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解剖科学进展 2012年第6期18卷 530-533页

作者：刘杏王述森刘琦高锦兰罗阳中国医科大学医学基因组学教研室卫生部细胞生物学重点实验室暨教育部医学细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110001

目的研究人生长分化因子5基因(GDF5)c.1118T>G(p.L373R)突变对GDF5蛋白在HEK-293细胞系表达及其亚细胞定位的影响。方法构建pDsRed1-N1-GDF5-WT和pDsRed1-N1-GDF5-L373R载体,分别转染HEK-293细胞,细胞培养72h后通过荧光显微镜观察比较野生型和突变型GDF5蛋白荧光分布情况。结果 GDF5蛋白在HEK-293细胞中成功表达,在荧光显微镜下观察到转染野生型和突变型GDF5的细胞胞浆均匀发出红色荧光,而空载体组的红色荧光则弥散于全细胞,荧光强度均匀一致。结论野生型和突变型GDF5蛋白均定位于HEK-293细胞质。

关键词：生长分化因子5 基因突变蛋白表达 HEK-293细胞系

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结节性硬化症一家系致病基因新突变鉴定

结节性硬化症一家系致病基因新突变鉴定

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第十二次全国医学遗传学学术会议

作者：陈晨曹丽华王琼王述森罗阳中国医科大学医学基因组学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室

目的结节性硬化症（tuberous sclerosis complex,TSC）是一种累及多系统的常染色体显性遗传病,以全身多种组织器官出现错构瘤样增生为主要特征。其致病基因为TSC1和TSC2基因,分别编码错构瘤蛋白（hamartin）和马铃薯球蛋白（tuberin）... 详细信息

目的结节性硬化症（tuberous sclerosis complex,TSC）是一种累及多系统的常染色体显性遗传病,以全身多种组织器官出现错构瘤样增生为主要特征。其致病基因为TSC1和TSC2基因,分别编码错构瘤蛋白（hamartin）和马铃薯球蛋白（tuberin）。本研究旨在对一中国汉族结节性硬化症家系进行基因突变分析,以明确临床诊断并指导遗传咨询。方法设计PCR引物,扩增覆盖TSC1和TSC2外显子及外显子-内含子交界区并直接测序分析,根据突变氨基酸的保守性及其在蛋白质空间结构中所处位置,推测突变致病的可能机制。结果对先证者TSC2基因测序未发现致病突变。TSC1基因测序分析发现第15外显子的两个杂合致病突变,分别是c.1556C>T（***519Ile）和c.1887890delAAAG（***630Glnfs*24）。由于未获得先证者双亲外周血样本,为鉴定以上两个突变是否均继承自先证者的受累父亲,将先证者的TSC1第15外显子PCR产物片段纯化后克隆至pMD18-T载体,挑取阳性克隆进行测序分析。克隆测序结果显示,先证者的两个突变均来自于同一个等位基因。以上两个突变均不处于hamatin的跨膜结构域和螺旋卷曲结构域,但是突变所在的第15外显子位于TSC1与粘着斑激酶家族作用蛋白（focal adhesion kinase[FAK]family interacting protein of200 kD,FIP200）的结合区域,因此推测以上两个突变可能通过FIP200影响细胞的增殖而致病;另外,c.1887 1890delAAAG突变形成了提前的终止密码,推测可能形成截短的TSC1mRNA分子,进而通过无义介导的mRNA降解机制不能正常的表达蛋白而行使功能。结论初步判定TSC1基因c.1556C>T（***519Ile）和c.1887890delAAAG（***630Glnfs*24）为该结节性硬化症家系致病突变,且该突变为国际上首次报道。

关键词：结节性硬化症 TSC1基因突变分析

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GDF5-L373R突变导致SYM1的致病机制研究

GDF5-L373R突变导致SYM1的致病机制研究

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第十二次全国医学遗传学学术会议

作者：刘杏张欣馨曲胜强刘琦罗阳中国医科大学医学基因组学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室

目的近端指/趾骨间关节粘连(proximal symphalangism,SYMl,OMIM:185800)为常染色体显性遗传病,表现为近端指/趾骨间关节强直、粘连,包括腕骨与跗骨的融合,近节指骨关节不能曲伸或曲伸受限,还可伴有耳聋、中耳鼓膜异常,视力发育异常等症... 详细信息

目的近端指/趾骨间关节粘连(proximal symphalangism,SYMl,OMIM:185800)为常染色体显性遗传病,表现为近端指/趾骨间关节强直、粘连,包括腕骨与跗骨的融合,近节指骨关节不能曲伸或曲伸受限,还可伴有耳聋、中耳鼓膜异常,视力发育异常等症状。生长分化因子5(Growth differentiation factor 5,GDF5)又称软骨形态发生蛋白-1(cartilage-derived morphogenetic protein-1,CDMP-1)或骨形态发生蛋白14(bonemorphogenetic protein 14,BMP14),是转化生长因子β(transforming growth factor-beta,TGF-β)超家族的一员,作为机体软骨形成、骨骼发育的重要调节因子之一,近年来受到了广泛的研究与关注。本课题组在对一中国汉族SYM1家系的筛查中首次发现其致病突变GDF5c.1118T>G(p.L373R),该突变位于GDF5前体蛋白结构域,转化酶作用位点附近,并在不同种属之间具有很高的保守性。本研究旨在明确GDF5-L373R突变导致SYM1表型的致病机制。方法构建多种真核表达载体,转染细胞后,研究野生型和突变型GDF5前体蛋白水解效率、成熟蛋白分泌表达量以及软骨和骨相关信号分子的改变。结果GDF5-L373R突变后检测到前体蛋白和成熟蛋白的表达减少以及前体蛋白的水解效率也发生了改变,推测突变后水解分泌到细胞外的成熟GDF5也会发生改变。另一方面,免疫共沉淀结果提示GDF5-L373R与BMPRIB结合能力下调,经生物信息学预测突变的第373位氨基酸位于β折叠转角处,结果提示L373R突变虽然位于GDF5前结构域中,但是对于GDF5成熟蛋白的空间构象仍然发挥着重要的作用,由于GDF5-L373R蛋白空间结构的变化而导致其与受体的亲和能力改变。研究还显示GDF5-L373R突变后Smurf1蛋白水平上调,p-samd1/5/8表达水平下调,Col II表达水平上调。结论GDF5-L373R突变由于减弱了与BMPRIB结合能力而使细胞内p-smad1/5/8减少,ColⅡ表达增加,软骨细胞特征持续表达,软骨细胞分化能力减弱,关节形成缺陷,导致SYM1表型。

关键词： GDF5 基因突变 SYM1

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人EPHA2基因突变表达载体的构建及鉴定

人EPHA2基因突变表达载体的构建及鉴定

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中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会

作者：李靖岩罗阳王述森张学中国医科大学医学基因组学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室

EPHA2基因位于人类染色体1p36,其编码的EPHA2蛋白属酪氨酸蛋白激酶受体,在人类晶体上皮细胞和纤维细胞有大量表达,通过与其配体ephrin的结合指导细胞问的相瓦作用,来维持晶体细胞正常形状和高度有序排列,从而终生维持晶体的透明度。前... 详细信息

EPHA2基因位于人类染色体1p36,其编码的EPHA2蛋白属酪氨酸蛋白激酶受体,在人类晶体上皮细胞和纤维细胞有大量表达,通过与其配体ephrin的结合指导细胞问的相瓦作用,来维持晶体细胞正常形状和高度有序排列,从而终生维持晶体的透明度。前期实验证实,该基因16内含子剪切突变(c.2826-9G>A),可导致先天性全白内障的发生。为了研究EPHA2基因剪切突变对EPH-ephrin信号通路的影响,我们构建了pcDNA3.1-IRES-EPHA2-WT/INS真核表达载体,以观察突变EPHA2蛋白表达水平变化,并初步探讨该剪切突变导致先天性全白内障的分子致病机制。目的在pcDNA3.1真核表达载体多克隆位点中插入IRES序列,并在IRES序列前后分别插入突变及野生型EPHA2基因cDNA全长,在293T细胞系中观察突变蛋白表达以及该剪切突变对EPH-ephrin信号通路的影响。方法以pcDNA3-IRESneo为模板PCR扩增IRES序列,设计上下游引物分别引入BamHI、ClaI及SmaI、EcoRI酶切位点,利用BamHI/EcoRI双酶切PCR产物及pcDNA3.1(+)空载休,将IRES序列定向插入pcDNA3.1(+)载体MCS中,命名为pcDNA3.1-IRES。SmaI/XhoI双酶切pcDNA3.1-IRES,将已克隆的野生型EPHA2基因cDNA全长插入至IRES序列后,命名为pcDNA3.1-IRES-EPHA2-WT。以NheI/ClaI双酶切该载体,住IRES序列前插入突变型cDNA全长,并酶切电泳和DNA测序验证。结果酶切、PCR和DNA测序鉴定均证实插入片段的正确性,免疫印迹检测该载体在真核细胞中能够表达。结论成功构建pcDNA3.1-IRES-EPHA2-WT/INS真核表达载体,为进一步研究EPHA2基因剪切突变对EPH-ephrin下游信号系统的影响及导致先天性全白内障的分子致病机制奠定了基础。

关键词：先天性白内障 EPHA2 剪切突变真核表达载体

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应用ATP定量试剂Kinase-Glo检测CDK2激酶活性

应用ATP定量试剂Kinase-Glo检测CDK2激酶活性

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中华医学会医学细胞生物学分会第三届全国学术会议

作者：刘琦罗阳中国医科大学教育部医学细胞生物学重点实验室医学基因组学教研室沈阳 110001

目前在进行体外激酶活性分析试验中,通常采用的方法主要包括同位素标记、荧光偏振法及特异性磷酸化抗体的使用。本文通过对细胞周期素依赖性蛋白激酶(CDK)2的活性检测,介绍ATP定量试剂Kinase-Glo在体外激酶活性分析的应用,由HeLa细胞以... 详细信息

目前在进行体外激酶活性分析试验中,通常采用的方法主要包括同位素标记、荧光偏振法及特异性磷酸化抗体的使用。本文通过对细胞周期素依赖性蛋白激酶(CDK)2的活性检测,介绍ATP定量试剂Kinase-Glo在体外激酶活性分析的应用,由HeLa细胞以免疫沉淀的方法纯化CDK2蛋白并进行体外激酶活性分析,观察在激酶活性分析反应体系中加入不同含量的CDK2时,Kinase-Glo试剂对CDK2激酶活性的变化;应用不同浓度CDK2抑制剂roscovitine孵育细胞,以Kinase-Glo试剂检测CDK2激酶活性的变化,从而探讨Kinase-Glo试剂进行激酶活性分析的灵敏性。结果表明,作为一种便捷敏感的试剂,Kinase-Glo可以应用于激酶活性分析及抑制剂反应条件优化过程。

关键词： CDK2 激酶活性分析 Kinase-Glo

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Doc-1r蛋白参与小鼠卵母细胞成熟过程的研究

Doc-1r蛋白参与小鼠卵母细胞成熟过程的研究

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中国细胞生物学学会2015年全国学术大会

作者：刘琦申育奇郑瑞王述森罗阳中国医科大学教育部医学细胞生物学重点实验室医学基因组学教研室沈阳110001

Doc-1r(deleted in oral cancer-1 related)为小鼠卵母细胞减数分裂调节因子,参与MⅡ期纺锤体形态结构的维持。我们的前期结果提示,Doc-1r可能参与卵母细胞成熟过程的调控。为了探讨Doc-1r蛋白在哺乳动物卵母细胞成熟过程中的作用,我们...

Doc-1r(deleted in oral cancer-1 related)为小鼠卵母细胞减数分裂调节因子,参与MⅡ期纺锤体形态结构的维持。我们的前期结果提示,Doc-1r可能参与卵母细胞成熟过程的调控。为了探讨Doc-1r蛋白在哺乳动物卵母细胞成熟过程中的作用,我们以孕马血清常规对昆明雌性小鼠进行腹腔注射,48 h处死小鼠分离含有生发泡的第一次减数分裂双线期(GV期)卵母细胞;将约10 pl的Doc-1r抗体显微注射导入GV期卵母细胞后常规进行培养,在不同的时间点对卵母细胞的成熟情况进行观察。

关键词：

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Becker型肌营养不良症伴扩张型心肌病家系遗传学分析

Becker型肌营养不良症伴扩张型心肌病家系遗传学分析

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首届中国遗传与疾病论坛——常见与罕见神经遗传病规范化诊治学术交流会

作者：邢雪莎吴雨虹季春燕王述森罗阳中国医科大学医学基因组学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室沈阳 110001

目的 Becker型肌营养不良(Becker muscular dystrophy,BMD)是一组临床表现与DMD相似,但起病较晚、进展缓慢、预后较好的一种良性的性连锁遗传病.多累及男性,女性多为携带者,其发病率为1/12000.主要症状为进行性肌无力,腓肠肌假性肥大,... 详细信息

目的 Becker型肌营养不良(Becker muscular dystrophy,BMD)是一组临床表现与DMD相似,但起病较晚、进展缓慢、预后较好的一种良性的性连锁遗传病.多累及男性,女性多为携带者,其发病率为1/12000.主要症状为进行性肌无力,腓肠肌假性肥大,可伴有癫痫发作,智力障碍,几乎100％伴有心功能损害,大约1/3患者会发展成扩张型心肌病.BMD和Duchenne型肌营养不良(DMD)均由致病基因Dystrophin基因突变引起.本研究旨在对一个中国汉族BMD伴扩张型心肌病家系进行Dystrophin基因突变分析,观察患者的临床特征,并探讨可能的治疗途径,为该病的基因诊断和遗传学咨询提供依据.

关键词： Becker型肌营养不良症 Dystrophin基因基因突变心脏移植

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低磷酸盐血症性佝偻病PHEX基因突变分析

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国际遗传学杂志 2011年第3期34卷 123-126页

作者：曹丽华麻宏伟王述森王琳罗阳中国医科大学基础医学院医学基因组学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室中国医科大学附属盛京医院发育儿科

目的鉴定一个低磷酸盐血症性佝偻病家系的致病基因突变。方法采集患者外周静脉血,提取基因组DNA。PCR扩增PHEX基因22个外显子及外显子/内含子交界区序列,进行DNA测序分析。结果 DNA测序结果表明患儿PHEX基因第20内含子受体位点突变,IVS2... 详细信息

目的鉴定一个低磷酸盐血症性佝偻病家系的致病基因突变。方法采集患者外周静脉血,提取基因组DNA。PCR扩增PHEX基因22个外显子及外显子/内含子交界区序列,进行DNA测序分析。结果 DNA测序结果表明患儿PHEX基因第20内含子受体位点突变,IVS20-1G>T。结论 PHEX基因新剪接突变IVS20-1 G>T导致该家系低磷酸盐血症性佝偻病的发生。

关键词：低磷酸盐血症性佝偻病 PHEX 受体位点剪接突变

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医学院校基因组生物学课程改革探索和体会

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基础医学教育 2024年第11期26卷 927-930页

作者：刘琦高锦兰邢雪莎陈晨王述森罗阳中国医科大学生命科学学院教育部医学细胞生物学重点实验室医学基因组学教研室沈阳110122

基因组生物学教学是医学和生物学相关专业重要教学内容之一,课程自身存在多学科交叉及知识更新快的特点。文章分析总结了中国医科大学基因组生物学课程改革的探索和体会,从教学内容的更新、教材选用、课程思政、教学形式及考核方式等方... 详细信息

基因组生物学教学是医学和生物学相关专业重要教学内容之一,课程自身存在多学科交叉及知识更新快的特点。文章分析总结了中国医科大学基因组生物学课程改革的探索和体会,从教学内容的更新、教材选用、课程思政、教学形式及考核方式等方面提出了探索性建议,加强了基础理论拓展及教学与科研、临床工作的结合,为基因组生物学教学提供借鉴和参考。

关键词：基因组生物学教学改革教材选择课程评价考核方式

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利用CRISPR/Cas9技术构建DOC-1R基因敲除的HEK-293稳转细胞系

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解剖科学进展 2020年第3期26卷 339-342页

作者：王世全郭莹莹沈飞高锦兰邢雪莎王述森罗阳刘琦中国医科大学医学基因组学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室生命科学学院辽宁沈阳110122

目的利用CRISPR/Cas9技术敲除人胚肾(human embryonic kidney cell,HEK-293)细胞中DOC-1R,构建DOC-1R敲除的HEK-293稳转细胞系,用于进一步讨论DOC-1R的生物学功能。方法根据CRISPR/Cas9设计原则,设计向导RNA(single-guide RNA,sgRNA),构建表达载体,对sgRNA测序并转染包装HEK-293T收集上清液测定病毒滴度。前期用Cas9-puro慢病毒感染HEK-293,用已制备的DOC-1R慢病毒感染稳转Cas9的HEK-293,72 h后显微镜下观察HEK-293表达红色荧光蛋白,并用Western blot检测HEK-293中DOC-1R的表达以确定沉默效果。结果测序显示插入的sgRNA序列正确,表达载体成功构建,显微镜下观察到,90%以上HEK-293表达红色荧光蛋白,HEK-293中DOC-1R蛋白表达减少,确定了DOC-1R敲除效果最明显的序列为GCCTACCTATGCTGGCAGCA。结论利用CRISPR/Cas9技术成功构建DOC-1R基因敲除的细胞系,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。

关键词： DOC-1R 基因敲除 CRISPR/Cas9技术慢病毒

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