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第九届中青年呼吸学者论坛

作者：邹镇郭峰李太生王辰王仲曹斌蒋澄宇中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院感染科首都医科大学北京朝阳医院北京市呼吸病研究所中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院急诊科

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树鼩载脂蛋白AV系列突变体的细胞内定位分析

树鼩载脂蛋白AV系列突变体的细胞内定位分析

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第11届全国脂质与脂蛋白学术会议

作者：李国平王艳满永王抒黎健陈保生卫生部北京医院、卫生部北京老年医学研究所、卫生部老年医学重点实验室中国医学科学院基础医学研究所、中国协和医科大学基础医学院、医学分子生物学国家重点实验室

目的研究不易感动脉粥样硬化动物-树鼩载脂蛋白AV基因不同结构域对细胞内定位的影响。方法前期我们实验室利用快速扩增cDNA末端技术成功获得了该基因的cDNA全长,该基因有两个转录本,分别为1948 bp和1937 bp,在GenBank中的注册号分别为HQ... 详细信息

目的研究不易感动脉粥样硬化动物-树鼩载脂蛋白AV基因不同结构域对细胞内定位的影响。方法前期我们实验室利用快速扩增cDNA末端技术成功获得了该基因的cDNA全长,该基因有两个转录本,分别为1948 bp和1937 bp,在GenBank中的注册号分别为HQ913636.1和HQ913637.1。我们对该基因cDNA全长在人、小鼠、大鼠中做了比较,并对其推演的编码氨基酸序列进行了蛋白质的一级和二级结构分析;据此,利用常规的内切酶技术和PCR定点突变技术,构建一系列

关键词：细胞内定位细胞质内突变体

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DNA转座子在小鼠基因功能研究中的应用

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遗传 2011年第5期33卷 485-493页

作者：刘琳张美丽黄粤中国医学科学院/北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室北京100005

近年来,转座子介导的插入突变在哺乳动物的分子遗传学研究中得到了广泛的应用。转座子作为一种简便高效的遗传学操作工具,在构建转基因动物模型、基因治疗、细胞水平和动物整体水平的基因功能研究等方面发挥了重要的作用。文章重点介绍... 详细信息

近年来,转座子介导的插入突变在哺乳动物的分子遗传学研究中得到了广泛的应用。转座子作为一种简便高效的遗传学操作工具,在构建转基因动物模型、基因治疗、细胞水平和动物整体水平的基因功能研究等方面发挥了重要的作用。文章重点介绍DNA转座子的结构、功能及其应用于小鼠分子遗传学领域的最新研究进展。

关键词：转座子插入突变转基因 Sleeping Beauty piggyBac

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线粒体转录复合物相关蛋白原核表达与纯化

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中国医学科学院学报 2011年第6期33卷 638-643页

作者：刘光杨瑞锋石秉炀刘德培中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的获取人线粒体转录因子A(TFAM)、线粒体转录因子B1(TFB1M)、线粒体转录因子B2(TFB2M)基因片段,高效表达和纯化带有谷胱甘肽转移酶(GST)标签的GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M融合蛋白。方法设计引物扩增得到TFAM、TFB1M、TFB2M的cDN... 详细信息

目的获取人线粒体转录因子A(TFAM)、线粒体转录因子B1(TFB1M)、线粒体转录因子B2(TFB2M)基因片段,高效表达和纯化带有谷胱甘肽转移酶(GST)标签的GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M融合蛋白。方法设计引物扩增得到TFAM、TFB1M、TFB2M的cDNA片段,通过引入的酶切位点克隆至表达载体pET42a,构建重组表达载体,并导入***21宿主菌中,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组的GST融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠纯化表达产物,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析鉴定。结果获得pET42a-TFAM、pET42a-TFB1M、pET42a-TFB2M表达质粒,测序结果与GenBank的基因序列一致。SDS-PAGE分析结果显示,重组GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M融合蛋白分别在相对分子质量56 000、67 000、69 000处出现特异性蛋白条带,经GST亲和层析纯化后,得到高纯度的融合蛋白。结论成功构建了基因重组体pET42a-TFAM、pET42a-TFB1M、pET42a-TFB2M,制备了GST-TFAM、GST-TFB1M、GST-TFB2M融合蛋白。

关键词：线粒体转录因子A 线粒体转录因子B1 线粒体转录因子B2 融合蛋白纯化

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小鼠睾丸曲细精管生精上皮的分离及形态观察

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中国医学科学院学报 2011年第6期33卷 629-631,I0011-I0013页

作者：付俊缪时英中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的寻找一种简单可行的研究精子发生过程中蛋白质定位的方法。方法将新鲜的小鼠睾丸去除白膜,通过胶原酶Ⅰ及DNA酶Ⅰ的作用分离各种细胞。细胞经简单处理后以合适的浓度铺片,进行荧光染色,并于共聚焦荧光显微镜下观察。结果通过分析特... 详细信息

目的寻找一种简单可行的研究精子发生过程中蛋白质定位的方法。方法将新鲜的小鼠睾丸去除白膜,通过胶原酶Ⅰ及DNA酶Ⅰ的作用分离各种细胞。细胞经简单处理后以合适的浓度铺片,进行荧光染色,并于共聚焦荧光显微镜下观察。结果通过分析特异的染料对顶体和细胞核染色的结果,可以分辨出各个阶段的生精细胞。结论建立了一种研究精子发生过程中蛋白质定位的简单、可靠的方法。

关键词：精子发生顶体形成细胞核

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蛋白激酶Nemo样激酶基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

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中国医学科学院学报 2011年第6期33卷 632-637,I0014页

作者：程筱雯梁俊波缪时英王琳芳中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的构建含有蛋白激酶Nemo样激酶(NLK)的重组腺病毒载体。方法采用RT-PCR方法在人胚肾细胞系HEK293T细胞中扩增NLK基因及其突变体K155M、T286V和C425Y,同时在目的基因的C端添加便于蛋白表达检测的FLAG tag,经与载体pAdTrack-CMV连接、... 详细信息

目的构建含有蛋白激酶Nemo样激酶(NLK)的重组腺病毒载体。方法采用RT-PCR方法在人胚肾细胞系HEK293T细胞中扩增NLK基因及其突变体K155M、T286V和C425Y,同时在目的基因的C端添加便于蛋白表达检测的FLAG tag,经与载体pAdTrack-CMV连接、转化、筛选、鉴定后,将Western blot检测表达正确的重组过渡质粒pAdTrack-CMV-NLK及其突变体再经酶切、电转入BJ5183感受态细胞(已包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1)同源重组,并筛选、鉴定、扩增。通过PacI酶切后,以快速简便的乙醇沉淀法替代传统的酚-氯仿-异戊醇法回收酶切产物,用高效低毒高稳定性的FuGENE HD转染试剂替代传统的lipofectamin 2000转染低代数的HEK293A包装细胞,进行病毒包装。包装后的重组腺病毒感染结直肠癌细胞HCT116,Western blot检测以确认NLK及其突变体蛋白的表达。结果经PCR、测序及Western blot检测证实,成功构建了携带NLK基因及其突变体的腺病毒载体,PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组过渡质粒pAdTrack-CMV-NLK及其突变体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组成功,重组表达克隆转染HEK293A细胞获得病毒原液,扩增后感染结直肠癌细胞HCT116能正确表达NLK蛋白及其突变体蛋白。结论成功制备NLK基因及其突变体重组腺病毒,可进一步用于NLK生理功能的研究。

关键词：蛋白激酶Nemo样激酶重组腺病毒载体同源重组

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胰岛素样生长因子结合蛋白-3与甲状腺激素受体α1的相互作用及其对甲状腺激素应答性基因转录的调节

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中国医学科学院学报 2011年第2期33卷 156-161,222页

作者：裘佳马晓骊王欣陈虹黄秉仁中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)与甲状腺激素受体α1(TRα1)之间的相互作用,及其对甲状腺激素应答性基因转录作用的调节。方法采用谷胱甘肽-S-转移酶拉下实验、免疫共沉淀以及荧光共振能量转移实验检测IGFBP-3与TRα1之... 详细信息

目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)与甲状腺激素受体α1(TRα1)之间的相互作用,及其对甲状腺激素应答性基因转录作用的调节。方法采用谷胱甘肽-S-转移酶拉下实验、免疫共沉淀以及荧光共振能量转移实验检测IGFBP-3与TRα1之间的相互作用;激光共聚焦显微镜观察两种蛋白在细胞中的分布;采用双萤光素酶实验检测过表达IGFBP-3对甲状腺素T3激活的生长激素启动子的影响。结果谷胱甘肽-S-转移酶拉下实验、免疫共沉淀以及荧光共振能量转移实验结果证明IGFBP-3与TRα1在体内和体外都可以相互作用,激光共聚焦显微镜观察IGFBP-3和TRα1可以共定位于HEK-293细胞的细胞核。通过双萤光素酶实验检测到过表达IGFBP-3可以抑制甲状腺激素对生长激素启动子的激活作用(P<0.01)。结论 IGFBP-3通过与TRα1相互作用抑制甲状腺激素应答性基因的转录,为IG-FBP-3在核内发挥胰岛素样生长因子非依赖的作用提供了新的实验依据。

关键词：胰岛素样生长因子结合蛋白-3 甲状腺激素受体α1 三碘甲状腺原氨酸生长激素启动子

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死亡受体5氨基末端的结构与功能

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中国医学科学院学报 2011年第1期33卷 33-38页

作者：张鹏陈采凤刘士廉郑德先刘彦信中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的研究死亡受体5(DR5)氨基末端的结构与功能。方法利用基因工程技术构建一系列DR5胞外区(DR5-ECD)缺失突变体并获得相应的重组蛋白。利用蛋白免疫印迹及ELISA技术研究重组蛋白与小鼠抗人DR5单克隆抗体AD5-10的结合情况。结果含有完整... 详细信息

目的研究死亡受体5(DR5)氨基末端的结构与功能。方法利用基因工程技术构建一系列DR5胞外区(DR5-ECD)缺失突变体并获得相应的重组蛋白。利用蛋白免疫印迹及ELISA技术研究重组蛋白与小鼠抗人DR5单克隆抗体AD5-10的结合情况。结果含有完整氨基末端结构的DR5-ECD缺失突变体能够与AD5-10结合,而缺失氨基末端的重组蛋白则不能与AD5-10相互作用。结论 DR5氨基末端含有AD5-10激动性抗体的靶点,该靶点可能在发展肿瘤免疫治疗新策略中发挥重要作用。

关键词：死亡受体激动性抗体肿瘤治疗

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蛋白连接组织生长因子表达腺病毒的构建及其基因功能

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中国医学科学院学报 2011年第6期33卷 649-653,I0014页

作者：宫宁章华兵方福德常永生中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的构建及鉴定蛋白连接组织生长因子(CTGF)基因过表达腺病毒,初步探究CTGF在糖脂代谢方面的功能。方法克隆CTGF过表达质粒,定向克隆入穿梭载体pAdTrack-CMV,Pme I酶切线性化穿梭质粒转化改造的***5183(含腺病毒载体pAdEasy-1)感受态细... 详细信息

目的构建及鉴定蛋白连接组织生长因子(CTGF)基因过表达腺病毒,初步探究CTGF在糖脂代谢方面的功能。方法克隆CTGF过表达质粒,定向克隆入穿梭载体pAdTrack-CMV,Pme I酶切线性化穿梭质粒转化改造的***5183(含腺病毒载体pAdEasy-1)感受态细菌产生重组腺病毒载体,用Pac I线性化重组质粒,回收转染293A细胞包装病毒颗粒,经过3轮扩增,感染肝原代细胞,观察感染效率及检测基因表达情况。通过对小鼠不同时间段的饥饿处理,提取肝脏RNA做RT-PCR,实时定量PCR检测CTGF基因在不同营养条件下的变化情况。结果成功包装CTGF的腺病毒,感染效率达90%以上。CTGF在不同营养条件下表达情况不同,并且与糖脂代谢重要基因过氧化物酶体增值激活受体γ共激活因子1α表达情况一致。饥饿24h,CTGF上调(3.38±0.51)倍;饥饿48h,CTGF上调(5.26±1.25)倍(P<0.05)。结论初步认定CTGF可能参与糖脂代谢。

关键词：蛋白连接组织生长因子过表达腺病毒饥饿

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小鼠大脑皮层层次特异表达基因天然反义转录物的筛选与鉴定

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中国医学科学院学报 2011年第6期33卷 620-623页

作者：李萍张靖李爱花王珊谈小超阴彬彭小忠中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的筛选并鉴定小鼠大脑皮层发育过程中皮层层次特异表达的基因是否存在天然反义转录物(NAT)。方法对63个小鼠大脑皮层层次特异表达的基因进行生物信息学预测,筛选出31个可能存在NAT的基因,从小鼠脑组织及神经系统来源的细胞系提取总RNA... 详细信息

目的筛选并鉴定小鼠大脑皮层发育过程中皮层层次特异表达的基因是否存在天然反义转录物(NAT)。方法对63个小鼠大脑皮层层次特异表达的基因进行生物信息学预测,筛选出31个可能存在NAT的基因,从小鼠脑组织及神经系统来源的细胞系提取总RNA,采用RT-PCR方法对筛选阳性基因进行鉴定并克隆到pGEM-T载体中进行测序。结果 31个经生物信息学预测的基因中,8个为NAT阳性。结论小鼠大脑皮层发育过程中皮层层次特异表达的基因存在NAT,NAT可能通过调控编码基因影响小鼠皮层发育。

关键词：天然反义转录物小鼠大脑皮层筛选鉴定

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