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解剖学研究 2011年第3期33卷 202-204页

作者：刘芙蓉李晓东李家滨李丰中国医科大学细胞生物教研室教育部医学细胞生物学重点实验室辽宁沈阳110001

目的构建PAK2真核表达载体及证实在胃癌细胞内的表达与定位。方法提取HeLa细胞的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增PAK2全长编码基因,克隆至pcDNA3.1A表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞SGC-7901中,Western blot检测蛋白表达,... 详细信息

目的构建PAK2真核表达载体及证实在胃癌细胞内的表达与定位。方法提取HeLa细胞的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增PAK2全长编码基因,克隆至pcDNA3.1A表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到胃癌细胞SGC-7901中,Western blot检测蛋白表达,免疫荧光检测PAK2在胃癌细胞内的定位。结果 hPAK2全长基因序列克隆到了真核表达载体pcDNA3.1A中,酶切鉴定片段为2 000 bp。Western blot检测到重组质粒蛋白表达,分子量约为75 kDa。免疫荧光检测pcDNA3.1A-PAK2在胃癌细胞内的定位以细胞浆为主,细胞核内少许。结论成功构建hPAK2全长基因真核表达载体,重组质粒主要定位于胃癌细胞浆。

关键词： PAK2 真核表达免疫印记免疫荧光胃癌

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褪黑素通过组蛋白去乙酰化途径拮抗可卡因奖赏效应

褪黑素通过组蛋白去乙酰化途径拮抗可卡因奖赏效应

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中华医学会医学细胞生物学分会第三届全国学术会议

作者：韦佳祎何威中国医科大学基础医学院发育生物学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室沈阳 110001

褪黑素能够改善吗啡依赖大鼠的成瘾症状这一神经精神药理作用机制目前尚不清楚。本研究应用条件性位置偏爱(CPP)等实验手段检测了褪黑素对大鼠可卡因奖赏效应形成的作用，并探讨了其组蛋白乙酰化修饰机制。结果发现：褪黑素对大鼠可卡... 详细信息

褪黑素能够改善吗啡依赖大鼠的成瘾症状这一神经精神药理作用机制目前尚不清楚。本研究应用条件性位置偏爱(CPP)等实验手段检测了褪黑素对大鼠可卡因奖赏效应形成的作用，并探讨了其组蛋白乙酰化修饰机制。结果发现：褪黑素对大鼠可卡因奖赏效应的形成有抑制作用;褪黑素抑制前额叶皮质和纹状体的CDK5、BDNF的三型组蛋白的高乙酰化表达;褪黑素拮抗可卡因诱导的CDK5和BDNF在前额叶皮质和纹状体的高表达;褪黑素给药介质酒精的5％使用浓度不影响可卡因依赖大鼠的CPP以及相关分子的表达。以上结果提示，褪黑素能抑制大鼠可卡因奖赏效应的形成;褪黑素抑制可卡因诱导的前额叶皮质和纹状体的CDK5、BDNF的三型组蛋白的高乙酰化，从而下调相关脑区CDK5、BDNF的高表达可能是该抑制作用的分子机制之一。

关键词：褪黑素可卡因条件性位置偏爱组蛋白乙酰化

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PLGF/VEGFR-1介导小细胞肺癌细胞穿过血脑屏障转移入脑的研究

PLGF/VEGFR-1介导小细胞肺癌细胞穿过血脑屏障转移入脑的研究

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中华医学会医学细胞生物学分会第三届全国学术会议

作者：李波王淳张一赵晓云刘永烁曹立业方文刚陈誉华中国医科大学基础医学院发育生物学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室沈阳 110001

目的大约20％的脑转移肿瘤是小细胞肺癌脑转移,具有发生时间早,恶性度高的特点,但目前没有有效的治疗手段.本研究探讨小细胞肺癌脑转移的分子机制对其防治具有重要的意义.方法胎盘生长因子(PLGF)可以促进小细胞肺癌细胞穿过体外血脑... 详细信息

目的大约20％的脑转移肿瘤是小细胞肺癌脑转移,具有发生时间早,恶性度高的特点,但目前没有有效的治疗手段.本研究探讨小细胞肺癌脑转移的分子机制对其防治具有重要的意义.方法胎盘生长因子(PLGF)可以促进小细胞肺癌细胞穿过体外血脑屏障模型.利用临床资料和体外血脑屏障模型研究进行,并进一步利用RNAi、构建ROCK激酶缺陷脑内皮细胞及激酶抑制剂抑制试验验证上述实验结果.结果临床资料研究表明,在小细胞肺癌肺部癌组织(90例)中PLGF的表达水平明显高于非癌变组织(36例)(P＜0.01),发生脑转移的小细胞肺癌患者的肺部癌组织(12例)中PLGF的表达高于未发生脑转移的患者(78例)(P＜0.01);而且发生脑转移的小细胞肺癌患者的血清及脑转移癌组织(9例)中PLGF表达明显增多,提示PLGF与小细胞肺癌脑转移有关.利用体外血脑屏障模型研究发现,PLGF通过结合脑微血管内皮细胞上VEGFR-1受体激活脑细胞内Rho/ROCK及下游的MAPK/ERK1/2信号通路,使内皮细胞间紧密连接结构蛋白occludin和claudin-5的丝氨酸/苏氨酸磷酸化水平增加,进而改变紧密连接结构的完整性,使内皮细胞单层通透性增加,促进肺癌细胞穿过体外血脑屏障模型.进一步利用RNAi、构建ROCK激酶缺陷脑内皮细胞及激酶抑制剂抑制试验验证了上述实验结果.结论小细胞肺癌细胞表达的PLGF通过与脑内皮细胞上VEGFR-1相互作用激活内皮细胞中RhoA/ROCK-MAPK/ERK 1/2信号通路,进而改变了脑微血管内皮细胞间通透性,促进小细胞肺癌细胞穿过血脑屏障转移入脑.

关键词： PLGF VEGFR-1 小细胞肺癌脑转移血脑屏障

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大肠杆菌侵袭脑微血管内皮细胞涉及的分子机制研究

大肠杆菌侵袭脑微血管内皮细胞涉及的分子机制研究

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中华医学会医学细胞生物学分会第三届全国学术会议

作者：赵伟东刘东鑫刘巍方文刚陈誉华中国医科大学基础医学院发育生物学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室沈阳 110001

近年来,从细胞分子水平探讨病原体侵袭宿主细胞涉及的机制逐渐成为细胞生物学领域的热点问题.研究表明,导致新生儿细菌性脑膜炎的最常见的致病菌是带有K1抗原的大肠杆菌(*** K1).以往的研究显示,*** K1导致脑膜炎的前提条件是进入血液... 详细信息

近年来,从细胞分子水平探讨病原体侵袭宿主细胞涉及的机制逐渐成为细胞生物学领域的热点问题.研究表明,导致新生儿细菌性脑膜炎的最常见的致病菌是带有K1抗原的大肠杆菌(*** K1).以往的研究显示,*** K1导致脑膜炎的前提条件是进入血液循环的*** K1能够穿过血脑屏障到达脑内.我们实验室利用分离培养的人脑微血管内皮细胞(HBMEC)在体外模拟血脑屏障的结构,并在此基础上从分子水平探讨*** K1侵袭并穿过血脑屏障的机制.

关键词：大肠杆菌K1株人脑微血管内皮细胞信号转导

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尼古丁暴露对成年昆明小鼠脑内APP和PS1表达的影响

尼古丁暴露对成年昆明小鼠脑内APP和PS1表达的影响

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中华医学会医学细胞生物学分会第三届全国学术会议

作者：叶承金翟秀岩中国医科大学基础医学院发育生物学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室沈阳 110001

目的流行病学者发现吸烟人群中阿尔茨海默病(AD)的发生率显著低于正常人群.文献报道尼古丁是降低AD发病率的主要成份，尼古丁暴露可以降低淀粉样前体蛋白(APP)转基因小鼠脑内和脑血管Aβ的沉积.本研究旨在观察尼古丁暴露对与AD密切相关... 详细信息

目的流行病学者发现吸烟人群中阿尔茨海默病(AD)的发生率显著低于正常人群.文献报道尼古丁是降低AD发病率的主要成份，尼古丁暴露可以降低淀粉样前体蛋白(APP)转基因小鼠脑内和脑血管Aβ的沉积.本研究旨在观察尼古丁暴露对与AD密切相关的APP和早老素1(PS1)表达是否有调控作用.方法建立尼古丁暴露小鼠动物模型，应用RT-PCR、Western blot及免疫组织化方法检测尼古丁暴露对成年昆明小鼠脑内APP和PS1表达的影响.结果 RT-PCR和Western blot方法都显示三个实验组中的PS1mRNA表达水平显著降低于对照组(P＜0.05);三个实验组中的APP mRNA的表达水平与对照组相比未见显著差异.免疫组织化学染色结果显示，在对照组的大脑皮层、海马细胞层、海马齿状回内板和齿状回多形层有大量PS1阳性细胞分布;实验组仅见第三脑室周围的下丘脑弓状核、结节乳头体腹侧核、乳头体外侧核、乳头体前核和乳头体内核部位有PS1阳性细胞分布.结论尼古丁暴露对成年昆明小鼠大脑皮层、海马细胞层、海马齿状回内板和齿状回多形层中的PS1的表达有抑制作用.

关键词：尼古丁 APP PS1 脑小鼠

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老年痴呆症中骨髓源性细胞穿过血脑屏障的机制和意义

老年痴呆症中骨髓源性细胞穿过血脑屏障的机制和意义

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中华医学会医学细胞生物学分会第三届全国学术会议

作者：尚德淑曼淑梅李曼刘怿君蔺美娜赵伟东李波方文刚陈誉华中国医科大学基础医学院发育生物学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室沈阳 110001

老年痴呆症(AD)是发病率较高的神经退行性疾病。近年来已从AD患者血浆中分离鉴定出20余种具有临床预测和诊断价值的蛋白成分。我们应用基因芯片技术分析了AD患者和同龄对照人群的血液T细胞及单核细胞中的基因表达差异,结合应用血脑屏障... 详细信息

老年痴呆症(AD)是发病率较高的神经退行性疾病。近年来已从AD患者血浆中分离鉴定出20余种具有临床预测和诊断价值的蛋白成分。我们应用基因芯片技术分析了AD患者和同龄对照人群的血液T细胞及单核细胞中的基因表达差异,结合应用血脑屏障体外模型和AD模型鼠,发现并证明AD患者外周血T细胞高表达MIP-1α和CXCR2,CXCR2的作用是促使AD模型鼠中的T细胞在脑微血管内皮细胞(BMEC)上的黏附;AD鼠脑内β-淀粉样蛋白(Aβ)的"沉积信息"能够被BMEC提呈给循环中的T细胞,T细胞通过其高表达的MIP-1α与BMEC上CCR5的相互作用,打开血脑屏障,从而使T细胞由血液迁移进入脑实质。

关键词：老年痴呆症免疫细胞骨髓干细胞血脑屏障细胞治疗

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外源性IbeB蛋白在小鼠ES细胞中互作蛋白Cathepsin A的鉴定

外源性IbeB蛋白在小鼠ES细胞中互作蛋白Cathepsin A的鉴定

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中华医学会医学细胞生物学分会第三届全国学术会议

作者：尚德淑姜静宜方文刚陈誉华中国医科大学基础医学院发育生物学教研室教育部医学细胞生物学重点实验室卫生部细胞生物学重点实验室沈阳 110001

大肠杆菌ibcB基因是其侵袭人脑微血管内皮细胞的相关基因,在细菌侵袭真核细胞过程中进入真核细胞发挥作用.前期研究发现,ibeB基因稳定转染的鼠ES细胞AB2.1特异性表达神经前体细胞标志分子——nestin,细胞有较长突起,呈类似神经生长端样... 详细信息

大肠杆菌ibcB基因是其侵袭人脑微血管内皮细胞的相关基因,在细菌侵袭真核细胞过程中进入真核细胞发挥作用.前期研究发现,ibeB基因稳定转染的鼠ES细胞AB2.1特异性表达神经前体细胞标志分子——nestin,细胞有较长突起,呈类似神经生长端样结构.为研究ibeB基因诱导AB2.1向神经前体样细胞分化的机制,利用酵母双杂交筛选AB2.1中IbeB靶蛋白.获得的80个阳性克隆中有5个为组织蛋白酶A(CathepsinA)基因,同源性达98％.为此,进一步鉴定IbeB蛋白与Cathepsin A的相互作用,酵母体内小量杂交结果表明,Cathepsin A和IbeB蛋白具有阳性相互作用;TNT(R)快速转录/翻译耦联系统对ibeB进行表达,同时构建GST-Cathepsin A表达载体,并用IPTG在大肠杆菌BL21中诱导表达,GST-pull down法验证两者可以结合,反之,用体外转录翻译体系表达小鼠Cathepsin A蛋白,用IPTG在BL21中诱导表达GST-IbeB,GSTpull down法同样表明两者可以结合;免疫荧光显示共转染ibeB和CathepsinA的HEK293细胞中两者存在共定位,免疫共沉淀结果表明两者在真核细胞中具有相互作用.Cathepsin A是一种溶酶体蛋白水解酶,主要在细胞内环境稳定方面发挥作用.我们的结果提示,IbeB可能与Cathepsin A结合诱导AB2.1向神经前体细胞分化,其机制还需进一步探讨.本研究结果可望为加深了解神经细胞分化调控机制及通过人工干预手段得到定向分化的神经前体细胞积累资料.

关键词： ibeB ES细胞神经分化 Cathepsin A

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末梢肺组织分化调控中p22功能的初步分析

末梢肺组织分化调控中p22功能的初步分析

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“细胞活动生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会

作者：陈澄宋春阳潘逼然陈誉华中国医科大学基础医学院发育生物学教研室卫生部细胞生物学重点实验室

肺是重要的呼吸器官,新生儿只有具有发育成熟的肺才能健康存活。Ⅱ型肺泡上皮细胞是维持末梢肺组织功能的重要细胞,其分化状态受到严格调控。其中p22是一种染色质结合蛋白,人类同一蛋白家族的成员为核基质蛋白,分裂期为染色体支架蛋白,... 详细信息

肺是重要的呼吸器官,新生儿只有具有发育成熟的肺才能健康存活。Ⅱ型肺泡上皮细胞是维持末梢肺组织功能的重要细胞,其分化状态受到严格调控。其中p22是一种染色质结合蛋白,人类同一蛋白家族的成员为核基质蛋白,分裂期为染色体支架蛋白,但也存在于细胞质中,具有参与多泡体形成调控等多种功能,其在末梢肺组织分化成熟中的作用尚未见报道。我们的研究发现p22可能与末梢肺组织分化成熟相关,在末梢肺组织分化成熟的高峰时期p22表达水平明显升高,MLE12细胞过表达p22能促进SPC基因的表达升高。我们还发现p22的C末端93AA-199AA与TGFβ/BMP信号通路的细胞内信号分子Smad1互作,免疫荧光实验显示二者可在胞质与胞核中共定位,免疫共沉淀试验和Pull-down试验均证实了二者的互作。Smad1作为TGFβ/BMP信号通路的细胞内信号分子在肺分枝化形态发生及末梢肺组织分化两个过程中都发挥重要的调控作用,敲除发育过程中小鼠胚胎肺上皮组织中的Smad1导致末梢肺组织中Ⅱ型肺泡上皮细胞分化不良,末梢肺组织结构发生改变,新生鼠死于呼吸障碍。p22与smad1互作可能在Ⅱ型肺泡上皮细胞分化状态调控中起重要作用。

关键词：肺发育 Ⅱ型肺泡上皮细胞 BMP4

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雷帕霉素减少GK糖尿病大鼠肾脏细胞凋亡及其机制

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中国糖尿病杂志 2011年第4期19卷 302-306页

作者：熊盈陈思娇李红燕郭英华朱贺张红艳郭晓蕙宋今丹中国医科大学附属第一医院干部医疗工作部老年医学研究室沈阳110001 北京大学第一医院内分泌科中国医科大学医学分子生物学研究所、卫生部细胞生物学重点实验室

目的观察糖尿病肾组织肿瘤坏死因子(TNF-α)、核因子(NF-κB)的表达及其与肾组织细胞凋亡关系以及雷帕霉素对其的影响。方法将20只GK大鼠随机分为DM组(n=10)、DMR组(n=10),10只Wistar大鼠作为NC组。DMR组予以6mg/kg雷帕霉素灌胃,DM与NC... 详细信息

目的观察糖尿病肾组织肿瘤坏死因子(TNF-α)、核因子(NF-κB)的表达及其与肾组织细胞凋亡关系以及雷帕霉素对其的影响。方法将20只GK大鼠随机分为DM组(n=10)、DMR组(n=10),10只Wistar大鼠作为NC组。DMR组予以6mg/kg雷帕霉素灌胃,DM与NC组仅给予等量生理盐水灌胃。TUNEL法检测肾组织细胞凋亡。免疫组织化学法(IHC)检测肾组织TNF-α和NF-κB的表达。结果 TUNEL法显示,NC组肾组织未见明显的凋亡细胞;4周及8周DM组凋亡数呈进行性增多(P<0.01)。IHC显示,NC组肾组织TNF-α、NF-κ Bp65有轻微阳性表达;4周、8周DM组NF-κBp65、TNF-α表达有逐渐上升的趋势,均显著高于正常对照组(P<0.01)。NF-κ Bp65、TNF-α阳性表达呈正相关(P<0.01);肾组织NF-α和NF-κ Bp65表达与肾组织细胞凋亡之间均呈正相关(P<0.01);与DM组比较,DMR组4周、8周组肾组织TNF-α和NF-κ Bp65的过度表达均被显著抑制(P<0.01),肾组织细胞凋亡数显著减少(P<0.01)。结论 NF-κB及其诱导的TNF-α在糖尿病肾病损伤中发挥重要作用,雷帕霉素可能通过抑制NF-κB和TNF-α的表达减少减轻肾组织细胞凋亡。

关键词：糖尿病肾病凋亡肿瘤坏死因子α 核因子κB 雷帕霉素

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GST-LM01融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

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中国医科大学学报 2011年第11期40卷 961-963,978页

作者：顾卉佟宇鑫刘彤李慧李丹妮袁正伟中国医科大学附属盛京医院实验研究中心沈阳110001 中国医科大学基础医学院细胞生物教研室/细胞生物学教育部重点实验室/细胞生物学卫生部重点实验室沈阳110001 中国医科大学第94期临床医学系沈阳110001

目的:构建***01融合蛋白表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌(***)中诱导表达。方法:以人胎脑文库为模板,用PCR方法法扩增出LM01基因全长及各个截短突变体,通过BamHI和EcoRI酶切位点分别将其定向插入pGEX-5X-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-... 详细信息

目的:构建***01融合蛋白表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌(***)中诱导表达。方法:以人胎脑文库为模板,用PCR方法法扩增出LM01基因全长及各个截短突变体,通过BamHI和EcoRI酶切位点分别将其定向插入pGEX-5X-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-5x-2-LM01及其截短突变体,通过酶切电泳鉴定和DNA序列测定正确后,转入***21中,经异丙基硫代B-D半乳糖苷诱导表达,SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果:酶切电泳及测序结果证明,成功构建了原核表达质粒pGEX-5x-2-LM01及其截短突变体,并用Westernblot方法证实了GST-LM01全长及各个截短突变体融合蛋白的表达。结论:成功构建了LM01全长及其截短突变体原核表达载体,并证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为LM01结构与功能的研究提供了前提基础。

关键词：大肠杆菌谷胱甘肽转移酶基因表达突变限制性内切酶图谱法遗传载体原核细胞重组融合蛋白质类人类

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