目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性...
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目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性内切酶NotⅠ酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL。结论制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。
目的构建Cre-loxP条件性基因敲除系统中Cre酶的重组腺病毒表达载体,作为体细胞条件性基因敲除的基础,并为传统ES细胞条件性基因敲除提供新的选择。方法用pAd-easy系统在大肠杆菌内经同源重组的方法构建Cre酶的复制缺陷型重组腺病毒载体;W estern b lot方法鉴定Cre蛋白的表达。结果在大肠杆菌内构建出重组腺病毒质粒,在包装细胞系内包装出重组病毒颗粒;测定病毒滴度为106pfu/L;重组病毒在细胞内表达Cre蛋白。结论表达Cre酶的重组腺病毒载体构建成功,阳性重组质粒的鉴定方法得以改进,为进一步的体细胞Cre-loxP条件性基因敲除提供了基础。
目的探讨载脂蛋白B（apolipoprotein B，APOB）基因第29外显子3′端可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeat, VNTR）多态性与维吾尔族自然长寿的关系。方法选择191名年龄90岁以上的健康个体为长寿组，另选53名年龄65...
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目的探讨载脂蛋白B（apolipoprotein B，APOB）基因第29外显子3′端可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeat, VNTR）多态性与维吾尔族自然长寿的关系。方法选择191名年龄90岁以上的健康个体为长寿组，另选53名年龄65～70岁、性别、地域相匹配已自然死亡的正常个体为对照组。应用序列特异引物PCR和PCR-直接测序等技术对APOB进行分型，并测定等位基因HVE36和HVE48的核苷酸序列。结果在维吾尔族人群（长寿组191名，对照组53名）中，共发现14个等位基因。长寿组中HVE36、HVE42频率显著高于对照组（P〈0．05），并且HVE44、HVE46、HVE48、HVE58仅见于长寿组，而HVE26、HVE30、HVE34显著低于对照组（P〈0．05）。逐步逻辑回归分析显示，L等位基因和LL基因型与年龄呈正相关，而S等位基因和SS基因型与年龄呈负相关（P〈0．05）。核苷酸序列分析显示，每一种等位基因由富含AT的15bp长的基本单位或它们的变异体串联重复而构成。结论APOB等位基因S和基因型SS可能是维吾尔族自然长寿老人的危险因素，而等位基因L和基因型LL则是其保护因子。
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