检索结果-内蒙古大学图书馆

中国解剖学会2013年年会

作者：解玲郑炜王占友中国医科大学病理生理学教研室和教育部医学细胞生物学重点实验室辽宁医学院人体解剖学教研室

阿尔茨海默病是一种以进行性痴呆为主要特征的神经系统退行性疾病,tau蛋白异常磷酸化是其主要病理变化之一。目前研究显示tau蛋白与铁离子的聚集及转运体DMT1具有密切相关性。为了探讨小分子ebselen是否能通过抑制DMT1对二价铁离子的转... 详细信息

阿尔茨海默病是一种以进行性痴呆为主要特征的神经系统退行性疾病,tau蛋白异常磷酸化是其主要病理变化之一。目前研究显示tau蛋白与铁离子的聚集及转运体DMT1具有密切相关性。为了探讨小分子ebselen是否能通过抑制DMT1对二价铁离子的转运,从而拮抗铁诱导的SH-SY5Y细胞内tau蛋白磷酸化。本实验以SH-SY5Y细胞作为体内研究模型,采用MTT法分析细胞活力;Western Blot法进行半定量分析tau蛋白及磷酸化

关键词： tau ebselen 磷酸化抑制物拮抗作用

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前列地尔对SUMO介导的2型糖尿病大鼠脑组织病变的作用

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心血管康复医学杂志 2013年第6期22卷 583-586页

作者：杨红艳徐锦春陈思娇郭英华张怡舜梁怡凡贺诗元董思雨何欢宋今丹中国医科大学附属第一医院老年病教研室辽宁沈阳110001 本溪市铁路医院内科中国医科大学中国医科大学医学分子生物学研究所卫生部细胞生物学重点实验室

目的:探讨小泛素样修饰蛋白(SUMO)化修饰对核因子(NF)-κB通路激活的负性调控在2型糖尿病大鼠脑部病变中的干预作用,为前列地尔对其病变的早期干预提供依据。方法:随机抽取40周龄的10只GK大鼠为前列地尔组(前列地尔2.5μg/g,尾尖静脉注... 详细信息

目的:探讨小泛素样修饰蛋白(SUMO)化修饰对核因子(NF)-κB通路激活的负性调控在2型糖尿病大鼠脑部病变中的干预作用,为前列地尔对其病变的早期干预提供依据。方法:随机抽取40周龄的10只GK大鼠为前列地尔组(前列地尔2.5μg/g,尾尖静脉注射给药,1次/d,共10d)、10只为糖尿病对照组,另取10只Wistar雄性大鼠作为正常对照组。正常对照组和糖尿病对照组给予等剂量生理盐水,均为尾尖静脉注射给药。三组均给予普通饲料。测定和观察血糖、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)变化及NF-κB抑制因子(IκB)、NF-κB、SUMO1的水平变化。结果:(1)糖尿病对照组、前列地尔组大鼠的血糖、TG、TC均显著高于正常对照组(P均<0.05);(2)HE染色观察:正常对照组脑组织细胞形态正常,糖尿病对照组、前列地尔组脑组织可见细胞肥大,疏松样改变,前列地尔组病变较轻;(3)免疫组化测定的IκB、NF-κB、SUMO1:正常对照组少许阳性表达,糖尿病对照组、前列地尔组表达均显著增加(P<0.05或<0.01),但前列地尔组较糖尿病对照组IκB[(0.242±0.034)比(0.268±0.017)]、NF-κB[(0.373±0.015)比(0.486±0.013)]表达显著减少,SUMO1[(0.463±0.015)比(0.343±0.018)]表达显著增加(P均<0.05)。结论:小泛素样修饰蛋白在糖尿病大鼠脑组织表达增多,在前列地尔组表达更多,前列地尔对糖尿病大鼠脑组织病变有一定改善作用。

关键词：糖尿病 2型 NF—κB 小泛素相关修饰蛋白质类前列地尔

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一成骨不全家系的基因突变分析

一成骨不全家系的基因突变分析

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中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会

作者：陈晨曹丽华马旭罗阳中国医科大学医学基因组学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室沈阳市骨科医院骨科研究所病房

目的成骨发育不全(osteogenesis imperfecta,OI)是一种最常见的遗传性骨骼脆性增加的疾病,以骨脆性增加或畸形,蓝色巩膜,身材矮小,牙本质发育不全及听力损害为主要特征。大多数病例是编码Ⅰ型胶原Ⅱ链的COLlA1或COLlA2基因突变所致,一... 详细信息

目的成骨发育不全(osteogenesis imperfecta,OI)是一种最常见的遗传性骨骼脆性增加的疾病,以骨脆性增加或畸形,蓝色巩膜,身材矮小,牙本质发育不全及听力损害为主要特征。大多数病例是编码Ⅰ型胶原Ⅱ链的COLlA1或COLlA2基因突变所致,一般呈常染色体显性遗传方式。本研究针对一中国成骨不全家系进行基因突变分析,以明确其致病突变。方法在签署知情同意后,采集该家系中患者和表型正常个体外周静脉血3ml,使用UniversalGenomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(TaKaRa)试剂盒提取基因组DNA,对COL1A1和COL1A2基因外显子进行PCR扩增,对扩增产物进行测序分析;同时采用PCR-RFLP方法通过聚丙烯酰胺凝胶电泳验证所发现的变异在人群中存在的频率;在COL1A1基因及其上下游区域选取两个微卫星标记WI-6632,D7S657和一个短串联重复AC*21,在COL1A2基因及其上下游区域选取5个微卫星标记D17S1293,D17S1868,D17S1180,D17S1319和D17S788,PCR扩增以上遗传标记并进行单体型分析;针对可能的致病突变,进行RNA水平的分析,Trizol法提取新鲜外周静脉血中总RNA,使用PrimeScript(?)RT reagent Kit(TaKaRa)反转录并用基因特异性引物扩增突变位点所在区域,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物大小,同时进行克隆测序分析。结果在先证者COL1A2基因发现杂合突变c.3313G>A(***1105Ser),但在家系中该突变不与患者共分离;在先证者COL1A1基因发现杂合突变c.1299+5G>C,该突变在家系中与患者共分离。在146个无关正常个体中均未发现存在以上两个突变。单体型分析结果支持该家系中COL1A1基因致病,不支持COL1A2基因致病。针对c.1299+5G>C突变,进行RNA剪切分析,琼脂糖凝胶电泳显示患者COL1A1基因的扩增子与家系中正常个体大小一致。对扩增产物进行克隆测序分析显示存在剪接改变,在原始剪接位点前缺失8个碱基,即c.1292 1299del(***432*)。结论以上结果在DNA水平和RNA水平初步证实该成骨不全家系为COL1A1基因致病,其致病突变c.1292 1299del为国际首报;COLlA2基因突变c.3313G>A在国际上已经报道过2次,其在成骨不全致病机制中的作用有待进一步研究,推测其也可能为罕见的SNP位点。

关键词：成骨发育不全 COL1A1 COL1A2 基因突变

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家族性慢性良性天疱疮的致病基因突变研究

家族性慢性良性天疱疮的致病基因突变研究

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第十二次全国医学遗传学学术会议

作者：邢雪莎王珍刘双吴雨虹罗阳中国医科大学医学基因组学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室沈阳市第七人民医院皮肤科

目的家族性慢性良性天疱疮(Hailey-Hailey Disease,HHD)是一种少见的常染色体显性遗传性大疱性皮肤病,70%的患者有家族史,多于青春期以后发病。HHD典型的临床特征为皮肤皱褶部位反复出现瘙痒性水疱、糜烂。出汗、摩擦、皮肤感染等外界... 详细信息

目的家族性慢性良性天疱疮(Hailey-Hailey Disease,HHD)是一种少见的常染色体显性遗传性大疱性皮肤病,70%的患者有家族史,多于青春期以后发病。HHD典型的临床特征为皮肤皱褶部位反复出现瘙痒性水疱、糜烂。出汗、摩擦、皮肤感染等外界因素可诱发该病或病情加重。该病是由ATP2C1基因突变所致,ATP2C1基因定位于3q21-24,全长107.46kb,包含28个外显子,编码919个氨基酸。4TP2C1基因突变,遍布于整个基因,没有热点区域,其中以错义突变和无义突变为主。方法设计PCR引物,扩增覆盖ATP2C1基因外显子及外显子-内含子交界区并直接测序分析,利用PCR结合限制性内切酶片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)对100名正常人进行该位点突变分析。构建mini-pCAS-ATP2C1野生及突变型载体,转染HeLa细胞后提取总RNA,RT-PCR及测序分析mRNA的剪切改变并从患者全血中提取RNA进行验证。结果家系中先证者携带ATP2C1基因杂合错义突变c.1413G>C,(*** 470 His),该突变导致ATP2C1蛋白470位谷氨酰胺变成组氨酸。检索人类基因突变数据库(http://***/ac/***)未发现上述突变的报道。PCR-RFLP结果显示,100名正常人均未检测到相同变异。由于该突变位点位于第15外显子最后一位碱基,推测其可能影响剪切位点的识别。转染mini-pCAS-ATP2C1野生和突变型载体后结果显示mini-pCAS-ATP2C1野生型载体和空载均能够进行正常剪切,而mini-pCAS-4TP2C1突变型载体发生外显子16跳跃。再次对患者外周血中RNA进行RT-PCR结果证实患者体内存在缺少外显子16的突变型转录本,并未激活隐蔽性剪切位点,与mini-pCAS载体预测的结果一致。16外显子的缺失将会导致ATP2C1蛋白的整码突变,从437位甲硫氨酸到471位谷氨酰胺将会缺失。结论14TP2C1基因c.1413G>C,(*** 470His)为该HHD家系致病突变,丰富了4TP2C1基因突变数据库,也为该HHD家系的遗传咨询和产前诊断提供实验依据。2.剪切位点附近的碱基改变可能影响剪切位点的识别,从而导致基因的转录异常。3.在RNA样本获得困难的情况下,体外minipCAS载体能够有效的预测突变对剪切的影响,为进一步分析突变基因所产生的功能变化提供依据。

关键词：家族性慢性良性天疱疮 ATP2C1基因体外剪切分析 pCAS载体

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Smad2/3/4真核表达质粒的构建及重组蛋白表达

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吉林大学学报（医学版） 2012年第2期38卷 202-206页

作者：张红艳王春玉姚远李彦姝王迪李丰中国医科大学细胞生物学教研室卫生部细胞生物学重点实验室教育部医学细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110001 辽宁省人民医院消化内科辽宁沈阳110016

目的:构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内表达。方法:以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Smad2/3/4全长编码基因,亚克隆至含有pcDNA3.1myc-HisA标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293中,提取细胞蛋白进行Western blotting检测。结果:Smad2/3/4全长基因序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1myc-HisA中,酶切鉴定片段为1 401、1 275和1 656 bp。Western blotting检测到融合蛋白pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4的表达。结论:成功构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达。

关键词： Smad 蛋白免疫印记融合蛋白

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hβ-arrestin1重组蛋白不同亚型筛选及互作鉴定

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中国医科大学学报 2012年第1期41卷 24-27页

作者：刘彩红王利利冯艳玲朱亚勤中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室细胞病理生物学研究室沈阳110001

目的构建GST/β-arrestin1融合蛋白表达载体,筛选其不同亚型重组子,并诱导表达、纯化蛋白,初步进行蛋白亚型互作比较,为进一步功能研究提供实验基础。方法提取人源细胞的mRNA,反转录为cDNA。用PCR法扩增hβ-arrestin1全长编码基因,通过S... 详细信息

目的构建GST/β-arrestin1融合蛋白表达载体,筛选其不同亚型重组子,并诱导表达、纯化蛋白,初步进行蛋白亚型互作比较,为进一步功能研究提供实验基础。方法提取人源细胞的mRNA,反转录为cDNA。用PCR法扩增hβ-arrestin1全长编码基因,通过SalI和NotI酶切位点将hβ-arrestin1全长定向插入pGEX-5X-1中,构建原核表达载体pGEX-5X-1-β-arrestin1,并通过BglⅡ单酶切筛选A、B亚型,然后将重组质粒转入*** BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,用谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化表达的GST/β-arrestin1A、B,SDS-PAGE鉴定,互作实验比较亚型的结合能力。结果酶切及测序结果证明,成功构建了β-arrestin1A、B原核表达载体,并通过SDS-PAGE证实:经IPTG诱导表达及亲和纯化,从转化重组质粒的BL21菌株中获得了融合蛋白GST/β-arrestin1A、B亚型,通过GST Pulldown初步比较了重组β-arrestin1A、B蛋白亚型的结合能力。结论成功构建pGEX-5X-1-β-arrestin1A、B原核表达载体并确定了融合蛋白的诱导表达及纯化方法,且互作实验显示β-arrestin1A有较强的结合能力,为进一步研究β-arrestin1的生物学功能奠定了基础。

关键词： hβ—arrestin1 克隆重组亚型表达蛋白互作

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高GC hTwist融合蛋白载体构建及其表达条件优化

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中国医科大学学报 2012年第3期41卷 204-207页

作者：王利利刘彩红朱亚勤教育部医学细胞生物学重点实验室细胞病理生物学研究室中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室沈阳110001

目的构建高GC基因Twist融合蛋白表达载体;高效表达并纯化GST/TWIST融合蛋白,为GST-Pulldown等实验做准备。从而进一步研究其生物学功能。方法以胃癌细胞系SGM7901 cDNA为模板,依据高GC含量基因Twist分子结构特点和高GC含量基因引物设计... 详细信息

目的构建高GC基因Twist融合蛋白表达载体;高效表达并纯化GST/TWIST融合蛋白,为GST-Pulldown等实验做准备。从而进一步研究其生物学功能。方法以胃癌细胞系SGM7901 cDNA为模板,依据高GC含量基因Twist分子结构特点和高GC含量基因引物设计策略,合成PCR引物。本实验通过分析各种DNA聚合酶不同扩增效率及特异性,选择适合高GC基因扩增的DNA聚合酶,优化反应体系的离子强度,并且结合改良降落PCR等综合策略的实施,比较不同策略下高GC含量基因Twist PCR产物的特异性及效率,尝试高效扩增特异的高GC含量Twist全长编码基因,通过Bam HI和Xho I双酶切位点将Twist全长定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist,并转化*** DH5α,筛选富含GC的Twist阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测序正确后,转化*** BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果通过Platinum pfx DNA聚合酶配合PCRx加强缓冲液的使用及改良降落PCR策略的实施,独立可重复实验证实:我们获得了高效特异的高GC Twist全长编码基因,成功构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist。诱导表达的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定,检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化,得到高纯度的融合蛋白。结论上述策略的实施可以成功完成高GC Twist原核表达载体的构建,并确定GST/TWIST融合蛋白表达的最适条件,获得了高纯度融合蛋白,为进一步研究TWIST蛋白的生物学功能奠定基础。

关键词：高GC hTwist 克隆融合蛋白原核表达

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TGF-β1上调MTA1促进人舌癌Tca8113细胞侵袭转移

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现代肿瘤医学 2013年第5期21卷 950-952页

作者：代炜姚远李彦姝周青中国医科大学口腔医学院口腔颌面-头颈肿瘤外科口腔颌面外科辽宁省口腔医学研究所口腔颌面外科研究室辽宁省人民医院消化内科辽宁沈阳110002 中国医科大学细胞生物教研室细胞生物学卫生部重点实验室辽宁沈阳110016

目的:研究TGF-β1上调MTA1能否促进人舌癌Tca8113细胞侵袭转移。方法:蛋白印迹和实时定量PCR检测TGF-β1刺激或者不刺激的Tca8113细胞中MTA1和E-cadherin的表达。β-actin作为实验的内参对照。光学显微镜拍摄TGF-β1刺激的Tca8113细胞... 详细信息

目的:研究TGF-β1上调MTA1能否促进人舌癌Tca8113细胞侵袭转移。方法:蛋白印迹和实时定量PCR检测TGF-β1刺激或者不刺激的Tca8113细胞中MTA1和E-cadherin的表达。β-actin作为实验的内参对照。光学显微镜拍摄TGF-β1刺激的Tca8113细胞形态。侵袭实验检测TGF-β1刺激的Tca8113细胞。结果:TGF-β1上调MTA1蛋白和mRNA表达,下调E-cadherin表达水平。Tca8113细胞是呈多边形的口腔鳞状上皮细胞癌,经TGF-β1刺激的Tca8113细胞形态变成长梭形。同时,TGF-β1刺激的Tca8113细胞与对照相比较具有更强的侵袭能力。结论:TGF-β1信号能通过MTA1下调E-cadherin表达,这可能是促进舌癌侵袭和转移的机制之一。

关键词：转化生长因子β1 转移相关蛋白1 E-钙粘素侵袭转移

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PAK4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

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吉林大学学报（医学版） 2012年第1期38卷 11-14,F0002页

作者：代炜张红艳李彦姝李妍孙长伏中国医科大学口腔医学院口腔颌面外科口腔颌面-头颈肿瘤外科辽宁沈阳110002 中国医科大学细胞生物学教研室细胞生物学卫生部重点实验室辽宁沈阳110001

目的:构建PAK4基因RNAi慢病毒载体,并对其在涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-83细胞中干扰效率进行鉴定。方法:针对PAK4基因RNAi有效靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切后的pGCsil-GFP载体连接产生shPAK4i-LV慢病毒... 详细信息

目的:构建PAK4基因RNAi慢病毒载体,并对其在涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-83细胞中干扰效率进行鉴定。方法:针对PAK4基因RNAi有效靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ酶切后的pGCsil-GFP载体连接产生shPAK4i-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用shPAK4i-LV载体、pHelper1.0载体和pHelper 2.0质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达水平测定病毒滴度。结果:PCR扩增出插入片段,测序证实成功构建了PAK4-shRNA慢病毒载体shPAK4i-LV。包装并浓缩慢病毒,滴度为2E+***-1。将病毒感染SACC-83细胞,real-time PCR检测PAK4的mRNA表达下调70%以上。结论:成功构建了shPAK4i-LV病毒载体并建立了SACC-83-shPAK4i细胞模型,为PAK4在肿瘤信号转导通路中的研究提供工作基础。

关键词： RNA干扰 PAK4基因质粒构建慢病毒癌,腺样囊性

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Flag标签MORC2-677丝氨酸位点突变载体构建及表达

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生命科学研究 2012年第1期16卷 1-5页

作者：王桂玲王孝会程正国宋艳艳李丰中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室教育部细胞生物学重点实验室中国辽宁沈阳110001

构建Flag标签pcDNA3.1-MORC2的677丝氨酸位点突变重组质粒并完成在SGC-7901细胞中表达,更好地研究677丝氨酸位点所发生的功能.首先,构建含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点Flag标签的pcDNA3.1空载体;再以含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点的pcDNA3.1A-MOR... 详细信息

构建Flag标签pcDNA3.1-MORC2的677丝氨酸位点突变重组质粒并完成在SGC-7901细胞中表达,更好地研究677丝氨酸位点所发生的功能.首先,构建含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点Flag标签的pcDNA3.1空载体;再以含有KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点的pcDNA3.1A-MORC2-WT野生型质粒为模板,在S677突变位点两侧设计重叠突变引物,进行三轮重叠延伸PCR完成定点突变,获得MORC2全长编码序列的S677位点的定点突变体载体(pcDNA3.1A-MORC2-S677A/S677E);再通过KpnⅠ和XhoⅠ酶切把pcDNA3.1A-MORC2-WT/S677A/S677E各载体定向克隆到已构建好的pcDNA3.1-Flag空载体中,酶切鉴定及测序正确后,转染到SGC-7901细胞中,利用Flag–标签抗体,Western blot检测其各突变载体的表达.成功构建了人Flag标签MORC2全长编码序列S677位点突变体真核表达载体并在SGC-7901细胞中获得带Flag标签融合蛋白表达产物,为进一步研究MORC2的功能奠定了基础.

关键词： MORC2 突变体真核表达载体基因表达胃癌细胞

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