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利用不同碳源进行毕赤酵母高密度发酵及TEF-1启动子指导下的HPV16_L1蛋白表达

中国生物工程杂志 2015年第10期35卷 39-43页

作者：夏烨黄惟巍杨旭孙鹏艳姚月婷王世杰刘存宝孙文佳白红妹姚宇峰马雁冰中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心昆明650118

目的:研究不同碳源对于毕赤酵母菌株在发酵罐中高密度生长,以及对组成型翻译延伸因子-1(TEF-1)启动子指导下HPV16_L1蛋白表达的影响。方法:利用1.5L发酵罐使用不同碳源进行毕赤酵母的高密度发酵,检测在不同碳源利用情况下菌体的增殖动力... 详细信息

目的:研究不同碳源对于毕赤酵母菌株在发酵罐中高密度生长,以及对组成型翻译延伸因子-1(TEF-1)启动子指导下HPV16_L1蛋白表达的影响。方法:利用1.5L发酵罐使用不同碳源进行毕赤酵母的高密度发酵,检测在不同碳源利用情况下菌体的增殖动力学,并以Western blot动态分析HPV16_L1蛋白的表达水平。结果:以甘油作为碳源,菌体细胞湿重可达到510g/L(OD600为189.4),HPV16_L1的表达在72h之前保持高水平;在甲醇和葡萄糖中菌体细胞湿重都可达到220g/L左右(OD600分别为75.3和77.3),甲醇利用下HPV L1蛋白在144h后仍保持较高水平表达,葡萄糖中60h HPV L1表达开始显著下降;在山梨醇作为碳源情况下菌体未能在发酵罐中获得高密度生长;总体上,甘油作为碳源在72h左右可获得最高的目的蛋白收获总量。结论:为实现毕赤酵母高密度生长与异源基因在TEF-1启动子指导下高效表达,以及HPV L1蛋白的简易、有效制备提供了基础。

关键词： TEF-1启动子碳源毕赤酵母高密度发酵 HPV L1蛋白

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以RBP-4为靶点的疫苗对2型糖尿病小鼠血糖降低的研究

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中国比较医学杂志 2015年第10期25卷 46-50,I0006页

作者：李彦涵余柄廷孙静李建芳乌美妮王海璇胡云章胡凝珠中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所疫苗研究室云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心昆明650118 河北大学生命科学学院河北保定071000

目的探讨以人源RBP-4为靶标的疫苗免疫干预胰岛素抵抗的有效性和可行性,为2型糖尿病治疗新方法的推进提供基础研究数据。方法以T7噬菌体为载体表达人源RBP-4的疫苗经皮下免疫2型糖尿病小鼠,同时设空载体组和空白对照组,经2次免疫后在不... 详细信息

目的探讨以人源RBP-4为靶标的疫苗免疫干预胰岛素抵抗的有效性和可行性,为2型糖尿病治疗新方法的推进提供基础研究数据。方法以T7噬菌体为载体表达人源RBP-4的疫苗经皮下免疫2型糖尿病小鼠,同时设空载体组和空白对照组,经2次免疫后在不同时间点检测体液免疫水平、空腹血糖值及体重,并于20周处死动物进行病理学切片检测。结果 RBP-4疫苗有效诱导了抗RBP-4 Ig G抗体的产生,并于12周达到峰值,同时,免疫组的空腹血糖值从第8周开始逐步下降,到第12周时较空载体组和空白组有显著差异,并始终维持在2型糖尿病发病值(7 mmol/L)以下。实验期间,2型糖尿病小鼠未出现蜷缩、竖毛、搔鼻、抽搐等明显异常,免疫组、空载体组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织均未观察到明显病变,表明RBP-4疫苗安全性良好。结论 RBP-4疫苗能显著降低2型糖尿病小鼠的血糖,有可能成为治疗胰岛素抵抗的一个新突破点。

关键词： 2型糖尿病 RBP-4疫苗 db/db小鼠

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甘氨酸锌对甲肝抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响

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中国生物制品学杂志 2015年第6期28卷 575-578页

作者：陈振普王海漩胡凝珠胡云章昆明医科大学基础医学院云南昆明650500 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所疫苗研究室云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心云南昆明650118

目的探讨甘氨酸锌(glycine zinc)对甲型肝炎病毒(hapatitis A virus,HAV)抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法将ICR小鼠随机分为7组:甘氨酸锌(200μg,p H 6.5)+HAV组、甘氨酸锌(400μg,p H 6.5)+HAV组、甘氨酸锌(200μg,p H 7.5)+HAV... 详细信息

目的探讨甘氨酸锌(glycine zinc)对甲型肝炎病毒(hapatitis A virus,HAV)抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法将ICR小鼠随机分为7组:甘氨酸锌(200μg,p H 6.5)+HAV组、甘氨酸锌(400μg,p H 6.5)+HAV组、甘氨酸锌(200μg,p H 7.5)+HAV组、甘氨酸锌(400μg,p H 7.5)+HAV组、生理盐水对照组(生理盐水200μl)、HAV抗原对照组(HAV抗原)和铝佐剂对照组(铝佐剂300μg+HAV抗原),每组8只。HAV抗原剂量均为18 EU,各组均经腹部皮下多点注射,200μl/只,免疫1次。免疫4、8、12、16周后,采用间接ELISA法检测小鼠血清中抗-HAV抗原特异性Ig G抗体水平,并进行安全性试验。结果除生理盐水对照组外,其他各组小鼠免疫4周后均产生抗-HAV Ig G,并随着时间的延长呈上升趋势,于免疫后第8周达峰值,此后逐渐下降。不同甘氨酸锌佐剂组的抗体水平均明显高于HAV抗原对照组。免疫后第8周时,铝佐剂对照组和甘氨酸锌佐剂组的抗体水平均显著高于HAV抗原对照组(P均<0.05);甘氨酸锌(400μg,p H 6.5)佐剂组抗体水平与铝佐剂对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论甘氨酸锌能显著增强HAV抗原诱导小鼠的体液免疫应答,其体液免疫增强效果与铝佐剂相当。

关键词：甘氨酸锌佐剂甲肝抗原体液免疫

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USP18在丙肝病毒耐受Ⅰ型和Ⅲ型干扰素中的作用及分子机制:目标蛋白鉴定及功能研究

USP18在丙肝病毒耐受Ⅰ型和Ⅲ型干扰素中的作用及分子机制:目标蛋...

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第十一届全国病毒学学术研讨会暨第六届武汉现代病毒学国际研讨会

作者：焦佰海李世林陈利民中国医学科学院北京协和医学院输血研究所输血传染病研究中心四川省输血传播疾病重点实验室四川成都 610052 中国医学科学院北京协和医学院输血研究所输血传染病研究中心四川省输血传播疾病重点实验室四川成都 610052 加拿大多伦多大学

研究背景:丙型肝炎是由丙肝病毒(HCV)感染引起的一种严重肝脏疾病.目前缺乏治疗前疗效预测方法,且对丙肝病毒耐受干扰素的分子机理不清楚.我们前期研究在筛选出18个肝脏差异表达基因用于疗效预测(准确率96％)的基础上,发现内源性干扰素...

研究背景:丙型肝炎是由丙肝病毒(HCV)感染引起的一种严重肝脏疾病.目前缺乏治疗前疗效预测方法,且对丙肝病毒耐受干扰素的分子机理不清楚.我们前期研究在筛选出18个肝脏差异表达基因用于疗效预测(准确率96％)的基础上,发现内源性干扰素信号传导通路的激活导致干扰素刺激基因(ISG)在肝组织不同细胞内表达,特别是ISG15/USP18类泛素化通路的激活与HCV耐受干扰素及持续感染有关.

关键词：

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壳寡糖佐剂对甲型肝炎病毒疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响

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中国生物制品学杂志 2015年第5期28卷 475-478页

作者：李萍孙静王陈芸李彦涵李建芳乌美妮王海漩余柄廷胡凝珠胡云章中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所疫苗研究室云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心云南昆明650118 河北大学生命学院河北保定071000

目的探讨壳寡糖(chitooligosaccharide,COS)佐剂对甲型肝炎病毒(hapatitis A virus,HAV)疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法将ICR小鼠随机分成9组:甲型肝炎减毒活疫苗Hep A-l 18 EU+不同剂量COS(100μg、500μg、1 mg、2.5 mg、5 mg... 详细信息

目的探讨壳寡糖(chitooligosaccharide,COS)佐剂对甲型肝炎病毒(hapatitis A virus,HAV)疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法将ICR小鼠随机分成9组:甲型肝炎减毒活疫苗Hep A-l 18 EU+不同剂量COS(100μg、500μg、1 mg、2.5 mg、5 mg、10 mg)组、阴性对照组(生理盐水)、抗原对照组(Hep A-l 18 EU)和铝佐剂对照组[Hep A-l18 EU+Al(OH)3200μg],每组6只,各组均经皮下注射ICR小鼠,200μl/只。于免疫后的第4、8、12和16周,采用间接ELISA法检测小鼠血清中抗-HAV特异性Ig G抗体水平。在实验期间,观察小鼠的健康状况,并于免疫16周后,取COS最佳剂量组及阴性对照组小鼠肾脏、脾脏、肝脏、肺脏、心脏组织,制备病理切片,进行对比观察。结果除阴性对照组外,各组小鼠免疫4周后均产生抗-HAV Ig G抗体,并随着时间的延长呈上升趋势,在第8周时均达峰值,随后逐渐下降;COS 2.5 mg、5 mg和10 mg组小鼠血清在各时期的抗体水平均显著高于抗原对照组和铝佐剂对照组(P<0.05),且能维持较长时间,至16周抗体水平仍与铝佐剂对照组相当,差异无统计学意义(P>0.05),其中COS5 mg组在整个试验过程中产生的抗体水平均最高,且与2.5 mg组峰值水平差异有统计学意义(P<0.05),与10 mg组水平相当,至免疫后16周,COS 5 mg组与10 mg组抗体水平差异有统计学意义(P<0.05)。COS最佳剂量为5 mg/只。试验期内,观察小鼠各项生理指标未见异常,COS 5 mg组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织均未观察到病变。结论 COS可显著增强HAV疫苗诱导小鼠的体液免疫应答,有望开发为一种可替代铝佐剂的新型佐剂。

关键词：壳寡糖佐剂甲型肝炎病毒疫苗体液免疫

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中国农村食管癌高发区人群终生一次内镜筛查适宜年龄的卫生经济学评价

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中华肿瘤杂志 2015年第6期37卷 476-480页

作者：冯昊宋国慧杨娟郝长青王孟李变云赵德利刘志才魏文强乔友林北京协和医学院中国医学科学院肿瘤医院流行病学研究室 100021 河北省磁县肿瘤防治研究所中国疾病预防控制中心传染病预防控制处河南省林州市肿瘤医院山东省肥城市人民医院肿瘤研究中心

目的：对食管癌终生一次内镜筛查不同起始年龄筛查方案进行卫生经济学评价，探讨在中国农村食管癌高发区开展内镜筛查的适宜年龄。方法建立Markov模型，从卫生经济学和流行病学方面预测并比较不同起始年龄筛查方案终生一次内镜筛查的效... 详细信息

目的：对食管癌终生一次内镜筛查不同起始年龄筛查方案进行卫生经济学评价，探讨在中国农村食管癌高发区开展内镜筛查的适宜年龄。方法建立Markov模型，从卫生经济学和流行病学方面预测并比较不同起始年龄筛查方案终生一次内镜筛查的效果。结果与对照组比较，筛查起始年龄为40、45、50和55岁的筛查方案挽救生命年分别为629．51、769．88、738．98和533．21年／10万人，其中45岁组最高。各筛查方案与对照组比较，均符合成本？效果原则，其中40岁组筛查方案每挽救1个生命年所需成本最高，55岁组筛查方案每挽救1个生命年的成本低于对照组。45岁组和50岁组筛查方案具有优势，其增量成本依次为34962．87和3346．43元／年，50岁组筛查方案多挽救1个生命年增量成本相对较低。结论中国现行40岁起始筛查方案和其他起始年龄筛查方案均符合成本？效果原则，但起始年龄45岁组最符合成本？效果原则。综合考虑社会经济状况和各筛查方案的实际效果，建议在卫生资源匮乏的地区，以45岁作为食管癌终生一次内镜筛查的筛查起始年龄；在经济富裕地区，以40岁作为筛查的起始年龄，以获得更好的筛查效果。

关键词：食管肿瘤内镜筛查成本-效果分析

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人呼吸道合胞病毒截短F1蛋白的表达及免疫原性评价

人呼吸道合胞病毒截短F1蛋白的表达及免疫原性评价

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2015中国生物制品年会暨第十五次全国生物制品学术研讨会

作者：李华杨婷岳磊何晓娟朱凡丽谢天宏龙润乡杨蓉罗芳宇谢忠平中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的:克隆重组RSV A型Long株人呼吸道合胞病毒(HRSV)截短F1融合性蛋白,并评价其免疫原性. 方法:采用RT-PCR方法克隆RSV F1截短蛋白序列,克隆至pET28质粒表达载体,构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌Shuffle T7菌株,IPTG诱导表达,表... 详细信息

目的:克隆重组RSV A型Long株人呼吸道合胞病毒(HRSV)截短F1融合性蛋白,并评价其免疫原性. 方法:采用RT-PCR方法克隆RSV F1截短蛋白序列,克隆至pET28质粒表达载体,构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌Shuffle T7菌株,IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blots鉴定后,用Ni亲和层析柱进行纯化.重组蛋白免疫ICR小鼠,用ELISA方法检测血清抗体效价,进行其免疫原性评价. 结果:重组的原核表达质粒经双酶切及测序证明构建成功;表达的F1融合性蛋白片段大小1104bp,表达的蛋白大约368个氨基酸,其相对分子量为44KDa.表达的F1融合性蛋白以包涵体形式存在,纯化后蛋白纯度达90％.重组F1蛋白免疫小鼠效价最高可达1:4096. 结论:原核表达的重组RSV F1蛋白免疫原性好,为单克隆抗体的制备及检测试剂盒的研究奠定基础.

关键词：人呼吸道合胞病毒 F1融合性蛋白基因表达免疫原性

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病毒样颗粒呈递HPV16CTLs抗原表位对小鼠TC-1移植肿瘤韵免疫干预

病毒样颗粒呈递HPV16CTLs抗原表位对小鼠TC-1移植肿瘤韵免疫干预

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2015中国生物制品年会暨第十五次全国生物制品学术研讨会

作者：褚晓杰李杨龙琼夏烨姚宇峰孙文佳黄惟巍杨旭刘存宝马雁冰中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118 云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心昆明650118

目的:人乳头瘤病毒(HPV)治疗性疫苗在治疗宫颈上皮内瘤变或癌症的临床试验尚缺乏显著疗效.提高肿瘤抗原特异的细胞免疫应答是增强疫苗效力的关键.本研究旨在探索乙肝核心抗原病毒样颗粒(VLPs)作为治疗性疫苗载体的潜能,并评价其免疫学特... 详细信息

目的:人乳头瘤病毒(HPV)治疗性疫苗在治疗宫颈上皮内瘤变或癌症的临床试验尚缺乏显著疗效.提高肿瘤抗原特异的细胞免疫应答是增强疫苗效力的关键.本研究旨在探索乙肝核心抗原病毒样颗粒(VLPs)作为治疗性疫苗载体的潜能,并评价其免疫学特性. 方法:根据文献选择有效的HPV16E7CTLs表位,经基因重组将其DNA片段克隆于乙肝核心抗原优势表位.重组蛋白诱导表达后,经硫酸铵盐析法和蔗糖密度梯度离心纯化,并经高效液相凝胶过滤色谱和电镜分析鉴定.制备的VLPs以预防性和治疗性策略分别对小鼠移植肿瘤进行免疫干预,检测小鼠肿瘤大小变化;此外,在体外以抗原肽刺激脾细胞,以ELISA检测IFN-γ表达水平,ELISPOT检测分泌IFN-γ的淋巴细胞. 结果:呈递HPV16E749-57CTLs表位的重组VLPs可通过基因重组技术有效制备;VLPs预防性免疫完全抑制了TC-1小鼠移植肿瘤生长;VLPs治疗性免疫显著抑制了2-3mm肿瘤的增长,对于5～6mm甚至更大的肿瘤(8～9mm),同样具有明显抑制作用;VLPs结构对疫苗肿瘤抑制效果非常重要;疫苗免疫小鼠脾细胞具有提高的IFN-γ、降低的IL-4与TGF-β1表达,以及增强的分泌IFN-γ的淋巴细胞水平;此外,VLPs刺激机体产生了有效的免疫记忆应答,至少可持续15周;机体预存的抗载体抗体对VLPs疫苗发挥作用未产生显著影响. 结论:本研究强烈提示VLPs可激发有效的细胞免疫应答,是有潜力的治疗性疫苗载体.

关键词：宫颈上皮内瘤人乳头瘤病毒治疗性疫苗病毒样颗粒免疫学特性

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硫酸软骨素B佐剂对甲型肝炎病毒疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响

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中国生物制品学杂志 2015年第4期28卷 344-347页

作者：王陈芸孙静李萍余柄廷李建芳李彦涵王海漩乌美妮胡凝珠胡云章中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所疫苗研究室云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心云南昆明650118 河北大学生命学院河北保定071000

目的探讨硫酸软骨素B(chondroitin sulfate B,CSB)佐剂对甲型肝炎病毒((hepatitis A virus,HAV)疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响,以评价其佐剂效果。方法将ICR小鼠随机分成9组:甲型肝炎减毒活疫苗Hep A-l18 EU+不同剂量CSB(5、25、45、6... 详细信息

目的探讨硫酸软骨素B(chondroitin sulfate B,CSB)佐剂对甲型肝炎病毒((hepatitis A virus,HAV)疫苗诱导小鼠体液免疫应答的影响,以评价其佐剂效果。方法将ICR小鼠随机分成9组:甲型肝炎减毒活疫苗Hep A-l18 EU+不同剂量CSB(5、25、45、65、85、105μg)组、阴性对照组(生理盐水)、抗原对照组(Hep A-l 18 EU)和铝佐剂对照组[Hep A-l 18 EU+Al(OH)3300μg],每组8只,各组均经皮下注射ICR小鼠,200μl/只。于免疫后的第4、8、12和16周,采用间接ELISA法检测小鼠血清中抗-HAV特异性Ig G抗体水平。在实验期间,观察小鼠的健康状况,并于免疫16周后,取CSB 65μg组及阴性对照组小鼠肾脏、脾脏、肝脏、肺脏、心脏各主要器官,制备病理切片,进行对比观察。结果各组小鼠免疫后第4、8、12、16周,均产生抗-HAV Ig G抗体,除阴性对照组外,抗体水平均随时间的延长逐渐升高,于第8周达峰值,此后逐渐下降。CSB 65μg组抗体可长时间维持在高水平,至免疫后第12、16周,均高于抗原对照组(P<0.05),略高于铝佐剂对照组,最佳浓度为65μg/只。实验期间,各组小鼠均未出现异常;CSB65μg组小鼠肾脏、脾脏、肝脏、肺脏、心脏组织均未观察到病变。结论 CSB可明显增强HAV抗原诱导小鼠的体液免疫应答,具有成为新型疫苗佐剂的研发价值。

关键词：硫酸软骨素B 佐剂甲型肝炎病毒疫苗体液免疫

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反向遗传学在轮状病毒研究中的应用

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中国病原生物学杂志 2014年第1期9卷 74-76,87页

作者：谢力李鸿钧孙茂盛昆明学院医学院分子医学研究中心云南昆明650214 中国医学科学院医学生物学研究所/北京协和医学院云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

针对病毒的反向遗传技术可以在基因水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造,通过观察病毒的表型变化来判断这些基因操作的效果,从而达到研究病毒及其致病机制的目的。反向遗传技术在RNA病毒的研究中应用广泛,借助反向遗传技术调控病毒基... 详细信息

针对病毒的反向遗传技术可以在基因水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造,通过观察病毒的表型变化来判断这些基因操作的效果,从而达到研究病毒及其致病机制的目的。反向遗传技术在RNA病毒的研究中应用广泛,借助反向遗传技术调控病毒基因表达、揭示病毒蛋白功能已较为普遍,尤其是通过基因操作人工"合成"病毒的感染性克隆一直是近年来反向遗传学研究的热点领域。目前轮状病毒的反向遗传操作仅限于借助辅助病毒实现部分基因节段的修饰和替换,尚没有拯救完整病毒的报道。本文就反向遗传技术在RNA病毒拯救,特别是轮状病毒研究中的应用与进展作一简要综述。

关键词：轮状病毒反向遗传病毒拯救感染性克隆综述

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