP2抗体,用Western blot法检测PCBP2蛋白在HA... 详细信息

目的通过核糖核蛋白免疫沉淀-芯片技术(RIP-Chip)在人正常神经胶质细胞(HA)和神经胶质瘤细胞(T98G和U87MG)中筛选与多聚胞嘧啶结合蛋白2(PCBP2)相互作用的microRNA(miRNA)。方法选择兔抗人PCBP2抗体,用Western blot法检测PCBP2蛋白在HA、T98G和U87MG细胞中的表达。用兔Ig G作为阴性对照,收集3种细胞的RIP蛋白和RNA样品,通过Western blot检测PCBP2蛋白富集效果,利用Nano Drop定量并经Agilent2100检测RNA完整性。选择Affymetrix miRNA 3.0芯片对RNA样品进行杂交,筛选富集4倍以上且P<0.05的miRNA。结果用PCBP2抗体进行RIP-Chip实验,最终筛选和PCBP2相互作用的103条miRNA,1条前体miRNA和1条核仁小分子RNA;其中15条存在PCBP2的结合位点。结论 PCBP2可以通过识别靶序列或者以核糖核蛋白复合物形式在细胞内结合成熟的miRNA、前体miRNA或核仁小分子RNA。

关键词： PCBP2 microRNA RIP-Chip 神经胶质瘤

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SUN结构域家族蛋白研究进展

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中国细胞生物学学报 2014年第10期36卷 1413-1421页

作者：沙志强许琪中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室北京100005

SUN(Sad-1,UNC-84)结构域家族蛋白是一种广泛分布于酵母、线虫等真核生物的膜蛋白,主要定位于细胞核膜以及内质网。由于在酵母中发现Sad-1突变后的表型与线虫中UNC-84突变的表型一致,并且两者C-端有近一半的同源相似性,因此得名SUN结构... 详细信息

SUN(Sad-1,UNC-84)结构域家族蛋白是一种广泛分布于酵母、线虫等真核生物的膜蛋白,主要定位于细胞核膜以及内质网。由于在酵母中发现Sad-1突变后的表型与线虫中UNC-84突变的表型一致,并且两者C-端有近一半的同源相似性,因此得名SUN结构域,其家族成员也都具有SUN结构域。根据SUN结构域所在家族成员中蛋白质一级序列位置的不同,分为经典及非经典家族蛋白,经典的家族蛋白一般通过与KASH(Klarsicht、ANC-1、Syne homology)蛋白相互作用行使功能。越来越多的研究结果表明,SUN蛋白可能参与核膜锚定、核膜重塑、细胞迁移和DNA损伤修复等过程,其形成的复合体与人类进行性肌营养不良等疾病的发生发展也有紧密联系。该文就SUN家族各成员蛋白的结构特性以及功能特点的研究进展进行简要综述。

关键词： SUN结构域核膜锚定细胞迁移进行性肌营养不良

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miR-196a-5p抑制小鼠胚胎干细胞的自我更新

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基础医学与临床 2014年第12期34卷 1645-1649页

作者：赵华路姚南魏雪菊王兰兰张俊武黄粤余佳中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院国家医学分子生物学重点实验室北京100005

目的研究miR-196a-5p在小鼠胚胎干细胞(m ESC)自我更新中的功能。方法定量PCR法确定miR-196a-5p在m ESC早期分化过程中的表达。在胚胎干细胞中过表达miR-196a-5p类似物,通过集落形成实验、细胞周期分析、碱性磷酸酶染色和Oct4染色确定mi... 详细信息

目的研究miR-196a-5p在小鼠胚胎干细胞(m ESC)自我更新中的功能。方法定量PCR法确定miR-196a-5p在m ESC早期分化过程中的表达。在胚胎干细胞中过表达miR-196a-5p类似物,通过集落形成实验、细胞周期分析、碱性磷酸酶染色和Oct4染色确定miR-196a-5p过表达对m ESC自我更新及增殖的影响。结果 miR-196a-5p在m ESC早期分化过程中表达上升(P<0.05),在m ESC中过表达miR-196a-5p类似物后,ESC的集落形成及增殖能力被明显抑制(P<0.01),碱性磷酸酶活性下降,Oct4蛋白水平也出现明显下降。结论 miR-196a-5p具有抑制m ESC自我更新的能力,在m ESC早期分化过程中可能发挥重要作用。

关键词：小鼠胚胎干细胞自我更新

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小RNA干扰PCBP2在神经胶质瘤细胞中对P53相关基因的调节和对细胞增殖的影响

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基础医学与临床 2014年第6期34卷 776-781页

作者：韩为阴彬彭小忠中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院生物化学与分子生物学系医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的探索多聚胞嘧啶结合蛋白2(PCBP2)表达下调对相关基因和胶质瘤细胞增殖的影响。方法 3株神经胶质瘤细胞系(T98G、U87MG和U251)各分为2组,分别转入特异性靶向PCBP2基因的小干扰RNA(siRNA)和对照siRNA,用Western blot法检测siRNA对PCBP... 详细信息

目的探索多聚胞嘧啶结合蛋白2(PCBP2)表达下调对相关基因和胶质瘤细胞增殖的影响。方法 3株神经胶质瘤细胞系(T98G、U87MG和U251)各分为2组,分别转入特异性靶向PCBP2基因的小干扰RNA(siRNA)和对照siRNA,用Western blot法检测siRNA对PCBP2蛋白的抑制效果及对P53蛋白和它的两个靶基因PUMA和BAX的表达影响,同时检测P53共调节因子FHL2和同家族成员FHL1表达变化。用生物素pull-down分析PCBP2是否和FHL家族成员mRNA结合。用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)掺入法检测细胞增殖能力,Hoechst染色观察细胞凋亡率。结果 PCBP2 siRNA转染这3株细胞后使PCBP2蛋白表达水平明显下调(P<0.05);增加P53及它的靶基因PUMA和BAX的蛋白表达(P<0.05);抑制FHL2蛋白(P<0.05),但并不结合其mRNA的3'非编码区(3'UTR);Brd U阳性细胞减少(P<0.05);Hoechst染色阳性细胞增多(P<0.05)。结论抑制PCBP2表达可以增强胶质瘤细胞中P53通路活性,并减弱细胞增殖能力,诱导细胞凋亡。

关键词： RNA干扰多聚胞嘧啶结合蛋白2 P53 细胞增殖细胞凋亡

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稳定表达人血红素加氧酶-1细胞系的建立及其功能鉴定

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中国医学科学院学报 2014年第4期36卷 420-425页

作者：杨根欢吴为李砚川倪冷王占启宋希涛刘昌伟中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院血管外科北京100730 中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的构建稳定表达人血红素加氧酶-1(HO-1)的细胞系,探讨内源性过表达HO-1对抗细胞氧化损伤的作用。方法 PCR扩增HO-1基因并将其克隆至改造的慢病毒载体pLentiLox3.7中,构建携带目的基因的重组质粒。用重组质粒转染HEK293T细胞,并用Weste... 详细信息

目的构建稳定表达人血红素加氧酶-1(HO-1)的细胞系,探讨内源性过表达HO-1对抗细胞氧化损伤的作用。方法 PCR扩增HO-1基因并将其克隆至改造的慢病毒载体pLentiLox3.7中,构建携带目的基因的重组质粒。用重组质粒转染HEK293T细胞,并用Western blot检测HO-1的表达。将重组质粒与慢病毒辅助质粒(plp1、plp2、VSVG)共同转染HEK293T细胞,包装有活力的慢病毒。用携带HO-1的慢病毒感染HEK293T细胞,筛选出能稳定表达目的基因的单克隆,并行Western blot检测HO-1的表达。将过氧化氢加入正常的及过表达HO-1的HEK293T细胞和人脐静脉内皮细胞,检测细胞内活性氧的含量。结果成功筛选出能稳定表达HO-1的单克隆细胞系并扩大培养,Western blot检测其HO-1的表达明显升高。加入过氧化氢后,过表达HO-1的HEK293T细胞和人脐静脉内皮细胞内的活性氧明显减少。结论成功构建了能稳定表达人HO-1的细胞系,内源性过表达HO-1能够对抗细胞的氧化损伤。

关键词：血红素加氧酶-1 慢病毒稳定细胞株氧化损伤

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神经干细胞定向分化过程中编码基因表达谱分析

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基础医学与临床 2014年第6期34卷 734-739页

作者：张靖朱丽媛阴彬侯琳彭小忠中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室北京100005 中国医学科学院神经科学中心北京100005

目的探索小鼠神经干细胞定向分化为神经元及胶质细胞过程中重要发育基因的表达变化。方法 1)神经干细胞培养及定向分化诱导培养;2)分化神经元、星形胶质细胞的流式分选;3)针对编码基因表达谱芯片的生物信息学分析,包括基因功能聚类、通... 详细信息

目的探索小鼠神经干细胞定向分化为神经元及胶质细胞过程中重要发育基因的表达变化。方法 1)神经干细胞培养及定向分化诱导培养;2)分化神经元、星形胶质细胞的流式分选;3)针对编码基因表达谱芯片的生物信息学分析,包括基因功能聚类、通路分析等。结果 1)经细胞分选获得神经干细胞、神经元、星形胶质细胞;2)Sox2、Nestin等神经干细胞、神经元及星形胶质细胞的标志性基因表达谱式明显;3)Wnt通路、Insulin通路、P53通路活性的改变在定向分化细胞类群中存在细胞特异性。结论神经干细胞的分化过程是一个多基因通路综合变化的复杂网络。

关键词：神经干细胞定向分化 Wnt通路 insulin通路 P53通路

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自然反义转录物Lmo4as对神经系统重要编码基因Lmo4的调节作用

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基础医学与临床 2014年第6期34卷 819-823页

作者：张靖吴朝朱丽媛阴彬侯琳彭小忠中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室北京100005 中国医学科学院神经科学中心北京100005

目的探索小鼠神经系统重要编码基因Lmo4基因座位上自然反义转录产物Lmo4as对该编码基因的表达调控功能。方法 1)使用c DNA末端快速扩增(RACE)与RT-PCR技术,验证Lmo4as是否具有多聚腺苷酸(poly A)尾,克隆Lmo4as的全长序列;2)使用实时定量... 详细信息

目的探索小鼠神经系统重要编码基因Lmo4基因座位上自然反义转录产物Lmo4as对该编码基因的表达调控功能。方法 1)使用c DNA末端快速扩增(RACE)与RT-PCR技术,验证Lmo4as是否具有多聚腺苷酸(poly A)尾,克隆Lmo4as的全长序列;2)使用实时定量PCR和原位杂交技术确定Lmo4as及相应编码基因的时空表达谱;3)使用荧光素酶报告基因实验在体外验证Lmo4as对Lmo4是否具有调控作用。结果 1)Lmo4as是一个具有多聚腺苷酸(poly A)尾的非编码RNA转录本,获得其RNA全长信息;2)Lmo4as与相应编码基因转录Lmo4的丰度在时间上具有协同性,而在空间表达上具有明显不同的分布;3)Lmo4as对Lmo4在转录后水平具有负性调节作用,另外miR-124也能够抑制Lmo4的表达。结论编码基因Lmo4基因座位上自然反义转录产物Lmo4as对其转录后水平的负性调节与microRNA的调节共同发挥作用。

关键词：小鼠大脑发育 Lmo4 自然反义转录物原位杂交转录后调控

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新疆哈萨克族人弗林蛋白Furin基因变异与高总胆固醇血症、高低密度脂蛋白胆固醇血症的相关性

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中国医学科学院学报 2014年第2期36卷 168-175页

作者：王红梅李南方洪静罗文利严治涛王新玲朱沂沈岩中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院博士后流动站北京100005 新疆维吾尔自治区人民医院博士后工作站乌鲁木齐830001 新疆维吾尔自治区人民医院高血压科乌鲁木齐830001 中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的研究新疆哈萨克族人高总胆固醇血症、高低密度脂蛋白胆固醇血症与弗林蛋白(Furin)基因变异的相关性。方法本研究是以横断面流行病学调查为基础的病例-对照研究,878例研究对象均来自新疆哈萨克族自然人群。测定48例随机选择的哈萨克... 详细信息

目的研究新疆哈萨克族人高总胆固醇血症、高低密度脂蛋白胆固醇血症与弗林蛋白(Furin)基因变异的相关性。方法本研究是以横断面流行病学调查为基础的病例-对照研究,878例研究对象均来自新疆哈萨克族自然人群。测定48例随机选择的哈萨克族高胆固醇血症患者(女性24例、男性24例)弗林蛋白基因启动子、外显子区序列,筛查代表性变异。采用TaqMan PCR分析弗林蛋白基因变异在878例哈萨克族自然人群(男性370例、女性508例)中的分型,分析其与哈萨克族人血总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平的相关性。结果在48例高胆固醇血症患者中,共筛查出弗林蛋白基因的12个变异,包括4个代表性变异(rs6226、rs6227、rs2071410、rs4932178)。4个代表性变异均在大样本哈萨克族人中基因型分型成功(成功率≥99%)。在哈萨克族自然人群中,rs6226、rs6227、rs2071410、rs4932178多态性的基因型、等位基因、单体型频率分别在高胆固醇血症组、对照组间及高低密度脂蛋白胆固醇血症组、对照组间的分布差异均无统计学意义(P均>0.05);每个多态性的不同基因型携带者之间的血总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇平均水平差异无统计学意义(P均>0.05)。结论新疆哈萨克族人高总胆固醇血症、高低密度脂蛋白胆固醇血症与弗林蛋白基因变异不相关,该变异可能不是哈萨克族人高胆固醇血症、高低密度脂蛋白胆固醇血症的易感因素。

关键词：弗林蛋白基因高胆固醇血症高低密度脂蛋白胆固醇血症哈萨克族基因变异

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CDR3δ2基因修饰γδT细胞的构建及其功能鉴定

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基础医学与临床 2014年第6期34卷 746-752页

作者：胡愉赵慧王准何维中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院免疫学系医学分子生物学国家重点实验室北京100005 中国食品药品检定研究院病毒三室北京100050

目的将全长γ9链mRNA和肿瘤反应性CDR3移植的δ2链mRNA共转染到抗CD3抗体刺激的PBMC,制备CDR3δ2基因修饰型γδT淋巴细胞,研究其抗肿瘤作用。方法通过PCR扩增含有肿瘤反应性特异CDR3δ2序列(OT3和OT10)的TCRδ2链及γ9链,构建重组质粒p... 详细信息

目的将全长γ9链mRNA和肿瘤反应性CDR3移植的δ2链mRNA共转染到抗CD3抗体刺激的PBMC,制备CDR3δ2基因修饰型γδT淋巴细胞,研究其抗肿瘤作用。方法通过PCR扩增含有肿瘤反应性特异CDR3δ2序列(OT3和OT10)的TCRδ2链及γ9链,构建重组质粒p GEM4Z/δ2(OT3)/A64、p GEM4Z/δ2(OT10)/A64和p GEM4Z/γ9/A64;以线性化的重组质粒作为模板,体外合成δ2(OT3)、δ2(OT10)和γ9 mRNA;将δ2(OT3)mRNA和δ2(OT10)mRNA分别与γ9 mRNA共电转染入抗CD3抗体刺激的正常人PBMC;经流式细胞术检测和分选γ9δ2(OT3)T细胞和γ9δ2(T10)T细胞。ELISA及MTT法分别检测上述转染细胞的抗肿瘤作用。结果 CDR3δ2基因修饰的TCRγδ细胞γ9δ2(OT3)T细胞和γ9δ2(T10)T细胞能够分泌较高的IFN-γ及TNF-α(P<0.05),对多种肿瘤细胞具有显著的细胞毒作用(P<0.05)。结论基因修饰型γ9δ2 T细胞能够明显增强对肿瘤的杀伤活性,为肿瘤过继免疫细胞的制备提供了新的策略。

关键词： T细胞 CDR3δ2 γδTCR 过继免疫治疗 OT3 OT10

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Let-7a靶向抑制Ewing肉瘤中CDK6的表达

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基础医学与临床 2014年第11期34卷 1524-1529页

作者：瞿岱彪邵斌袁志峰王芳余佳刘会文景德镇市第一人民医院骨科江西景德镇333000 中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的研究抑癌microRNA(Let-7a)在Ewing肉瘤细胞系中的靶基因。方法用Northern blot分析细胞系中Let-7a的表达量;构建p MIR-reporter-CDK6野生型(CDK6_WT)或突变型(CDK6_MUT)及阳性对照(Let-7a_PC)质粒;体外合成的寡核苷酸(Let-7a_mimic)转染Ewing肉瘤细胞系SK-ES-1,用real time PCR检测Let-7a的表达;通过生物信息软件分析、双荧光素酶报告实验和Western blot寻找并确定Let-7a的靶基因。结果 Let-7a在Ewing肉瘤细胞系中系低表达,以MSCs为参照,SK-ES-1 Let-7a/U6 snRNA灰度值最高为:0.193±0.024(P<0.05);双酶切和DNA测序鉴定质粒构建成功;在SK-ES-1细胞中成功过表达Let-7a(P<0.01);野生型CDK6(CDK6_WT)荧光素酶表达水平与对照组和突变型CDK6(CDK6_MUT)相比明显下降(P<0.05);在SK-ES-1细胞系中过表达Let-7a抑制了CDK-6 mRNA和蛋白质的表达。结论确定了抑癌microRNA(Let-7a)在Ewing肉瘤细胞系中靶基因,为进一步实验奠定了基础。

关键词： Let-7a CDK6 Ewing肉瘤

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