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第八届全国创伤修复(愈合)与组织再生学术交流会

作者：李彩虹施萍庞希宁教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室中国医科大学干细胞与再生医学研究室辽宁沈阳110001 中国医科大学附属第一医院全科医学教研室辽宁沈阳110001

目的：研究表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)能否促进人羊膜间充质干细胞(human amnion mesenchymal stem cell,hAMSC)增殖和定向迁移及其机理.方法：酶消化法体外分离hAMSCs,37℃,5％的CO2培养箱中培养.免疫细胞化学方法检...

目的：研究表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)能否促进人羊膜间充质干细胞(human amnion mesenchymal stem cell,hAMSC)增殖和定向迁移及其机理.方法：酶消化法体外分离hAMSCs,37℃,5％的CO2培养箱中培养.免疫细胞化学方法检测干细胞表面标志波形蛋白、CD44、*** chamber法观察EGF浓度梯度对hAMSCs定向迁移的影响.Transwell小室测定EGF对hAMSCs迁移的作用,及EGFR抑制剂AG1478、PI3K抑制剂LY294002、ERK抑制剂U0126对EGF作用的影响.蛋白免疫印迹法检测EGF处理后EGFR、AKT、ERK的磷酸化水平的变化,分析其与细胞迁移的关系.结果：使用Dunn chemotaxis chamber对EGF刺激后的hAMSC进行超过两小时的细胞运动研究,发现经线性浓度梯度的EGF刺激hAMSC后,其表现为特异性的定向迁移,平均迁移率为6.45μm/h.同时EGF还能增加表皮生长因子受体(EGFR)、蛋白酶B(AKT)及细胞外信号调节激酶1/2(ERK)的磷酸化水平.EGF诱导的ERK活性能被EGFR阻滞剂AG1478和PI3K阻滞剂LY-294002所抑制.我们还发现EGF调节PAK1信号通路很可能与hAMSC的定向迁移相关.此外,AG1478、LY-294002、U0126(ERK阻滞剂)能够减弱EGF促进的hAMSC定向迁移.结论：我们的研究表明EGF诱导的hAMSC增殖和迁移受EGFR调控—EGFR激活下游PI3K/AKT和ERK信号通路,并且hAMSC的迁移与PAK1相关.

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EGF作用人羊膜间充质干细胞创伤修复相关蛋白的Seq-RNA表达

EGF作用人羊膜间充质干细胞创伤修复相关蛋白的Seq-RNA表达

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第八届全国创伤修复(愈合)与组织再生学术交流会

作者：李彩虹施萍张殿宝刘晓玉张涛庞希宁教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室中国医科大学干细胞与再生医学研究室辽宁沈阳110001 中国医科大学附属第一医院全科医学教研室辽宁沈阳110001

目的检测人羊膜间充质干细胞(HAMSCs)伤口愈合相关蛋白白细胞介素6,8;转化因子1,β的表达水平.方法无菌条件下取孕期38～40周的人羊膜,胰酶胶原酶消化法分离人羊膜间充质干细胞,待细胞传至P1代后更换无血清培养液;取4-6代细胞用免疫...

目的检测人羊膜间充质干细胞(HAMSCs)伤口愈合相关蛋白白细胞介素6,8;转化因子1,β的表达水平.方法无菌条件下取孕期38～40周的人羊膜,胰酶胶原酶消化法分离人羊膜间充质干细胞,待细胞传至P1代后更换无血清培养液;取4-6代细胞用免疫细胞化学法和流式细胞术检测细胞表面抗原;用骨软骨脂肪表皮诱导分化培养基进行诱导分化.EGF100ng/ml作用hAMSC,分别提取hAMSC和EGF作用hAMSC总RNA,进行RNA-Seq分析.用qRT-PCR检测验证.结果培养的人羊膜间充质干细胞呈梭形,旋涡样生长.通过流式细胞术检测HAMSCs高表达间充质干细胞相关的细胞表面标志物CD44,CD90,CD105;免疫细胞化学法检测HAMSCs高表达间充质干细胞相关的细胞表面标志物CD90,CD73,***在骨,软骨,脂肪,表皮诱导分化培养基中可向成骨细胞、软骨和脂肪细胞及表皮细胞分化.Seq-RNA表达谱测序涉及创伤修复12个相关的表达基因,其中,上调基因9个(BMP2、CXCL3、IL1β、IL8、PLAT、PLAU、CCL2、CCL7、DCBLD2);下调基因3个(C3、NGF、OLR1).并经qRT-PCR检测验证得到证实.结论人羊膜间充质干细胞具有多向分化的潜能和干细胞的生物学特性,并能在一定诱导条件下分化为表皮细胞;表达伤口愈合相关蛋白BMP2、CXCL3、IL1β、IL8、PLAT、PLAU、CCL2、CCL7、DCBLD2.这一结果支持了人羊膜间充质干细胞在创伤修复中的应用.

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EGF干预人羊膜间充质干细胞差异表达基因及基因功能富集分析

EGF干预人羊膜间充质干细胞差异表达基因及基因功能富集分析

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第八届全国创伤修复(愈合)与组织再生学术交流会

作者：施萍李彩虹张殿宝刘晓玉张涛庞希宁中国医科大学附属第一医院全科医学教研室辽宁沈阳110001 教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室中国医科大学干细胞与再生医学研究室辽宁沈阳110001

目的研究EGF干预人羊膜间充质干细胞前后的基因表达差异,在基因水平上探讨EGF作用的分子生物学机制.方法无菌条件下取孕期38～40周的人羊膜,胰酶胶原酶消化法分离人羊膜间充质干细胞,待细胞传至P1代后更换无血清培养液;取4-6代细胞提...

目的研究EGF干预人羊膜间充质干细胞前后的基因表达差异,在基因水平上探讨EGF作用的分子生物学机制.方法无菌条件下取孕期38～40周的人羊膜,胰酶胶原酶消化法分离人羊膜间充质干细胞,待细胞传至P1代后更换无血清培养液;取4-6代细胞提取总RNA,用高通量Illumina测序RNA-Seq表达谱分析技术,对体外培养的用EGF干预人羊膜间充质干细胞,对干预前后mRNA进行测序,筛选差异表达基因并进行数字基因表达谱分析、聚类分析、Gene Ontology功能显著性富集分析、Pathway显著性富集分析和蛋白互作网络分析;采用qRT-PCR检测对上述结果进行验证.结果与人类基因组数据库(Hg18)进行比对,比较人羊膜间充质干细胞和EGF干预人羊膜间充质干细胞差异表达,发现差异表达基因104个,其中上调已知基因56个;下调已知基因48个.RNA-Seq的KEGG pathways的显著性富集分析,细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路为差异表达基因中显著富集的pathways(q≤0.05).该通路共涉及9个差异表达基因,其中上调差异表达基因7个(BMP2,CXCL3,IL1B,IL8,TNFRSF9,CCL2,CCL7),下调差异表达基因2个(INHBE,IFNE).经qRT-PCR检测验证获得证实.结论 EGF干预人羊膜间充质干细胞前后存在多组基因表达差异.细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路在启动人在羊膜间充质干细胞增殖和迁移过程中起着调节作用,有望成为促进羊膜间充质干细胞增殖和迁移的靶通路,对其应用于促进创面愈合具有指导意义.

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表皮松解性掌跖角化病一家系的致病基因突变分析

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解剖科学进展 2020年第5期26卷 492-495,499页

作者：葛海军刘旭陈晨王述森王谦曹丽华罗阳张学中国医科大学生命科学学院医学基因组学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110122 中国医科大学附属第一医院神经内科辽宁沈阳110001

目的对一个表皮松解性掌跖角化症(EPPK)家系进行基因突变检测,为该家系成员提供临床遗传咨询,并初步探讨该家系患者特殊表型指节垫、指关节弯曲与KRT9基因突变的相关性。方法收集该家系中的先证者、先证者的父亲及舅舅三人的外周血并提... 详细信息

目的对一个表皮松解性掌跖角化症(EPPK)家系进行基因突变检测,为该家系成员提供临床遗传咨询,并初步探讨该家系患者特殊表型指节垫、指关节弯曲与KRT9基因突变的相关性。方法收集该家系中的先证者、先证者的父亲及舅舅三人的外周血并提取基因组DNA。对以上三位家系成员进行全外显子组测序(WES),通过突变位点频率、突变类型、是否改变剪接或编码氨基酸进行筛选,并按照常染色体显性遗传方式筛选杂合突变,然后在家系内进行共分离分析,针对候选基因表达及已知功能分析,得到候选基因突变位点,并进行Sanger测序验证。应用生物信息学软件对KRT9基因结构域和功能域进行分析,针对161位氨基酸位点改变,进行文献综述和基因型-表型相关性探讨。结果本研究报道了一个中国EPPK家系,伴有罕见的指关节屈曲表型;WES测序检测到KRT9基因第1外显子存在杂合突变c.482A>G(p.N161S),该突变在家系内与疾病表型共分离,Sanger测序验证与WES结果一致。利用生物信息学软件预测到N161突变成S161后,角蛋白9的无规则卷曲发生空间位置改变,α螺旋结构有明显缺少,突变位点附近氢键数量增加,键长变长。对角蛋白9的161位点突变所致EPPK进行文献综述,发现N161S突变与指节垫表型高度相关。结论本研究报道了国际上第三例伴有罕见指关节屈曲表型的EPPK家系,初步认为KRT9基因c.482A>G(p.N161S)为该EPPK家系致病突变,对患者明确诊断及遗传咨询有重要意义。

关键词： EPPK KRT9基因突变指节垫

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限制性片段长度多态性结合微流控芯片电泳检测大肠癌K-ras基因点突变

限制性片段长度多态性结合微流控芯片电泳检测大肠癌K-ras基因点...

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中华医学会医学细胞生物学分会第三届全国学术会议

作者：张惠丹宋瑾任辉徐章润王晓楠方瑾中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室医学细胞生物学教育部重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室沈阳 110001 沈阳市肛肠医院大肠外科沈阳 110002 东北大学分析科学研究中心沈阳 110004

目的 K-ras基因点突变发生于早期腺瘤向中期腺瘤的转变阶段,可能是大肠癌恶变的始动基因.微流控芯片技术是近年迅速发展起来的新的微型分析系统,具有微型化、自动化、集成化及便携化的特点.本研究以K-ras基因点突变作为检测对象,将限制... 详细信息

目的 K-ras基因点突变发生于早期腺瘤向中期腺瘤的转变阶段,可能是大肠癌恶变的始动基因.微流控芯片技术是近年迅速发展起来的新的微型分析系统,具有微型化、自动化、集成化及便携化的特点.本研究以K-ras基因点突变作为检测对象,将限制性片段长度多态性(RFLP)与微流控芯片相结合,建立将样品进样、分离、检测和记录等步骤连续自动处理的基因突变检测平台.方法 PCR扩增含有K-ras基因第一外显子的第12位密码子的片段,并进行Mva Ⅰ酶切,酶切产物以微流控电泳系统进行检测.采用光刻及高温封接技术制作通道为十字交叉形的玻璃微流控芯片,结合激光诱导荧光检测系统,建立微流控毛细管电泳技术平台.采用该平台对6种已知突变类型的大肠癌细胞系及98例大肠癌石蜡包埋组织中的K-ras基因突变进行检测.同时将大肠癌K-ras基因野生型细胞株HT29和纯合突变细胞株SW480以不同比例混合,研究系统的检测灵敏度.结果 RFLP结合微流控芯片电泳平台可在5 min内实现对K-ras基因的高效检测,6种大肠癌细胞系中K-ras基因的纯合突变、杂合突变及野生型均被准确检出.对不同比例野生型/纯合突变型混合细胞的检测显示系统的检测灵敏度可达1/10 000.该系统对98例石蜡包埋组织标本中K-ras的突变检出率为28.6％(28/98),显著高于测序的检出率13.3％(13/98).结论本研究建立的RFLP结合微流控芯片电泳平台能够对K-ras基因突变进行高效检测,具有灵敏度高、特异性强、快速和低成本等优势,为快速进行肿瘤基因突变筛查及早期诊断提供了新的技术平台.

关键词：微流控芯片限制性片段长度多态性大肠癌 K-ras基因点突变

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花样结构白蛋白缓释载体的制备及在豚鼠内耳跨膜给药的应用

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解剖科学进展 2013年第6期19卷 520-524页

作者：于湛于敏周志敏张之宝杜博张哲熊青青中国人民解放军第二炮兵总医院耳鼻喉科北京100088 中国医科大学卫生部细胞生物学重点实验室医学细胞生物学教育部重点实验室细胞生物学教研室沈阳110001 中国医学科学院生物医学工程研究所天津300192

目的制备花样结构白蛋白（flower—shaped bovine serum albumin，FBSA）微纳材料作为载体进行内耳跨圆窗膜给药研究，为临床寻找新的药物缓释载体奠定基础。方法应用改良的去溶剂法制备FBSA微纳材料，并用荧光显微镜、电子显微镜、粒... 详细信息

目的制备花样结构白蛋白（flower—shaped bovine serum albumin，FBSA）微纳材料作为载体进行内耳跨圆窗膜给药研究，为临床寻找新的药物缓释载体奠定基础。方法应用改良的去溶剂法制备FBSA微纳材料，并用荧光显微镜、电子显微镜、粒径分析仪等对其进行系统的表征。通过体外药物释放实验、MTF法来评估其细胞相容性和细胞毒性。通过小动物活体成像观察FBSA在豚鼠听泡内的扩散及在圆窗膜上的附着。结果蛋白基微纳米材料为放射状花样结构，大小约为50～80μm。空白FBSA微纳材料的zeta电位是-16．2mV，其最高的载药量和包封率分别是21．4％和40．0％，具有缓释效果。通过L929细胞的毒性实验测试提示经热变性处理固定后的材料具有更低的毒性和更好的细胞相容性。小动物活体实验可见药物在内耳中扩散及在圆窗膜表面附着。结论成功构建FBSA微纳材料载体，在治疗内耳病的局部给药方面有着良好的应用前景。

关键词：牛血清白蛋白微纳材料缓释载体圆窗膜内耳豚鼠

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白蛋白纳米粒的制备及内耳跨膜给药的初步研究

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国际生物医学工程杂志 2013年第6期36卷 324-327,343,I0008页

作者：于湛于敏周志敏张之宝杜博张哲熊青青孙建军海军总医院全军耳鼻咽喉中心北京100037 第二炮兵总医院耳鼻喉科北京100088 中国医科大学卫生部细胞生物学重点实验室医学细胞生物学教育部重点实验室细胞生物学教研室沈阳110001 中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所天津300192

目的目前在临床上国内外尚无对内耳病局部用药的缓释剂,本研究旨在探讨能否将白蛋白纳米粒载体材料作为鼓室跨膜给药缓释剂.方法采用去溶剂化法制备空白白蛋白纳米粒并进行系统表征和细胞毒性评价.为便于观察,选取一种红色荧光染料即... 详细信息

目的目前在临床上国内外尚无对内耳病局部用药的缓释剂,本研究旨在探讨能否将白蛋白纳米粒载体材料作为鼓室跨膜给药缓释剂.方法采用去溶剂化法制备空白白蛋白纳米粒并进行系统表征和细胞毒性评价.为便于观察,选取一种红色荧光染料即罗丹明B（RhB）作为模型药物,以物理吸附方式与空白白蛋白纳米粒结合形成载药白蛋白纳米粒,测定其载药量、包封率及体外药物释放曲线,同时采用小动物活体成像技术观察其注入豚鼠听泡内跨圆窗膜转运扩散情况.结果制备的白蛋白纳米粒为实心球形,表面光滑,平均粒径大小为476 nm,Zeta电位为15.4 mV.体外药物释放结果表明,该纳米粒具有缓释效果.经戊二醛交联固定的白蛋白纳米粒具有一定的细胞毒性;而经热变性处理的白蛋白纳米粒具有较好的细胞相容性.小动物活体成像实验可以看到RhB在听泡内滞留扩散,而后经解剖观察,证明白蛋白纳米粒可在圆窗膜表面附着并穿越圆窗膜实现跨膜向耳蜗内转运.结论制备的白蛋白纳米粒结构完整,制备方法简单、无毒性,可以很好地包载药物并具有缓释功能,为进一步制备可注射跨圆窗膜定向缓释纳米凝胶奠定了坚实的基础.

关键词：牛血清白蛋白纳米粒缓释载体圆窗膜内耳

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hLMO3基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

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解剖科学进展 2011年第4期17卷 347-350页

作者：顾卉佟宇鑫刘彤李妍李丹妮袁正伟中国医科大学附属盛京医院实验研究中心辽宁沈阳110001 中国医科大学基础医学院细胞生物教研室细胞生物学教育部卫生部重点实验室辽宁沈阳110001 中国医科大学临床医学系辽宁沈阳110001

目的构建hLMO3真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO3基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中。将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞HEK293细胞中,提取细胞蛋白进... 详细信息

目的构建hLMO3真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO3基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中。将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO3在HEK293细胞内的定位。结果 hLMO3基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为440bp;Western blot检测到融合蛋白在HEK293细胞表达,分子量约为42kDa,pEGFP-LMO3在人HEK293细胞中主要定位于细胞核内。结论成功构建了hLMO3基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO3蛋白在HEK293细胞中主要定位于细胞核内。

关键词： hLMO3基因质粒构建基因表达与定位人HEK293细胞

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miR-136通过靶向PPP2R2A调节TGF-β1对角质形成细胞增殖的抑制作用

miR-136通过靶向PPP2R2A调节TGF-β1对角质形成细胞增殖的抑制作用

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首届全国组织修复与再生医学大会暨国际组织修复与再生医学学术研讨会

作者：张殿宝王竞王暂张涛施萍王喜良赵峰刘晓玉林学文庞希宁中国医科大学卫生部暨教育部医学细胞生物学重点实验室干细胞与再生医学研究室沈阳110122 中国医科大学附属第一医院肛肠外科沈阳110001 中国医科大学附属盛京医院输血科沈阳110004 中国医科大学附属第一医院全科医学教研室沈阳110001

目的:角质形成细胞的增殖能力对于伤口愈合至关重要,而由成纤维细胞和角质形成细胞分泌的TGF-β1对角质形成细胞的增殖具有阻滞作用.越来越多的研究表明,microRNA参与调节角质形成细胞的增殖,而其中的分子机制仍有待阐明.本文旨在明确mi...

目的:角质形成细胞的增殖能力对于伤口愈合至关重要,而由成纤维细胞和角质形成细胞分泌的TGF-β1对角质形成细胞的增殖具有阻滞作用.越来越多的研究表明,microRNA参与调节角质形成细胞的增殖,而其中的分子机制仍有待阐明.本文旨在明确miR-136在TGF-β1诱导的角质形成细胞增殖阻滞中的作用,并探索其机制.方法:以HaCaT细胞系和人包皮皮片中分离的角质形成细胞为实验对象,建立TGF-β1诱导角质形成细胞发生上皮间充质转化的模型,相差显微镜下观察细胞形态,使用Realtime PCR检测其中标志性基因水平,通过western blot和免疫荧光进一步验证.

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可注射明胶透明质酸钠水凝胶药物载体的制备

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解剖科学进展 2014年第2期20卷 127-130,133页

作者：于湛于敏周志敏张之宝赵鸿孙冬丽孙建军中国人民解放军海军总医院全军耳鼻咽喉中心北京100037 中国人民解放军第二炮兵总医院耳鼻喉科北京100088 中国医科大学卫生部细胞生物学重点实验室医学细胞生物学教育部重点实验室细胞生物学教研室沈阳110001 中国医学科学院生物医学工程研究所天津300192 中国人民解放军第二炮兵总医院康复理疗科北京100088 第二炮兵后勤部玉泉路干休所北京100039

目的制备可注射明胶透明质酸钠水凝胶药物载体,为临床应用提供依据。方法利用现有临床材料医用透明质酸钠水凝胶和医用可吸收明胶海绵加以物理混合制备成可注射水凝胶,用荧光染料罗丹明B作为模拟药物并应用Franz扩散池评价该水凝胶的体... 详细信息

目的制备可注射明胶透明质酸钠水凝胶药物载体,为临床应用提供依据。方法利用现有临床材料医用透明质酸钠水凝胶和医用可吸收明胶海绵加以物理混合制备成可注射水凝胶,用荧光染料罗丹明B作为模拟药物并应用Franz扩散池评价该水凝胶的体外药物释放率,通过CCK-8法检测成纤维细胞(L929)的活性,通过小动物活体成像评价药物在豚鼠听泡内的分布与扩散。结果明胶透明质酸水凝胶呈凝胶状,具有可注射性、对L929细胞具有良好的相容性,对罗丹明B的体外缓释效果良好,72h的累积释放率可达42.3%。注入豚鼠听泡后可滞留72h以上,并贴附于圆窗膜上。结论成功制备了可注射明胶透明质酸钠水凝胶药物缓释载体,具有潜在的临床应用价值。

关键词：可注射水凝胶透明质酸钠明胶海绵罗丹明B 豚鼠

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