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第八届全国创伤修复(愈合)与组织再生学术交流会

作者：施萍李彩虹张殿宝刘晓玉张涛庞希宁中国医科大学附属第一医院全科医学教研室辽宁沈阳110001 教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室中国医科大学干细胞与再生医学研究室辽宁沈阳110001

目的研究EGF干预人羊膜间充质干细胞前后的基因表达差异,在基因水平上探讨EGF作用的分子生物学机制.方法无菌条件下取孕期38～40周的人羊膜,胰酶胶原酶消化法分离人羊膜间充质干细胞,待细胞传至P1代后更换无血清培养液;取4-6代细胞提...

目的研究EGF干预人羊膜间充质干细胞前后的基因表达差异,在基因水平上探讨EGF作用的分子生物学机制.方法无菌条件下取孕期38～40周的人羊膜,胰酶胶原酶消化法分离人羊膜间充质干细胞,待细胞传至P1代后更换无血清培养液;取4-6代细胞提取总RNA,用高通量Illumina测序RNA-Seq表达谱分析技术,对体外培养的用EGF干预人羊膜间充质干细胞,对干预前后mRNA进行测序,筛选差异表达基因并进行数字基因表达谱分析、聚类分析、Gene Ontology功能显著性富集分析、Pathway显著性富集分析和蛋白互作网络分析;采用qRT-PCR检测对上述结果进行验证.结果与人类基因组数据库(Hg18)进行比对,比较人羊膜间充质干细胞和EGF干预人羊膜间充质干细胞差异表达,发现差异表达基因104个,其中上调已知基因56个;下调已知基因48个.RNA-Seq的KEGG pathways的显著性富集分析,细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路为差异表达基因中显著富集的pathways(q≤0.05).该通路共涉及9个差异表达基因,其中上调差异表达基因7个(BMP2,CXCL3,IL1B,IL8,TNFRSF9,CCL2,CCL7),下调差异表达基因2个(INHBE,IFNE).经qRT-PCR检测验证获得证实.结论 EGF干预人羊膜间充质干细胞前后存在多组基因表达差异.细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路在启动人在羊膜间充质干细胞增殖和迁移过程中起着调节作用,有望成为促进羊膜间充质干细胞增殖和迁移的靶通路,对其应用于促进创面愈合具有指导意义.

关键词：

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人RNF6基因原核表达载体的构建及其重组蛋白的表达

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解剖科学进展 2011年第5期17卷 461-463,467页

作者：刘彤李洋李丹妮李丰中国医科大学基础医学院细胞生物教研室教育部医学细胞生物学重点实验室中国医科大学 94期临床医学辽宁沈阳110001

目的构建人hRNF6基因的原核表达载体并诱导和鉴定其融合蛋白表达。方法提取前列腺癌细胞CWR22Rv1的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hRNF6全长编码基因,并将其克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,在*** BL21中诱导GST-hRNF6融合蛋白表达,并经免... 详细信息

目的构建人hRNF6基因的原核表达载体并诱导和鉴定其融合蛋白表达。方法提取前列腺癌细胞CWR22Rv1的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hRNF6全长编码基因,并将其克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,在*** BL21中诱导GST-hRNF6融合蛋白表达,并经免疫印迹鉴定结果。结果 hRNF6编码序列已被克隆至GST融合表达载体pGEX-5X-1,双酶切及测序鉴定正确,并在*** BL21中获得了诱导表达,蛋白的分子量为104KD,免疫印迹检测到了融合蛋白表达。结论成功构建基因原核表达载体,诱导表达出GST-RNF6融合蛋白。

关键词：人hRNF6基因原核表达融合蛋白 E.coli BL21

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表皮松解性掌跖角化病一家系的致病基因突变分析

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解剖科学进展 2020年第5期26卷 492-495,499页

作者：葛海军刘旭陈晨王述森王谦曹丽华罗阳张学中国医科大学生命科学学院医学基因组学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110122 中国医科大学附属第一医院神经内科辽宁沈阳110001

目的对一个表皮松解性掌跖角化症(EPPK)家系进行基因突变检测,为该家系成员提供临床遗传咨询,并初步探讨该家系患者特殊表型指节垫、指关节弯曲与KRT9基因突变的相关性。方法收集该家系中的先证者、先证者的父亲及舅舅三人的外周血并提... 详细信息

目的对一个表皮松解性掌跖角化症(EPPK)家系进行基因突变检测,为该家系成员提供临床遗传咨询,并初步探讨该家系患者特殊表型指节垫、指关节弯曲与KRT9基因突变的相关性。方法收集该家系中的先证者、先证者的父亲及舅舅三人的外周血并提取基因组DNA。对以上三位家系成员进行全外显子组测序(WES),通过突变位点频率、突变类型、是否改变剪接或编码氨基酸进行筛选,并按照常染色体显性遗传方式筛选杂合突变,然后在家系内进行共分离分析,针对候选基因表达及已知功能分析,得到候选基因突变位点,并进行Sanger测序验证。应用生物信息学软件对KRT9基因结构域和功能域进行分析,针对161位氨基酸位点改变,进行文献综述和基因型-表型相关性探讨。结果本研究报道了一个中国EPPK家系,伴有罕见的指关节屈曲表型;WES测序检测到KRT9基因第1外显子存在杂合突变c.482A>G(p.N161S),该突变在家系内与疾病表型共分离,Sanger测序验证与WES结果一致。利用生物信息学软件预测到N161突变成S161后,角蛋白9的无规则卷曲发生空间位置改变,α螺旋结构有明显缺少,突变位点附近氢键数量增加,键长变长。对角蛋白9的161位点突变所致EPPK进行文献综述,发现N161S突变与指节垫表型高度相关。结论本研究报道了国际上第三例伴有罕见指关节屈曲表型的EPPK家系,初步认为KRT9基因c.482A>G(p.N161S)为该EPPK家系致病突变,对患者明确诊断及遗传咨询有重要意义。

关键词： EPPK KRT9基因突变指节垫

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细胞紧密连接的结构组成及其调控的研究进展

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解剖科学进展 2010年第1期16卷 71-74页

作者：马怡然尚德淑方文刚陈誉华中国医科大学基础医学院卫生部细胞生物学重点实验室发育生物学教研室辽宁沈阳110001 中国医科大学附属第一医院输血科辽宁沈阳110001

紧密连接(tight junction)位于相邻细胞间隙的顶端侧面,对于维持表皮和内皮细胞的选择渗透性屏障功能是非常关键的。紧密连接有两个主要功能:渗透性调节功能、维持细胞极性。本文综述了最新研究的紧密连接的蛋白质组成、紧密连接组装的... 详细信息

紧密连接(tight junction)位于相邻细胞间隙的顶端侧面,对于维持表皮和内皮细胞的选择渗透性屏障功能是非常关键的。紧密连接有两个主要功能:渗透性调节功能、维持细胞极性。本文综述了最新研究的紧密连接的蛋白质组成、紧密连接组装的信号调节、组成蛋白间的相互作用调控机制以及在生命活动中意义,为寻找某些疾病的治疗方案提供一定的理论基础。

关键词：细胞紧密连接结构组成调控蛋白质组成信号调节细胞间隙屏障功能内皮细胞

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小胶质细胞的活化对其Aβ吞噬能力的影响

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解剖科学进展 2010年第1期16卷 39-41,44页

作者：马怡然郭大文孙伟方文刚中国医科大学附属第一医院输血科辽宁沈阳110001 中国医科大学基础医学院卫生部细胞生物学重点实验室发育生物学教研室辽宁沈阳110001

目的研究活化的小胶质细胞对β淀粉样蛋白吞噬能力的影响。方法以Aβ1-42直接作用于小胶质细胞系细胞BV-2,NO检测试剂盒检测培养液中NO含量;CyQuent增殖试剂盒检测小胶质细胞BV-2的增殖情况,以及共聚焦显微镜观察小胶质细胞BV-2的Aβ吞... 详细信息

目的研究活化的小胶质细胞对β淀粉样蛋白吞噬能力的影响。方法以Aβ1-42直接作用于小胶质细胞系细胞BV-2,NO检测试剂盒检测培养液中NO含量;CyQuent增殖试剂盒检测小胶质细胞BV-2的增殖情况,以及共聚焦显微镜观察小胶质细胞BV-2的Aβ吞噬能力。结果在Aβ1-42作用下,小胶质细胞BV-2释放的NO增加,小胶质细胞BV-2增殖能力增强,并且小胶质细胞BV-2的Aβ吞噬能力增强。结论Aβ沉积诱导小胶质细胞BV-2NO释放和细胞增殖,从而使其从静止态转为活化状态,最终导致活化的小胶质细胞Aβ吞噬能力增强。

关键词：小胶质细胞BV-2 β淀粉样蛋白吞噬

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TNF-α、NF-κB诱导糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡及雷帕霉素干预影响(英文)

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心血管康复医学杂志 2012年第2期21卷 117-122,F0002页

作者：徐锦春陈思娇熊盈陈婕宋今丹中国医科大学附属第一医院老年病教研室辽宁沈阳110001 中国医科大学医学分子生物学研究所卫生部细胞生物学重点实验室

目的:探讨糖尿病大鼠肾组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)、核转录因子-κB(NF-κB)对肾组织细胞凋亡的诱导以及雷帕霉素干预的作用。方法:选择2型糖尿病大鼠(GK大鼠)20只,均分为糖尿病模型组(DM组),雷帕霉素治疗组(DMR组,建立糖尿病模型后给... 详细信息

目的:探讨糖尿病大鼠肾组织肿瘤坏死因子α(TNF-α)、核转录因子-κB(NF-κB)对肾组织细胞凋亡的诱导以及雷帕霉素干预的作用。方法:选择2型糖尿病大鼠(GK大鼠)20只,均分为糖尿病模型组(DM组),雷帕霉素治疗组(DMR组,建立糖尿病模型后给予雷帕霉素治疗);另选择10只Wistar雄性大鼠作为正常对照组。分别在4周、8周后检测各组肾组织细胞凋亡情况,NF-κB,TNF-α的表达水平以及血脂、血糖水平。结果:模型制作后4周、8周,与正常对照组和DMR组比较,DM组大鼠肾组织细胞凋亡数[RCA,4周(0.217±0.031)、(0.272±0.031)比(0.545±0.031)、8周(0.358±0.031)、(0.350±0.031)比(0.811±0.031)]均明显增多,NF-κBp65[OD:4周(0.160±0.027)、(0.131±0.027)比(0.411±0.027)、8周(0.232±0.027)、(0.275±0.027)比(0.634±0.027)]、TNF-α[OD:4周(0.242±0.027)、(0.275±0.027)比(0.617±0.027)、8周(0.385±0.027)、(0.342±0.027)比(0.912±0.027)]表达均明显升高(P均<0.01)。相关分析显示,肾组织NF-κBp65与TNF-α,RCA与TNF-α,NF-κBp65均呈正相关关系(r=0.956,0.953,0.886,P均<0.01)。结论:糖尿病病大鼠的肾细胞凋亡显著增加,雷帕霉素干预组肾细胞凋亡显著减少,NF-κB、TNF-α表达显著增加,其保护作用可能是NF-κB、TNF-α阻滞细胞的凋亡。

关键词：糖尿病,2型细胞凋亡西罗莫司大鼠

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hβ-arrestin2基因重组质粒构建及蛋白表达和定位

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现代肿瘤医学 2015年第9期23卷 1198-1200页

作者：刘彩红毛琪郭文东朱亚勤中国医科大学基础医学院细胞病理生物学研究室细胞生物学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110001 哈尔滨医科大学大庆校区医学检验与技术学院免疫教研室黑龙江大庆163319

目的:构建p EGFP-C1-β-arrestin2融合蛋白表达载体,并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:以p GEX-5X-1-β-arrestin2为模板,PCR法扩增hβ-arrestin2编码序列,亚克隆至p EGFP-C1中,p EGFP-C1-β-arrestin2经双酶切初步鉴定再送测... 详细信息

目的:构建p EGFP-C1-β-arrestin2融合蛋白表达载体,并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:以p GEX-5X-1-β-arrestin2为模板,PCR法扩增hβ-arrestin2编码序列,亚克隆至p EGFP-C1中,p EGFP-C1-β-arrestin2经双酶切初步鉴定再送测序公司检测正确后瞬时转染人胚肾细胞HEK293,Western blot检测融合蛋白表达。激光扫描共聚焦显微镜观察融合蛋白在HEK293细胞中的分布。结果:hβ-arrestin2编码序列被成功克隆至p EGFP-C1中,Western blot检测到融合蛋白表达,分子量约为77k Da,p EGFP-C1-β-arrestin2定位于HEK293细胞的细胞质中。结论:成功构建hβ-arrestin2基因真核表达载体,证实了融合蛋白定位在HEK293的细胞质中。

关键词： hβ-arrestin2基因蛋白质印记绿色荧光蛋白

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HDAC2在肝细胞肝癌中对MMP9表达的影响

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现代肿瘤医学 2019年第3期27卷 390-393页

作者：尹中波王春玉赵越南通市第六人民医院病理科江苏南通226011 中国医科大学基础医学院染色质生物学研究室.教育部医学细胞生物学重点实验室.卫生部细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110001

目的:明确组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)在肝细胞肝癌(HCC)中对基质金属蛋白酶9(MMP9)表达的影响。方法:利用mRNA表达谱芯片数据进行统计分析,确定HDAC2和MMP9的mRNA在HCC组织中的表达情况及相关性;实时定量PCR检测HDAC2过表达对MMP9转录的... 详细信息

目的:明确组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)在肝细胞肝癌(HCC)中对基质金属蛋白酶9(MMP9)表达的影响。方法:利用mRNA表达谱芯片数据进行统计分析,确定HDAC2和MMP9的mRNA在HCC组织中的表达情况及相关性;实时定量PCR检测HDAC2过表达对MMP9转录的影响;蛋白免疫印迹检测HDAC2过表达对MMP9蛋白表达的影响。结果:HDAC2和MMP9的mRNA在HCC肿瘤组织中均表达升高并呈正相关性;在Hep G2细胞中,HDAC2促进MMP9的转录及蛋白表达。结论:HDAC2在HCC中促进MMP9的表达,可能在HCC转移过程中发挥作用。

关键词：组蛋白去乙酰化酶2 基质金属蛋白酶9 肝细胞肝癌肿瘤转移

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限制性片段长度多态性结合微流控芯片电泳检测大肠癌K-ras基因点突变

限制性片段长度多态性结合微流控芯片电泳检测大肠癌K-ras基因点...

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中华医学会医学细胞生物学分会第三届全国学术会议

作者：张惠丹宋瑾任辉徐章润王晓楠方瑾中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室医学细胞生物学教育部重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室沈阳 110001 沈阳市肛肠医院大肠外科沈阳 110002 东北大学分析科学研究中心沈阳 110004

目的 K-ras基因点突变发生于早期腺瘤向中期腺瘤的转变阶段,可能是大肠癌恶变的始动基因.微流控芯片技术是近年迅速发展起来的新的微型分析系统,具有微型化、自动化、集成化及便携化的特点.本研究以K-ras基因点突变作为检测对象,将限制... 详细信息

目的 K-ras基因点突变发生于早期腺瘤向中期腺瘤的转变阶段,可能是大肠癌恶变的始动基因.微流控芯片技术是近年迅速发展起来的新的微型分析系统,具有微型化、自动化、集成化及便携化的特点.本研究以K-ras基因点突变作为检测对象,将限制性片段长度多态性(RFLP)与微流控芯片相结合,建立将样品进样、分离、检测和记录等步骤连续自动处理的基因突变检测平台.方法 PCR扩增含有K-ras基因第一外显子的第12位密码子的片段,并进行Mva Ⅰ酶切,酶切产物以微流控电泳系统进行检测.采用光刻及高温封接技术制作通道为十字交叉形的玻璃微流控芯片,结合激光诱导荧光检测系统,建立微流控毛细管电泳技术平台.采用该平台对6种已知突变类型的大肠癌细胞系及98例大肠癌石蜡包埋组织中的K-ras基因突变进行检测.同时将大肠癌K-ras基因野生型细胞株HT29和纯合突变细胞株SW480以不同比例混合,研究系统的检测灵敏度.结果 RFLP结合微流控芯片电泳平台可在5 min内实现对K-ras基因的高效检测,6种大肠癌细胞系中K-ras基因的纯合突变、杂合突变及野生型均被准确检出.对不同比例野生型/纯合突变型混合细胞的检测显示系统的检测灵敏度可达1/10 000.该系统对98例石蜡包埋组织标本中K-ras的突变检出率为28.6％(28/98),显著高于测序的检出率13.3％(13/98).结论本研究建立的RFLP结合微流控芯片电泳平台能够对K-ras基因突变进行高效检测,具有灵敏度高、特异性强、快速和低成本等优势,为快速进行肿瘤基因突变筛查及早期诊断提供了新的技术平台.

关键词：微流控芯片限制性片段长度多态性大肠癌 K-ras基因点突变

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RNF8在前列腺癌细胞中的表达与定位

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现代肿瘤医学 2013年第5期21卷 980-983页

作者：尹中波霍云龙周婷婷王春玉赵越阜新市矿业集团总医院病理科辽宁阜新123000 中国医科大学盛京医院病理科辽宁沈阳110004 中国医科大学基础医学院染色质生物学研究室教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110001

目的:构建Flag-RNF8真核表达质粒,证实融合蛋白在前列腺癌细胞内的表达与定位。方法:提取人前列腺癌细胞CWR22RV1总RNA,反转录为cDNA。PCR扩增RNF8全长编码区cDNA序列,亚克隆至含有Flag标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转... 详细信息

目的:构建Flag-RNF8真核表达质粒,证实融合蛋白在前列腺癌细胞内的表达与定位。方法:提取人前列腺癌细胞CWR22RV1总RNA,反转录为cDNA。PCR扩增RNF8全长编码区cDNA序列,亚克隆至含有Flag标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到前列腺癌细胞CWR22RV1中,提取细胞蛋白进行Western blot检测,同时利用共聚焦激光扫描显微镜观察Flag-RNF8在CWR22RV1细胞内定位。使用免疫沉淀的方法纯化RNF8蛋白。结果:RNF8蛋白全长编码区cDNA克隆到了真核表达载体pcDNA3-Flag中,酶切鉴定片段约为1500bp。Western blot检测到了融合蛋白Flag-RNF8的表达,分子量约为57kDa。Flag-RNF8在CWR22RV1细胞中表达并定位在细胞核中。成功纯化RNF8蛋白。结论:成功构建了Flag-RNF8全长编码区cDNA的真核表达质粒;鉴定了Flag-RNF8融合蛋白的表达并纯化RNF8蛋白;在CWR22RV1细胞中,Flag-RNF8蛋白主要定位在细胞核中。为进一步研究RNF8的生物学特性及其功能奠定了基础。

关键词： RNF8 Western blot 免疫沉淀

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