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生物化学与生物物理进展 2025年

作者：程雅洁周雪彤王瑞方瑾中国医科大学生命科学学院医学细胞生物学教育部重点实验室暨卫生部细胞生物学重点实验室细胞生物学教研室青岛大学附属妇女儿童医院病理科中国医科大学基础医学院干细胞与再生医学教研室

目的探讨大肠癌LoVo细胞来源的外泌体（LoVo-Exos）对肿瘤血管生成的影响，并探讨其促血管生成的可能分子机制。方法超速离心法提取LoVo-Exos，共聚焦显微镜观察其内化进入受体HUVEC细胞，体外管状形成实验分析LoVo-Exos对血管生成的... 详细信息

目的探讨大肠癌LoVo细胞来源的外泌体（LoVo-Exos）对肿瘤血管生成的影响，并探讨其促血管生成的可能分子机制。方法超速离心法提取LoVo-Exos，共聚焦显微镜观察其内化进入受体HUVEC细胞，体外管状形成实验分析LoVo-Exos对血管生成的影响；采用小鼠体内基质胶塞实验，体内分析LoVo-Exos对血管生成的影响。为探讨LoVo-Exos促血管生成的分子机制，Western blot分析LoVo-Exos携带活化型表皮生长因子受体（phosphorylated epidermal growth factor receptor，pEGFR）进入受体细胞。Western blot及ELISA方法分析EGFR-ERK通路关键信号蛋白及下游血管生成核心分子表达情况，并观察敲减EGFR及细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulatory protein kinase，ERK）抑制剂处理对血管生成的影响。结果共聚焦显微镜观察到LoVo-Exos内化进入HUVEC内皮细胞；体外血管生成实验显示，LoVo-Exos能够显著促进HUVEC细胞管状结构的形成。小鼠皮下基质胶塞实验显示LoVo-Exos能够促进血管样结构的形成。进一步研究发现LoVo-Exos递送pEGFR到HUVEC中，激活EGFR-ERK通路，促进血管生成。分析LoVo-Exos对下游血管生成核心分子表达的影响，发现LoVo-Exos能够促进HUVEC细胞白介素-8（interleukin-8，IL-8）的分泌，敲减EGFR的LoVo-Exos该促进作用降低，且该促进作用能够被MEK1/2抑制剂U0126抑制。结论 LoVo-Exos能够在体内外促进血管生成，其可能机制为LoVo-Exos递送pEGFR到HUVEC中，通过EGFR-ERK途径上调IL-8分泌水平，从而促进HUVEC血管生成能力，为癌症的转移提供新机制。

关键词：外泌体血管生成表皮生长因子受体大肠癌

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Ser176/180磷酸化位点突变的IKKα真核表达载体的构建及鉴定

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细胞与分子免疫学杂志 2015年第9期31卷 1162-1166页

作者：何岩郑倩倩朱亚勤教育部医学细胞生物学重点实验室细胞病理生物学研究室中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室辽宁沈阳110001

目的构建Ser176/180磷酸化位点突变的核因子κB抑制剂激酶α(IKKα)真核表达载体。方法通过PCR获得带有IKKαSer176/180突变位点和无义突变KpnⅠ位点的片段,以及带有无义突变KpnⅠ位点的片段,两片段分别经过HindⅢ/KpnⅠ以及KpnⅠ/EcoR... 详细信息

目的构建Ser176/180磷酸化位点突变的核因子κB抑制剂激酶α(IKKα)真核表达载体。方法通过PCR获得带有IKKαSer176/180突变位点和无义突变KpnⅠ位点的片段,以及带有无义突变KpnⅠ位点的片段,两片段分别经过HindⅢ/KpnⅠ以及KpnⅠ/EcoRⅠ双酶切,载体pEGFP经HindⅢ/EcoRⅠ双酶切后连接。共聚焦显微镜技术观察激活型/死型p EGFPIKKαKA/KD融合蛋白在真核细胞中的定位及其对P65核质易位的影响。Western blot法检测重组蛋白表达。结果测序显示载体构建成功。pEGFP-IKKαKA分布在细胞核和细胞质,并能使P65发生核穿梭。pEGFP-IKKαKD主要分布在细胞质,不能使P65发生核质易位。Western blot结果显示出融合蛋白的特异性条带。结论成功构建IKKα磷酸化位点激活型及死型的真核表达载体,在真核细胞中可有效表达。pEGFP-IKKαKA/KD在真核细胞中蛋白表达呈现不同定位,对下游P65的核质穿梭调控发挥不同效应。

关键词：核因子κB抑制剂激酶α 激酶突变型真核表达载体

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hβ-arrestin1重组蛋白不同亚型筛选及互作鉴定

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中国医科大学学报 2012年第1期41卷 24-27页

作者：刘彩红王利利冯艳玲朱亚勤中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室细胞病理生物学研究室沈阳110001

目的构建GST/β-arrestin1融合蛋白表达载体,筛选其不同亚型重组子,并诱导表达、纯化蛋白,初步进行蛋白亚型互作比较,为进一步功能研究提供实验基础。方法提取人源细胞的mRNA,反转录为cDNA。用PCR法扩增hβ-arrestin1全长编码基因,通过S... 详细信息

目的构建GST/β-arrestin1融合蛋白表达载体,筛选其不同亚型重组子,并诱导表达、纯化蛋白,初步进行蛋白亚型互作比较,为进一步功能研究提供实验基础。方法提取人源细胞的mRNA,反转录为cDNA。用PCR法扩增hβ-arrestin1全长编码基因,通过SalI和NotI酶切位点将hβ-arrestin1全长定向插入pGEX-5X-1中,构建原核表达载体pGEX-5X-1-β-arrestin1,并通过BglⅡ单酶切筛选A、B亚型,然后将重组质粒转入*** BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,用谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化表达的GST/β-arrestin1A、B,SDS-PAGE鉴定,互作实验比较亚型的结合能力。结果酶切及测序结果证明,成功构建了β-arrestin1A、B原核表达载体,并通过SDS-PAGE证实:经IPTG诱导表达及亲和纯化,从转化重组质粒的BL21菌株中获得了融合蛋白GST/β-arrestin1A、B亚型,通过GST Pulldown初步比较了重组β-arrestin1A、B蛋白亚型的结合能力。结论成功构建pGEX-5X-1-β-arrestin1A、B原核表达载体并确定了融合蛋白的诱导表达及纯化方法,且互作实验显示β-arrestin1A有较强的结合能力,为进一步研究β-arrestin1的生物学功能奠定了基础。

关键词： hβ—arrestin1 克隆重组亚型表达蛋白互作

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高GC hTwist融合蛋白载体构建及其表达条件优化

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中国医科大学学报 2012年第3期41卷 204-207页

作者：王利利刘彩红朱亚勤教育部医学细胞生物学重点实验室细胞病理生物学研究室中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室沈阳110001

目的构建高GC基因Twist融合蛋白表达载体;高效表达并纯化GST/TWIST融合蛋白,为GST-Pulldown等实验做准备。从而进一步研究其生物学功能。方法以胃癌细胞系SGM7901 cDNA为模板,依据高GC含量基因Twist分子结构特点和高GC含量基因引物设计... 详细信息

目的构建高GC基因Twist融合蛋白表达载体;高效表达并纯化GST/TWIST融合蛋白,为GST-Pulldown等实验做准备。从而进一步研究其生物学功能。方法以胃癌细胞系SGM7901 cDNA为模板,依据高GC含量基因Twist分子结构特点和高GC含量基因引物设计策略,合成PCR引物。本实验通过分析各种DNA聚合酶不同扩增效率及特异性,选择适合高GC基因扩增的DNA聚合酶,优化反应体系的离子强度,并且结合改良降落PCR等综合策略的实施,比较不同策略下高GC含量基因Twist PCR产物的特异性及效率,尝试高效扩增特异的高GC含量Twist全长编码基因,通过Bam HI和Xho I双酶切位点将Twist全长定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist,并转化*** DH5α,筛选富含GC的Twist阳性重组子,限制性内切酶酶切鉴定和DNA序列测序正确后,转化*** BL21中,异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果通过Platinum pfx DNA聚合酶配合PCRx加强缓冲液的使用及改良降落PCR策略的实施,独立可重复实验证实:我们获得了高效特异的高GC Twist全长编码基因,成功构建原核表达质粒pGEX-5X-1-Twist。诱导表达的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定,检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化,得到高纯度的融合蛋白。结论上述策略的实施可以成功完成高GC Twist原核表达载体的构建,并确定GST/TWIST融合蛋白表达的最适条件,获得了高纯度融合蛋白,为进一步研究TWIST蛋白的生物学功能奠定基础。

关键词：高GC hTwist 克隆融合蛋白原核表达

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人源MAP3K7克隆及其GST融合蛋白的表达和鉴定

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中国医科大学学报 2011年第8期40卷 688-690页

作者：冯艳玲刘彩红朱亚勤中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室卫生部细胞生物学重点实验室细胞病理生物学研究室沈阳110001

目的构建MAP3K7蛋白GST的融合表达载体,高效表达和纯化GST-MAP3K7融合蛋白,为GST Pulldown实验做准备。方法通过PCR扩增MAP3K7全长编码基因,经双酶切定向克隆至表达载体pGEX-5X-1,构建原核重组表达载体pGEX-5X-1-MAP3K7,通过酶切和测序... 详细信息

目的构建MAP3K7蛋白GST的融合表达载体,高效表达和纯化GST-MAP3K7融合蛋白,为GST Pulldown实验做准备。方法通过PCR扩增MAP3K7全长编码基因,经双酶切定向克隆至表达载体pGEX-5X-1,构建原核重组表达载体pGEX-5X-1-MAP3K7,通过酶切和测序鉴定后,导入*** BL21宿主菌中,IPTG诱导表达融合蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖凝胶纯化表达产物,SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。结果经测序鉴定成功构建了原核重组表达载体pGEX-5X-1-MAP3K7,诱导后的GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot检测到分子量正确的特异性蛋白条带,经纯化后,得到了高纯度的融合蛋白。结论成功构建了MAP3K7全长的GST重组表达载体,确定了GST-MAP3K7融合蛋白表达的最佳条件,诱导成功并得到了高纯度的融合蛋白,为进一步研究MAP3K7蛋白的生物学功能奠定了基础。

关键词：人MAP3K7基因基因克隆融合蛋白原核表达

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Mu2蛋白亚细胞结构定位及其相互作用蛋白的筛选

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吉林大学学报（医学版） 2016年第6期42卷 1054-1058,I0011页

作者：霍云龙王春玉赵越中国医科大学盛京医院病理科辽宁沈阳110003 中国医科大学基础医学院染色质生物学研究室教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110122

目的:采用果蝇S2细胞表达FLAG-Mu2蛋白,观察其亚细胞结构定位并纯化鉴定FLAG-Mu2质粒蛋白复合物,为Mu2蛋白的研究提供依据。方法:FLAG-Mu2转染果蝇S2细胞后表达FLAG-Mu2融合蛋白,共聚焦激光扫描显微镜下观察FLAG-Mu2蛋白的亚细胞定位,... 详细信息

目的:采用果蝇S2细胞表达FLAG-Mu2蛋白,观察其亚细胞结构定位并纯化鉴定FLAG-Mu2质粒蛋白复合物,为Mu2蛋白的研究提供依据。方法:FLAG-Mu2转染果蝇S2细胞后表达FLAG-Mu2融合蛋白,共聚焦激光扫描显微镜下观察FLAG-Mu2蛋白的亚细胞定位,并通过核浆分离蛋白提取实验观察细胞核提取物中FLAG-Mu2蛋白的表达情况;采用免疫沉淀技术沉淀FLAG-Mu2复合物,并对其进行纯化及质谱测序以确定蛋白复合物的组分。结果:共聚焦激光显微镜下观察,FLAG-Mu2蛋白主要表达于细胞核中。核浆分离蛋白提取检测,融合蛋白相对分子质量约为140 000,主要存在于细胞核提取物中。纯化FLAG-Mu2蛋白复合物并进行蛋白质质谱分析,FLAG-Mu2复合物中可能含有pif1A、CG31782、mip120、CG31690和G protein-sa60A。结论:FLAG-Mu2蛋白在果蝇S2细胞中主要定位于细胞核,FLAG-Mu2蛋白复合物中有5种可能的蛋白组分。

关键词： Mu2蛋白融合蛋白亚细胞结构定位相互作用蛋白筛选

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肝癌HepG2和Hep3B细胞系SNF5表达及定位

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中华肿瘤防治杂志 2018年第14期25卷 985-989页

作者：尹中波霍云龙王春玉赵越江苏省南通市第六人民医院病理科江苏南通226011 中国医科大学盛京医院病理科辽宁沈阳110011 中国医科大学基础医学院染色质生物学研究室.教育部医学细胞生物学重点实验室.卫生部细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110001

目的染色质重塑因子SNF5在肝细胞肝癌中的生物学功能仍有待深入研究,本研究检测SNF5在HepG2和Hep3B肝癌细胞系中的表达及亚细胞定位,并构建Flag-SNF5真核表达质粒。方法提取HepG2和Hep3B两种肝癌细胞系的总蛋白,蛋白质印迹法检测SNF5内... 详细信息

目的染色质重塑因子SNF5在肝细胞肝癌中的生物学功能仍有待深入研究,本研究检测SNF5在HepG2和Hep3B肝癌细胞系中的表达及亚细胞定位,并构建Flag-SNF5真核表达质粒。方法提取HepG2和Hep3B两种肝癌细胞系的总蛋白,蛋白质印迹法检测SNF5内源性表达;应用共聚焦激光扫描显微镜观察Hep3B细胞SNF5蛋白定位;提取HepG2总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增SNF5全长编码序列,亚克隆至含有Flag标签的真核表达载体中;将构建的重组质粒测序并转染到Hep3B细胞中,提取细胞蛋白进行蛋白质印迹检测,验证其表达情况;使用免疫沉淀的方法纯化Flag-SNF5融合蛋白。结果在HepG2及Hep3B两种肝癌细胞系中,均检测到了SNF5蛋白的内源性表达。在Hep3B细胞中,SNF5主要定位于细胞核。将SNF5蛋白全长编码区成功克隆到pcDNA3-Flag载体中。重组质粒转染入Hep3B细胞后,检测到融合蛋白Flag-SNF5的表达,相对分子质量约为39×103,并对Flag-SNF5融合蛋白进行了纯化。结论 SNF5蛋白在HepG2及Hep3B两种肝癌细胞系中均有表达,且在Hep3B细胞中主要定位于细胞核。成功地构建了Flag-SNF5的真核表达质粒,验证了重组质粒的表达,并纯化了该融合蛋白。

关键词：肝细胞癌重组质粒蛋白质印迹法 SNF5

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p65蛋白的诱导表达及电子显微镜观察其显微结构

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现代生物医学进展 2012年第34期12卷 6624-6627页

作者：郭文东郑倩倩朱亚勤中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室细胞病理生物学研究室辽宁沈阳110001

目的:构建重组原核表达载体pGEX-5x-1-p65,诱导GST-p65融合蛋白的表达并观察其包涵体的显微结构。方法:应用PCR技术扩增得到p65全长序列,并亚克隆至带有GST标签的pGEX-5x-1载体中。经酶切、测序鉴定后,在原核细胞中诱导表达GST-p65融合... 详细信息

目的:构建重组原核表达载体pGEX-5x-1-p65,诱导GST-p65融合蛋白的表达并观察其包涵体的显微结构。方法:应用PCR技术扩增得到p65全长序列,并亚克隆至带有GST标签的pGEX-5x-1载体中。经酶切、测序鉴定后,在原核细胞中诱导表达GST-p65融合蛋白并将诱导后的菌体制作透射电镜标本,观察菌体内部显微结构。结果:成功构建表达载体pGEX-5x-1-p65,原核细胞中诱导表达、凝胶电泳后未见可溶性融合蛋白的高效表达。透射电镜观察到在承载有重组载体的菌体内部出现大量高电子密度的包涵体。结论:成功构建了原核表达载体pGEX-5x-1-p65,电子显微镜观察并证实在原核细胞内p65蛋白诱导表达形成包涵体。

关键词： p65 透射电镜包涵体

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GST-LMO1融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

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中国医科大学学报 2011年第11期40卷 961-963,978页

作者：顾卉佟宇鑫刘彤李慧李丹妮袁正伟中国医科大学附属盛京医院实验研究中心沈阳110001 中国医科大学基础医学院细胞生物教研室细胞生物学教育部、卫生部重点实验室沈阳110001 中国医科大学第94期临床医学系沈阳110001

目的构建GST-LMO1融合蛋白表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌(***)中诱导表达。方法以人胎脑文库为模板,用PCR方法法扩增出LMO1基因全长及各个截短突变体,通过BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点分别将其定向插入pGEX-5X-2载体中,构建原核表达质粒pG... 详细信息

目的构建GST-LMO1融合蛋白表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌(***)中诱导表达。方法以人胎脑文库为模板,用PCR方法法扩增出LMO1基因全长及各个截短突变体,通过BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点分别将其定向插入pGEX-5X-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-2-LMO1及其截短突变体,通过酶切电泳鉴定和DNA序列测定正确后,转入*** BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果酶切电泳及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-5X-2-LMO1及其截短突变体,并用Western blot方法证实了GST-LMO1全长及各个截短突变体融合蛋白的表达。结论成功构建了LMO1全长及其截短突变体原核表达载体,并证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为LMO1结构与功能的研究提供了前提基础。

关键词： LMO1 截短突变体质粒原核表达

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人IKKγ基因重组载体的构建及在原核体内的表达纯化

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解剖科学进展 2013年第1期19卷 71-74页

作者：郭文东朱亚勤中国医科大学基础医学院细胞生物学教育部重点实验室细胞病理生物学研究室辽宁沈阳110001

目的构建重组原核表达载体pGEX-5X-1-IKKγ,诱导GST-IKKγ融合蛋白的表达并以GST-pulldown方法得到纯化的融合蛋白。方法应用PCR技术,以M6P8载体为模板扩增得到IKKγ全长序列,并亚克隆至带有GST标签的pGEX-5X-1载体中。经酶切、测序鉴定... 详细信息

目的构建重组原核表达载体pGEX-5X-1-IKKγ,诱导GST-IKKγ融合蛋白的表达并以GST-pulldown方法得到纯化的融合蛋白。方法应用PCR技术,以M6P8载体为模板扩增得到IKKγ全长序列,并亚克隆至带有GST标签的pGEX-5X-1载体中。经酶切、测序鉴定后,重组载体转化至原核细胞中并进行诱导表达,以SDS-PAGE凝胶电泳染色鉴定融合蛋白的表达。融合蛋白经GSTbeads沉降后,Western blot分析、鉴定融合蛋白的表达及纯化情况。结果将人IKKγ亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-1,酶切、测序鉴定无误。经诱导得到高表达的融合蛋白,经SDS-PAGE电泳染色后可见高表达条带。Westernblot鉴定经GSTbeads沉降后的蛋白,在74kD鉴定出融合蛋白的特异性条带。结论成功构建了原核表达载体pGEX-5X-1-,并在原核细胞内表达,融合蛋白可以经GSTbeads沉降用于GST-pulldown实验。

关键词： IKKγ基因载体构建诱导表达

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