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解剖科学进展 2010年第4期16卷 302-306页

作者：张惠丹单连峰王晓楠任辉方瑾中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室卫生部细胞生物学重点实验室沈阳110001 中国医科大学基础医学院数学教研室沈阳110001 沈阳市肛肠医院大肠外科沈阳110002

目的建立一种定量检测大肠癌中K-ras基因突变比例的方法,并分析其与临床病理参数之间的关系。方法利用微流控温度梯度毛细管电泳(Chip-based temperature gradient electrophoresis,Chip-basedTGCE)对4例代表性大肠癌组织切片中的K-ras... 详细信息

目的建立一种定量检测大肠癌中K-ras基因突变比例的方法,并分析其与临床病理参数之间的关系。方法利用微流控温度梯度毛细管电泳(Chip-based temperature gradient electrophoresis,Chip-basedTGCE)对4例代表性大肠癌组织切片中的K-ras基因突变进行检测,通过AutoCAD软件计算出K-ras基因突变比例,结果经克隆测序校正后获得线性回归方程。应用该方法定量检测84例石蜡包埋大肠癌组织中的K-ras基因突变比例,并探讨其与临床病理参数的关系。结果 Chip-based TGCE检测K-ras基因突变比例与克隆测序检测K-ras突变比例的线性回归方程为y=0.993x-1.387,K-ras基因突变比例与肿瘤部位和浸润深度有显著相关性(P<0.05),检测获得的最低K-ras突变比例达到2.51%。结论该研究显示Chip-based TGCE是一种快速、灵敏、便捷、经济的基因突变比例定量分析方法。

关键词：微流控芯片温度梯度毛细管电泳点突变检测 K-ras基因定量

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EGF干预人羊膜间充质干细胞差异表达基因及基因功能富集分析

EGF干预人羊膜间充质干细胞差异表达基因及基因功能富集分析

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第八届全国创伤修复(愈合)与组织再生学术交流会

作者：施萍李彩虹张殿宝刘晓玉张涛庞希宁中国医科大学附属第一医院全科医学教研室辽宁沈阳110001 教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室中国医科大学干细胞与再生医学研究室辽宁沈阳110001

目的研究EGF干预人羊膜间充质干细胞前后的基因表达差异,在基因水平上探讨EGF作用的分子生物学机制.方法无菌条件下取孕期38～40周的人羊膜,胰酶胶原酶消化法分离人羊膜间充质干细胞,待细胞传至P1代后更换无血清培养液;取4-6代细胞提...

目的研究EGF干预人羊膜间充质干细胞前后的基因表达差异,在基因水平上探讨EGF作用的分子生物学机制.方法无菌条件下取孕期38～40周的人羊膜,胰酶胶原酶消化法分离人羊膜间充质干细胞,待细胞传至P1代后更换无血清培养液;取4-6代细胞提取总RNA,用高通量Illumina测序RNA-Seq表达谱分析技术,对体外培养的用EGF干预人羊膜间充质干细胞,对干预前后mRNA进行测序,筛选差异表达基因并进行数字基因表达谱分析、聚类分析、Gene Ontology功能显著性富集分析、Pathway显著性富集分析和蛋白互作网络分析;采用qRT-PCR检测对上述结果进行验证.结果与人类基因组数据库(Hg18)进行比对,比较人羊膜间充质干细胞和EGF干预人羊膜间充质干细胞差异表达,发现差异表达基因104个,其中上调已知基因56个;下调已知基因48个.RNA-Seq的KEGG pathways的显著性富集分析,细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路为差异表达基因中显著富集的pathways(q≤0.05).该通路共涉及9个差异表达基因,其中上调差异表达基因7个(BMP2,CXCL3,IL1B,IL8,TNFRSF9,CCL2,CCL7),下调差异表达基因2个(INHBE,IFNE).经qRT-PCR检测验证获得证实.结论 EGF干预人羊膜间充质干细胞前后存在多组基因表达差异.细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路在启动人在羊膜间充质干细胞增殖和迁移过程中起着调节作用,有望成为促进羊膜间充质干细胞增殖和迁移的靶通路,对其应用于促进创面愈合具有指导意义.

关键词：

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表皮松解性掌跖角化病一家系的致病基因突变分析

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解剖科学进展 2020年第5期26卷 492-495,499页

作者：葛海军刘旭陈晨王述森王谦曹丽华罗阳张学中国医科大学生命科学学院医学基因组学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110122 中国医科大学附属第一医院神经内科辽宁沈阳110001

目的对一个表皮松解性掌跖角化症(EPPK)家系进行基因突变检测,为该家系成员提供临床遗传咨询,并初步探讨该家系患者特殊表型指节垫、指关节弯曲与KRT9基因突变的相关性。方法收集该家系中的先证者、先证者的父亲及舅舅三人的外周血并提... 详细信息

目的对一个表皮松解性掌跖角化症(EPPK)家系进行基因突变检测,为该家系成员提供临床遗传咨询,并初步探讨该家系患者特殊表型指节垫、指关节弯曲与KRT9基因突变的相关性。方法收集该家系中的先证者、先证者的父亲及舅舅三人的外周血并提取基因组DNA。对以上三位家系成员进行全外显子组测序(WES),通过突变位点频率、突变类型、是否改变剪接或编码氨基酸进行筛选,并按照常染色体显性遗传方式筛选杂合突变,然后在家系内进行共分离分析,针对候选基因表达及已知功能分析,得到候选基因突变位点,并进行Sanger测序验证。应用生物信息学软件对KRT9基因结构域和功能域进行分析,针对161位氨基酸位点改变,进行文献综述和基因型-表型相关性探讨。结果本研究报道了一个中国EPPK家系,伴有罕见的指关节屈曲表型;WES测序检测到KRT9基因第1外显子存在杂合突变c.482A>G(p.N161S),该突变在家系内与疾病表型共分离,Sanger测序验证与WES结果一致。利用生物信息学软件预测到N161突变成S161后,角蛋白9的无规则卷曲发生空间位置改变,α螺旋结构有明显缺少,突变位点附近氢键数量增加,键长变长。对角蛋白9的161位点突变所致EPPK进行文献综述,发现N161S突变与指节垫表型高度相关。结论本研究报道了国际上第三例伴有罕见指关节屈曲表型的EPPK家系,初步认为KRT9基因c.482A>G(p.N161S)为该EPPK家系致病突变,对患者明确诊断及遗传咨询有重要意义。

关键词： EPPK KRT9基因突变指节垫

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限制性片段长度多态性结合微流控芯片电泳检测大肠癌K-ras基因点突变

限制性片段长度多态性结合微流控芯片电泳检测大肠癌K-ras基因点...

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中华医学会医学细胞生物学分会第三届全国学术会议

作者：张惠丹宋瑾任辉徐章润王晓楠方瑾中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室医学细胞生物学教育部重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室沈阳 110001 沈阳市肛肠医院大肠外科沈阳 110002 东北大学分析科学研究中心沈阳 110004

目的 K-ras基因点突变发生于早期腺瘤向中期腺瘤的转变阶段,可能是大肠癌恶变的始动基因.微流控芯片技术是近年迅速发展起来的新的微型分析系统,具有微型化、自动化、集成化及便携化的特点.本研究以K-ras基因点突变作为检测对象,将限制... 详细信息

目的 K-ras基因点突变发生于早期腺瘤向中期腺瘤的转变阶段,可能是大肠癌恶变的始动基因.微流控芯片技术是近年迅速发展起来的新的微型分析系统,具有微型化、自动化、集成化及便携化的特点.本研究以K-ras基因点突变作为检测对象,将限制性片段长度多态性(RFLP)与微流控芯片相结合,建立将样品进样、分离、检测和记录等步骤连续自动处理的基因突变检测平台.方法 PCR扩增含有K-ras基因第一外显子的第12位密码子的片段,并进行Mva Ⅰ酶切,酶切产物以微流控电泳系统进行检测.采用光刻及高温封接技术制作通道为十字交叉形的玻璃微流控芯片,结合激光诱导荧光检测系统,建立微流控毛细管电泳技术平台.采用该平台对6种已知突变类型的大肠癌细胞系及98例大肠癌石蜡包埋组织中的K-ras基因突变进行检测.同时将大肠癌K-ras基因野生型细胞株HT29和纯合突变细胞株SW480以不同比例混合,研究系统的检测灵敏度.结果 RFLP结合微流控芯片电泳平台可在5 min内实现对K-ras基因的高效检测,6种大肠癌细胞系中K-ras基因的纯合突变、杂合突变及野生型均被准确检出.对不同比例野生型/纯合突变型混合细胞的检测显示系统的检测灵敏度可达1/10 000.该系统对98例石蜡包埋组织标本中K-ras的突变检出率为28.6％(28/98),显著高于测序的检出率13.3％(13/98).结论本研究建立的RFLP结合微流控芯片电泳平台能够对K-ras基因突变进行高效检测,具有灵敏度高、特异性强、快速和低成本等优势,为快速进行肿瘤基因突变筛查及早期诊断提供了新的技术平台.

关键词：微流控芯片限制性片段长度多态性大肠癌 K-ras基因点突变

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花样结构白蛋白缓释载体的制备及在豚鼠内耳跨膜给药的应用

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解剖科学进展 2013年第6期19卷 520-524页

作者：于湛于敏周志敏张之宝杜博张哲熊青青中国人民解放军第二炮兵总医院耳鼻喉科北京100088 中国医科大学卫生部细胞生物学重点实验室医学细胞生物学教育部重点实验室细胞生物学教研室沈阳110001 中国医学科学院生物医学工程研究所天津300192

目的制备花样结构白蛋白（flower—shaped bovine serum albumin，FBSA）微纳材料作为载体进行内耳跨圆窗膜给药研究，为临床寻找新的药物缓释载体奠定基础。方法应用改良的去溶剂法制备FBSA微纳材料，并用荧光显微镜、电子显微镜、粒... 详细信息

目的制备花样结构白蛋白（flower—shaped bovine serum albumin，FBSA）微纳材料作为载体进行内耳跨圆窗膜给药研究，为临床寻找新的药物缓释载体奠定基础。方法应用改良的去溶剂法制备FBSA微纳材料，并用荧光显微镜、电子显微镜、粒径分析仪等对其进行系统的表征。通过体外药物释放实验、MTF法来评估其细胞相容性和细胞毒性。通过小动物活体成像观察FBSA在豚鼠听泡内的扩散及在圆窗膜上的附着。结果蛋白基微纳米材料为放射状花样结构，大小约为50～80μm。空白FBSA微纳材料的zeta电位是-16．2mV，其最高的载药量和包封率分别是21．4％和40．0％，具有缓释效果。通过L929细胞的毒性实验测试提示经热变性处理固定后的材料具有更低的毒性和更好的细胞相容性。小动物活体实验可见药物在内耳中扩散及在圆窗膜表面附着。结论成功构建FBSA微纳材料载体，在治疗内耳病的局部给药方面有着良好的应用前景。

关键词：牛血清白蛋白微纳材料缓释载体圆窗膜内耳豚鼠

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REST/NRSF基因shRNA慢病毒载体的构建与鉴定

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中国组织工程研究与临床康复 2011年第32期15卷 6036-6040页

作者：李宏图施萍庞希宁中国医科大学细胞生物学卫生部重点实验室干细胞与再生医学研究室辽宁省沈阳市110001 辽宁省计划生育科学研究院辽宁省生殖医学重点实验室辽宁省沈阳市110031 中国医科大学附属第一医院全科医学教研室辽宁省沈阳市110001

背景:神经元限制性沉默因子(REST/NRSF)能负向调控神经元及胰岛细胞分化相关基因的表达。目的:构建并筛选能高效沉默大鼠REST/NRSF基因的shRNA慢病毒载体。方法:针对REST/NRSF基因设计4组特异性siRNA靶点,合成靶序列的寡核苷酸序列,退... 详细信息

背景:神经元限制性沉默因子(REST/NRSF)能负向调控神经元及胰岛细胞分化相关基因的表达。目的:构建并筛选能高效沉默大鼠REST/NRSF基因的shRNA慢病毒载体。方法:针对REST/NRSF基因设计4组特异性siRNA靶点,合成靶序列的寡核苷酸序列,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ双酶切后的pFU-GW-RNAi载体连接产生L-shREST/NRSF慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。包装产生慢病毒颗粒,随后将其感染大鼠骨髓间充质干细胞,采用Real-timePCR方法检测靶基因在mRNA水平的沉默效率。结果与结论:PCR和测序证实,构建出了REST/NRSFshRNA的慢病毒载体L-shREST/NRSF,并能稳定转染大鼠间充质干细胞,感染效率达100%。4组shRNA序列均有基因沉默效果,并以第3组shRN序列效果最为明显。结果表明,该慢病毒表达载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。

关键词：慢病毒载体 REST/NRSF shRNA 基因骨髓间充质干细胞

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序贯培养法诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的研究

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解剖科学进展 2009年第4期15卷 370-375页

作者：顾文佳李宏图刘晓玉庞希宁中国医科大学发育生物学教研室卫生部细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110001 辽宁省计划生育科学研究院辽宁省生殖医学重点实验室辽宁沈阳110031

目的诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化。方法通过"序贯培养法"诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经细胞,并应用RT-PCR、免疫荧光、端粒酶活性及基因芯片等对诱导结果进行检测。结果分化细胞表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)、低分子... 详细信息

目的诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化。方法通过"序贯培养法"诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经细胞,并应用RT-PCR、免疫荧光、端粒酶活性及基因芯片等对诱导结果进行检测。结果分化细胞表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)、低分子量神经微丝蛋白(NF-L)、神经细胞粘附分子1(NCAM1)、微管相关蛋白Tau等多种神经元标志物,免疫荧光显示NSE阳性率为(81±9.2)%,而神经胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)几乎不表达。基因芯片分析结果显示,在3张芯片中有8179个基因共表达,另有998个基因的表达完全不同,且有多种神经元基因的标志物表达明显升高。结论通过"序贯培养法"能有效地诱导小鼠胚胎干细胞向神经元分化。

关键词：胚胎干细胞神经细胞序贯培养法诱导分化小鼠

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TNF-α、NF-κB诱导糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡及雷帕霉素干预影响(英文)

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心血管康复医学杂志 2012年第2期21卷 117-122,F0002页

作者：徐锦春陈思娇熊盈陈婕宋今丹中国医科大学附属第一医院老年病教研室辽宁沈阳110001 中国医科大学医学分子生物学研究所卫生部细胞生物学重点实验室

目的:探讨糖尿病大鼠肾组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)、核转录因子-κB(NF-κB)对肾组织细胞凋亡的诱导以及雷帕霉素干预的作用。方法:选择2型糖尿病大鼠(GK大鼠)20只,均分为糖尿病模型组(DM组),雷帕霉素治疗组(DMR组,建立糖尿病模型后给... 详细信息

目的:探讨糖尿病大鼠肾组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)、核转录因子-κB(NF-κB)对肾组织细胞凋亡的诱导以及雷帕霉素干预的作用。方法:选择2型糖尿病大鼠(GK大鼠)20只,均分为糖尿病模型组(DM组),雷帕霉素治疗组(DMR组,建立糖尿病模型后给予雷帕霉素治疗);另选择10只Wistar雄性大鼠作为正常对照组。分别在4周、8周后检测各组肾组织细胞凋亡情况,NF-κB,TNF-α的表达水平以及血脂、血糖水平。结果:模型制作后4周、8周,与正常对照组和DMR组比较,DM组大鼠肾组织细胞凋亡数[RCA,4周(0.217±0.031)、(0.272±0.031)比(0.545±0.031)、8周(0.358±0.031)、(0.350±0.031)比(0.811±0.031)]均明显增多,NF-κBp65[OD:4周(0.160±0.027)、(0.131±0.027)比(0.411±0.027)、8周(0.232±0.027)、(0.275±0.027)比(0.634±0.027)]、TNF-α[OD:4周(0.242±0.027)、(0.275±0.027)比(0.617±0.027)、8周(0.385±0.027)、(0.342±0.027)比(0.912±0.027)]表达均明显升高(P均<0.01)。相关分析显示,肾组织NF-κBp65与TNF-α,RCA与TNF-α,NF-κBp65均呈正相关关系(r=0.956,0.953,0.886,P均<0.01)。结论:糖尿病病大鼠的肾细胞凋亡显著增加,雷帕霉素干预组肾细胞凋亡显著减少,NF-κB、TNF-α表达显著增加,其保护作用可能是NF-κB、TNF-α阻滞细胞的凋亡。

关键词：糖尿病,2型细胞凋亡西罗莫司大鼠

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HDAC2在肝细胞肝癌中对MMP9表达的影响

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现代肿瘤医学 2019年第3期27卷 390-393页

作者：尹中波王春玉赵越南通市第六人民医院病理科江苏南通226011 中国医科大学基础医学院染色质生物学研究室.教育部医学细胞生物学重点实验室.卫生部细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110001

目的:明确组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)在肝细胞肝癌(HCC)中对基质金属蛋白酶9(MMP9)表达的影响。方法:利用mRNA表达谱芯片数据进行统计分析,确定HDAC2和MMP9的mRNA在HCC组织中的表达情况及相关性;实时定量PCR检测HDAC2过表达对MMP9转录的... 详细信息

目的:明确组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)在肝细胞肝癌(HCC)中对基质金属蛋白酶9(MMP9)表达的影响。方法:利用mRNA表达谱芯片数据进行统计分析,确定HDAC2和MMP9的mRNA在HCC组织中的表达情况及相关性;实时定量PCR检测HDAC2过表达对MMP9转录的影响;蛋白免疫印迹检测HDAC2过表达对MMP9蛋白表达的影响。结果:HDAC2和MMP9的mRNA在HCC肿瘤组织中均表达升高并呈正相关性;在Hep G2细胞中,HDAC2促进MMP9的转录及蛋白表达。结论:HDAC2在HCC中促进MMP9的表达,可能在HCC转移过程中发挥作用。

关键词：组蛋白去乙酰化酶2 基质金属蛋白酶9 肝细胞肝癌肿瘤转移

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应用抗大肠癌单克隆抗体对大肠癌相关抗原的形态学研究

应用抗大肠癌单克隆抗体对大肠癌相关抗原的形态学研究

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中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会

作者：冯慧曾艳伊德林刘芙蓉宋今丹沈阳医学院生物化学教研室沈阳医学院生物化学教研室沈阳医学院生物化学教研室中国医科大学细胞生物学卫生部重点实验室中国医科大学细胞生物学卫生部重点实验室

LEA(Large External Antigen)是一种新的有较高敏感性和特异性的大肠癌相关抗原。这种抗原的表达与大肠癌的发生密切相关。LEA的理化性质比较独特,不同于已报道的其它大肠癌相关抗原。间接免疫荧光染色表明,LEA对大肠癌有较高的特异性,... 详细信息

LEA(Large External Antigen)是一种新的有较高敏感性和特异性的大肠癌相关抗原。这种抗原的表达与大肠癌的发生密切相关。LEA的理化性质比较独特,不同于已报道的其它大肠癌相关抗原。间接免疫荧光染色表明,LEA对大肠癌有较高的特异性,LEA与CEA在大肠癌细胞系表面的分布不同。间接免疫双标记实验证明,ND-1单抗不能被125I标记的CEA免疫沉淀;在斑点杂交实验中, 提纯的CEA不能被ND-1单抗识别,这个结果显示,LEA与CEA的抗原性不同。本文采用免疫细胞化学染色和包埋前胶体金染色的免疫电镜技术,对LEA在细胞、亚细胞和超微结构水平的分布及定位特点进行研究。

关键词：癌相关抗原免疫电镜胶体金大肠癌细胞系形态学研究

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