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中国生物制品学杂志 2014年第4期27卷 448-452,457页

作者：金晓媚姚宇峰黄惟巍杨旭孙文佳刘存宝龙琼马雁冰中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心云南昆明650118

目的利用翻译延伸因子1-α(translation elongation factor 1-α,TEF1-α)启动子在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)16 L1蛋白。方法从毕赤酵母GS115中扩增组成型TEF1-α启动子(PTEF1-α)基因,通过基因重组替换... 详细信息

目的利用翻译延伸因子1-α(translation elongation factor 1-α,TEF1-α)启动子在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)16 L1蛋白。方法从毕赤酵母GS115中扩增组成型TEF1-α启动子(PTEF1-α)基因,通过基因重组替换商业化表达质粒pPink-HC和pPink-LC的启动子PAOX1;在PTEF1-α下游分别克隆绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因和HPV 16 L1基因,构建重组质粒pTEF-GFP和pTEF-16 L1;将重组质粒电转化感受态毕赤酵母PichiaPink strain 1,培养不同时间后,荧光显微镜下观察GFP的表达;分别在YPD、YPG、YPM、YPSor培养基中培养pTEF-16 L1转化菌,检测菌体在不同培养基中的增殖情况;Western blot检测HPV 16 L1蛋白的表达水平。结果重组质粒pTEF-GFP和pTEF-16 L1经双酶切鉴定和序列分析表明构建正确;荧光显微镜检测显示,在不同培养时间PTEF1-α指导了GFP的成功表达,且表达量随培养时间的延长而降低;重组毕赤酵母在YPD和YPG培养基中生长迅速;4种培养基中均有HPV 16 L1蛋白的特异性表达,且在YPG和YPSor培养基中获得了HPV 16 L1蛋白较持续的表达。结论成功实现了组成型启动子PTEF1-α控制的HPV16 L1蛋白的表达,为HPV疫苗的低成本及方便生产提供了一个可供选择的有效方案。

关键词：翻译延伸因子1-α 启动子毕赤酵母绿色荧光蛋白人乳头瘤病毒16 L1蛋白

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两种佐剂甘草酸二铵和苦参素对甲型肝炎病毒抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响

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中国生物制品学杂志 2014年第4期27卷 463-466页

作者：王霄罗婷李虹娟段志青王陈芸王海漩胡云章胡凝珠中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所疫苗研究室云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心云南昆明650118 昆明医科大学生物所云南昆明650500

目的探讨两种佐剂甘草酸二铵和苦参素对甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法将两种佐剂均按低(100μg)、中(500μg)、高(1 mg)3个剂量,分别与18 EU HAV抗原混合,免疫ICR小鼠,并设生理盐水对照组(... 详细信息

目的探讨两种佐剂甘草酸二铵和苦参素对甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法将两种佐剂均按低(100μg)、中(500μg)、高(1 mg)3个剂量,分别与18 EU HAV抗原混合,免疫ICR小鼠,并设生理盐水对照组(生理盐水200μl)、HAV抗原对照组(HAV抗原18 EU)和铝佐剂对照组(HAV抗原18 EU+铝佐剂300μg),共9组,均经腹部皮下多点注射,共免疫1次。分别于免疫后第4、8、12、16周采血,分离血清,采用ELISA法检测抗-HAV IgG抗体水平。免疫后第16周处死小鼠,分别取甘草酸二铵和苦参素最佳剂量组及生理盐水对照组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织,进行病理观察。结果免疫后第4、8、12、16周,除生理盐水对照组外,其他各组小鼠血清中均可检测到抗-HAV IgG抗体,且抗体水平除甘草酸二铵中剂量组和苦参素低剂量组外,均在第8周达峰值;甘草酸二铵各剂量组小鼠的血清抗体水平均明显高于HAV抗原对照组(P<0.05),其中甘草酸二铵低剂量组的抗体水平最高,且在第8周时超过铝佐剂对照组;苦参素各剂量组小鼠免疫后各周血清抗-HAV IgG抗体水平均显著高于HAV抗原对照组(P<0.05),其中苦参素低剂量组抗体水平最高,其抗体水平在第12周达峰值。实验期间,各组小鼠均未出现异常表现,各组织均未发现病理改变。结论甘草酸二铵和苦参素均能明显增强HAV抗原诱导小鼠体液免疫应答的水平,具有成为新型疫苗佐剂的研发价值。

关键词：甘草酸二铵苦参素佐剂甲型肝炎病毒抗原体液免疫

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PDX-1腺病毒载体构建及其在脂肪间充质干细胞中的表达

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生物学杂志 2014年第1期31卷 5-10页

作者：王晓囡周艳严敏鲁帅尧李松孙茂盛李鸿钧中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心云南省重大传染病疫苗研发实验室昆明650118

研究通过重组腺病毒表达系统包装重组腺病毒Ad-PDX-1,通过重组腺病毒将Pancreatic duodenal homeobox1(PDX-1)导入大鼠脂肪间充质干细胞(rat adipose mesenchymal stem cells,rASCs)中,评价PDX-1在rASCs中的表达情况,为进一步探讨ASCs-PDX-1在体内修复糖尿病的潜能提供了实验基础。研究通过构建pAdEasy-CMV-PDX-1腺病毒质粒,在重组腺病毒表达系统PadEasy-1中成功包装出重组腺病毒Ad-PDX-1。培养及鉴定大鼠脂肪间充质干细胞,将携带PDX-1的重组腺病毒感染rASCs,通过RT-PCR、免疫荧光及免疫印迹(Western blotting)检测PDX-1在rASCs中的表达及产物定位。结果显示,构建的重组腺病毒包装成功,具有较高滴度,并能成功感染大鼠脂肪间充质干细胞。PDX-1蛋白定位于细胞核,并可稳定表达,为后续将大鼠脂肪间充质干细胞向胰岛β细胞诱导分化奠定了基础,为糖尿病的干细胞治疗提供依据。

关键词：胰腺十二指肠同源框蛋白1 脂肪间充质干细胞腺病毒载体

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酵母多糖-角鲨烯复合佐剂对甲型肝炎和乙型肝炎抗原诱导小鼠体液免疫应答的增强作用

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中国生物制品学杂志 2013年第4期26卷 473-476页

作者：王丽萍王越王海漩胡云章胡凝珠中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所疫苗研究室云南省重大传染病重点实验室云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心云南昆明650118

目的探讨酵母多糖-角鲨烯复合佐剂对甲型肝炎(简称甲肝)和乙型肝炎(简称乙肝)抗原诱导小鼠体液免疫应答的增强作用,并对皮下和鼻腔接种的免疫效果进行比较。方法将酵母多糖与角鲨烯按一定比例混合,制成复合佐剂,将不同剂量的复合佐剂与H... 详细信息

目的探讨酵母多糖-角鲨烯复合佐剂对甲型肝炎(简称甲肝)和乙型肝炎(简称乙肝)抗原诱导小鼠体液免疫应答的增强作用,并对皮下和鼻腔接种的免疫效果进行比较。方法将酵母多糖与角鲨烯按一定比例混合,制成复合佐剂,将不同剂量的复合佐剂与HBsAg混合,并设生理盐水对照组、HBsAg对照组、铝佐剂对照组和酵母多糖对照组,均经皮下免疫ICR小鼠1次,分别于免疫后2、4、8、16周,采用ELISA法检测小鼠血清中抗HBsAg IgG抗体水平,筛选复合佐剂的最佳免疫剂量。以复合佐剂的最佳免疫剂量与甲肝抗原混合,并设生理盐水对照组、甲肝抗原对照组、铝佐剂对照组和酵母多糖对照组,均经皮下免疫ICR小鼠1次,分别于免疫后2、4、8周检测小鼠血清中抗甲肝抗原IgG抗体水平。以复合佐剂最佳免疫剂量分别与HBsAg和甲肝抗原混合,并设生理盐水对照组、HBsAg对照组和甲肝抗原对照组,经鼻腔免疫ICR小鼠,共免疫3次,间隔2周,分别于末次免疫后4、8周检测小鼠血清中抗HBsAg和甲肝抗原IgG抗体水平。在试验期间,对小鼠的健康状况进行观察,并对小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织进行病理分析。结果酵母多糖-角鲨烯复合佐剂对HBsAg的最佳免疫剂量为2 mg酵母多糖+8μl角鲨烯,该组抗体水平明显高于铝佐剂对照组和酵母多糖对照组(P<0.05);复合佐剂对甲肝抗原也有较好的体液免疫增强作用,抗体水平显著高于铝佐剂对照组和酵母多糖对照组(P<0.05);复合佐剂通过鼻腔免疫,对HBsAg和甲肝抗原的体液免疫应答也有增强作用,但效果不如皮下免疫,甲肝抗原鼻腔免疫效果优于HBsAg(P<0.05)。在试验期内,小鼠均未出现异常反应,各器官均未发生病变。结论酵母多糖-角鲨烯复合佐剂能显著增强甲肝和HBsAg抗原对小鼠的体液免疫应答,免疫效果优于铝佐剂;皮下免疫效果优于鼻腔免疫;在免疫剂量范围内,复合佐剂安全性良好。

关键词：酵母多糖角鲨烯佐剂乙型肝炎表面抗原甲型肝炎抗原

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Cox A16抗原检测试剂研究及初步应用

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中国卫生检验杂志 2013年第4期23卷 801-805页

作者：刘正玲李华龙润乡杨婷杨蓉岳磊谢忠平中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的:建立柯萨奇病毒A组16型抗原检测酶联免疫法,为疫苗研发及病原学检查提供有效的技术手段。方法:以CA16多抗为包被抗体,以辣根过氧化物酶标记抗体为指示物建立CA16抗原ELISA检测法,对其线性、灵敏度、特异度、精密度及稳定性等指标... 详细信息

目的:建立柯萨奇病毒A组16型抗原检测酶联免疫法,为疫苗研发及病原学检查提供有效的技术手段。方法:以CA16多抗为包被抗体,以辣根过氧化物酶标记抗体为指示物建立CA16抗原ELISA检测法,对其线性、灵敏度、特异度、精密度及稳定性等指标进行分析。将所建立的方法应用到疫苗研发及病原检测中进行验证及评价。结果:建立的CA16抗原ELISA检测线性范围为1.25μg/ml～80μg/ml,R2达0.98以上;最低检测下限为1.25μg/ml,可检测到2×102CCID50～9×103CCID50活病毒;与CA16以外的10种肠道病毒无交叉反应;变异系数CV小于15%。与荧光PCR、中和法鉴定结果一致性高。结论:建立的ELISA法各项性能符合抗原检测要求,可用于CA16疫苗研发及病原学检查。

关键词：手足口病肠道病毒柯萨奇病毒A组16型

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氢氧化锌与硫酸乙酰肝素复合佐剂对狂犬病疫苗诱导的小鼠体液免疫应答的作用

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中国生物制品学杂志 2013年第5期26卷 608-610,620页

作者：蔡泓志孙静王海漩胡凝珠胡云章中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所疫苗研究室云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心云南昆明650118

目的探讨氢氧化锌与硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)复合佐剂对狂犬病疫苗诱导的小鼠体液免疫应答的影响。方法取64只ICR小鼠随机分为8组,每组8只,分别为复合佐剂(0.27 mg氢氧化锌,100μg HS,0.125 IU狂犬病疫苗)1、2、3次免疫组,狂... 详细信息

目的探讨氢氧化锌与硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)复合佐剂对狂犬病疫苗诱导的小鼠体液免疫应答的影响。方法取64只ICR小鼠随机分为8组,每组8只,分别为复合佐剂(0.27 mg氢氧化锌,100μg HS,0.125 IU狂犬病疫苗)1、2、3次免疫组,狂犬病疫苗1、2、3次免疫组,狂犬病疫苗常规5次免疫组,生理盐水对照组。均经小鼠胫骨前肌免疫,除狂犬病疫苗常规5次免疫组于0、3、7、14、28 d进行免疫外,其他各组均为隔周免疫。分别于初免疫后1、2、3、4、8、12、16周经尾静脉采血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清中抗-狂犬病毒(Rabies virus,RABV)IgG水平。结果初免后1周,除生理盐水对照组小鼠血清未检测到抗-RABV IgG外,各实验组均产生抗-RABV特异性IgG;所有复合佐剂组在初免后3周均可产生高水平的IgG,初免后12周反弹性升高达到峰值,第16周仍维持较高水平。初免后1、2、3、4、8、12、16周,复合佐剂1、2、3次免疫组IgG水平均高于狂犬病疫苗相同次数免疫组,差异均有统计学意义(P均<0.05),且IgG水平持续时间较长。初免后2周,复合佐剂2、3次免疫组的IgG水平均高于狂犬病疫苗常规5次免疫组(3次免疫后);初免后3周,复合佐剂3次免疫组的IgG水平高于狂犬病疫苗常规5次免疫组(4次免疫后)(P均<0.05)。结论氢氧化锌和HS复合佐剂能增强狂犬病疫苗诱导的小鼠体液免疫应答。

关键词：氢氧化锌硫酸乙酰肝素佐剂狂犬病疫苗体液免疫

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呈现人白细胞介素-13抗原表位的病毒样颗粒疫苗的构建

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中国生物制品学杂志 2013年第11期26卷 1533-1539页

作者：唐增华龙琼姚宇峰黄惟巍杨旭孙文佳刘存宝马雁冰魏云林中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南昆明650118 昆明理工大学生命科学与技术学院云南昆明650500 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心云南昆明650118

目的构建呈现人白细胞介素-13(interleukin-13,IL-13)抗原表位的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗,为开展IL-13主动免疫干预慢性哮喘进程的研究奠定基础。方法通过抗原性及亲水性预测并结合三维结构分析,获得处于人IL-13分子... 详细信息

目的构建呈现人白细胞介素-13(interleukin-13,IL-13)抗原表位的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗,为开展IL-13主动免疫干预慢性哮喘进程的研究奠定基础。方法通过抗原性及亲水性预测并结合三维结构分析,获得处于人IL-13分子与其受体结合部位潜在的B细胞表位;根据预测的人IL-13抗原肽,合成寡核苷酸序列,并经变性、退火形成双链DNA片段,插入表达乙肝核心抗原(HBcAg)的pThioHisA-HBcAg(NP)载体中,构建重组表达质粒,转化感受态大肠埃希菌(***)DH5α,IPTG诱导表达;表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析后,经硫酸铵沉淀、洗涤初步纯化,并经凝胶过滤层析、密度梯度离心、电镜观察检测其VLPs的存在;将纯化后的重组蛋白在不使用任何常规佐剂的情况下免疫昆明小鼠,ELISA法检测小鼠血清中IL-13特异性抗体的滴度。结果预测分析获得了3个潜在的B细胞表位;3个重组表达质粒pThioHisA(NP)-A、B、C经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白HBcAg+A、B、C相对分子质量分别约为20 000、19 000、18 500,可被兔抗人IL-13多克隆抗体特异性识别,并以VLPs形式存在;HBcAg+A和HBcAg+B重组蛋白诱导小鼠产生了较强的抗体应答,血清中IL-13抗体滴度最高可达1∶64 000,而HBcAg+C重组蛋白未见特异抗体应答。结论成功构建了呈现人IL-13抗原表位的VLPs疫苗,该疫苗可有效打破B细胞免疫耐受,免疫小鼠后产生了高滴度的特异性抗体,为进一步在猴体哮喘模型和人类临床试验中开展IL-13疫苗主动免疫干预哮喘疾病进程的研究奠定了基础。

关键词：白细胞介素-13 病毒样颗粒疫苗

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中国鼠疫自然疫源地分型研究Ⅳ．鼠疫耶尔森菌生物型生物学特征的探讨

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中华流行病学杂志 2012年第6期33卷 626-629页

作者：方喜业周冬生崔玉军李艳君刘起勇李贵昌许磊杨瑞馥中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学研究中心北京100021 中国军事医学科学院微生物流行病研究所中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室中国科学院动物研究所

鼠疫菌生物型是鼠疫菌起源进化遗传性状最稳定的生物学标准，是鼠疫起源进化普系的“活化石”，也是该菌起源进化最具代表性的模式。依据其对甘油和阿拉伯糖的酵解和还原硝酸盐的能力，鼠疫菌可分为4种生物型，即古典型（甘油酵解阳性... 详细信息

鼠疫菌生物型是鼠疫菌起源进化遗传性状最稳定的生物学标准，是鼠疫起源进化普系的“活化石”，也是该菌起源进化最具代表性的模式。依据其对甘油和阿拉伯糖的酵解和还原硝酸盐的能力，鼠疫菌可分为4种生物型，即古典型（甘油酵解阳性，阿拉伯糖酵解阳性，硝酸盐还原阳性）、中世纪型（甘油酵解阳性，阿拉伯糖酵解阳性，硝酸盐还原阴性）、东方型（甘油酵解阴性，阿拉伯糖酵解阳性，硝酸盐还原阳性）和田鼠型（甘油酵解阳性，阿拉伯糖酵解阴性，硝酸盐还原阴性）。前三种生物型与人类历史3次鼠疫大流行相对应，最后一种生物型对人不致病，但能造成田鼠鼠疫并在其自然疫源地内流行。目前中国鼠疫自然疫源地有4种鼠疫菌生物型。

关键词：鼠疫耶尔森菌生化表型鼠疫菌生物型

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中国鼠疫自然疫源地分型研究Ⅵ．鼠疫媒介生物学特征

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中华流行病学杂志 2012年第8期33卷 818-822页

作者：龚正达于心刘起勇叶瑞玉鲁亮许磊张金桐李超白学礼方喜业云南省地方病防治研究所大理671000 新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、传染病预防控制国家重点实验室中国科学院动物研究所中国军事医学科学院微生物流行病研究所青海省地方病防治所宁夏回族自治区疾病预防控制中心中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学研究中心

目的研究中国鼠疫自然疫源地鼠疫媒介生物学特征。方法应用昆虫分类学技术，鉴定整理中国鼠疫媒介种属和宿主关系及其区系分布；通过微生物学、昆虫生态学综合实验，了解鼠疫媒介在中国鼠疫自然疫源地的生态作用和生物学特征。结果中国... 详细信息

目的研究中国鼠疫自然疫源地鼠疫媒介生物学特征。方法应用昆虫分类学技术，鉴定整理中国鼠疫媒介种属和宿主关系及其区系分布；通过微生物学、昆虫生态学综合实验，了解鼠疫媒介在中国鼠疫自然疫源地的生态作用和生物学特征。结果中国鼠疫媒介有63种，其中主要媒介28种，次要媒介35种。结论明确了中国鼠疫主要媒介在鼠疫自然疫源地的生态作用和生物学特征。

关键词：鼠疫主要媒介鼠疫次要媒介

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中国鼠疫自然疫源地分型研究I．生态地理景观特征

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中华流行病学杂志 2011年第12期32卷 1232-1236页

作者：方喜业许磊刘起勇张荣祖中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学研究中心北京100021 中国科学院动物研究所中国疾病预防控制中心传染病预防控制所中国科学院地理研究所

目的研究中国鼠疫自然疫源地鼠疫生态地理景观特征。方法根据中国鼠疫疫情资料和对中国鼠疫自然疫源地生态地理景观的考察，制定鼠疫生态地理景观区划标准，建立反映鼠疫生态地理景观特征的方法。结果中国鼠疫自然疫源地鼠疫生态地理景... 详细信息

目的研究中国鼠疫自然疫源地鼠疫生态地理景观特征。方法根据中国鼠疫疫情资料和对中国鼠疫自然疫源地生态地理景观的考察，制定鼠疫生态地理景观区划标准，建立反映鼠疫生态地理景观特征的方法。结果中国鼠疫自然疫源地鼠疫生态地理景观有12型、19亚型。结论为中国鼠疫自然疫源地分型研究提供了科学依据。

关键词：鼠疫自然疫源地鼠疫生态地理景观

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