检索结果-内蒙古大学图书馆

微生物学通报 2023年第6期50卷 2602-2623页

作者：刘文文邓玉婷朱雪晴赵飞谭爱萍王芳张美超黄志斌上海海洋大学水产与生命学院上海201306 中国水产科学研究院珠江水产研究所、农业农村部渔用药物创制重点实验室、广东省水产动物免疫与绿色养殖重点实验室广东广州510380 农业农村部水产品质量安全控制重点实验室北京100141

【背景】鱼类诺卡氏菌病潜伏期和病程较长,感染率和死亡率较高,给水产养殖业带来较大的经济损失,其病原鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是胞内寄生菌,侵入细胞后引起慢性感染是主要的致病机制。【目的】构建鰤诺卡氏菌侵染大口黑鲈(Micro... 详细信息

【背景】鱼类诺卡氏菌病潜伏期和病程较长,感染率和死亡率较高,给水产养殖业带来较大的经济损失,其病原鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是胞内寄生菌,侵入细胞后引起慢性感染是主要的致病机制。【目的】构建鰤诺卡氏菌侵染大口黑鲈(Micropterus salmoides)头肾巨噬细胞体外模型,观察鰤诺卡氏菌侵染巨噬细胞的过程并探究鰤诺卡氏菌对巨噬细胞的凋亡作用。【方法】采用密度梯度离心法分离巨噬细胞,通过特异性染色和PCR扩增巨噬细胞表达基因mpeg1对细胞进行鉴定,并通过CCK-8法和氧呼吸暴发活性测定检测巨噬细胞的活性;通过倒置荧光显微镜和流式细胞术观察侵染过程中细菌与细胞的形态与数量变化;通过双荧光流式细胞术检测、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放试验及线粒体膜电位检测,探究鰤诺卡氏菌对巨噬细胞的凋亡作用。【结果】从大口黑鲈头肾分离获得纯度高的巨噬细胞,经染色和PCR法鉴定为巨噬细胞;筛选出最优的体外培养条件为1640培养基+1%青霉素链霉素+1%胎牛血清。在脂多糖刺激后,巨噬细胞的氧呼吸暴发能力显著提高(P<0.05)。GFP-鰤诺卡氏菌侵染细胞2 h后细菌被细胞吞噬,4 h细胞变圆且贴壁率降低,6h细菌大量繁殖并包围细胞,8h后细胞大量死亡。凋亡相关实验结果表明,侵染初期巨噬细胞凋亡率增加,LDH释放增加,线粒体膜电位下降;随着侵染时间延长,细胞凋亡率下降、LDH释放量及线粒体膜电位下降减少,说明鰤诺卡氏菌对巨噬细胞起先促进后抑制凋亡的作用。【结论】通过密度梯度离心法成功分离大口黑鲈头肾巨噬细胞,并通过鰤诺卡氏菌侵染细胞后初步摸清鰤诺卡细菌在细胞水平的致病机理,建立了鰤诺卡氏菌侵染大口黑鲈头肾巨噬细胞的体外模型;证实了鰤诺卡氏菌可侵染巨噬细胞并抑制细胞凋亡,从而达到在巨噬细胞内存活,为进一步开展鰤诺卡氏菌与巨噬细胞相互作用并阐明鰤诺卡氏菌的致病机制奠定了研究基础。

关键词：大口黑鲈鰤诺卡氏菌巨噬细胞细胞凋亡

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维氏气单胞菌灭活疫苗对草鱼免疫相关基因表达的影响及其保护效果

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中国生物制品学杂志 2019年第7期32卷 726-731页

作者：任燕时云朵曾伟伟王英英李莹莹常藕琴尹纪元石存斌中国水产科学研究院珠江水产研究所广东省水产动物免疫技术重点实验室农业农村部渔用药物创制重点实验室广东广州510380 四川省水产学校四川成都611730

目的探讨维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,Av)灭活疫苗对草鱼免疫相关基因表达的影响及保护效果。方法采用GZ09007菌株制备Av灭活疫苗,分别通过浸泡和注射两种途径免疫草鱼,同时设对照组(未免疫),于免疫后2、4、7、11、14和21d,经实时... 详细信息

目的探讨维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,Av)灭活疫苗对草鱼免疫相关基因表达的影响及保护效果。方法采用GZ09007菌株制备Av灭活疫苗,分别通过浸泡和注射两种途径免疫草鱼,同时设对照组(未免疫),于免疫后2、4、7、11、14和21d,经实时荧光定量PCR法检测草鱼脾脏、头肾、鳃组织中IgM、IL-1β、C3、C-凝集素及溶菌酶的m RNA表达量;于免疫30 d后用同源菌株进行攻毒,连续观察14d,计算各免疫组的相对保护率(relative percent survival,RPS)。结果 2个免疫组的5个免疫相关基因mRNA表达量均显著高于对照组(P <0. 001),且注射组表达量普遍高于浸泡组,注射组IgM基因较浸泡组更早表达,C3、C-凝集素及溶菌酶基因表达量更高或表达持续时间更长。脾脏中IL-1β和溶菌酶基因表达量达最高值为免疫后14~21d,头肾和鳃组织中5个基因表达量达最高值均为免疫后2~4d,各基因表达量最高值为对照组的1.81~37. 52倍。腹腔注射攻毒14 d后,注射组及浸泡组的RPS分别为66.7%和36.7%。结论Av灭活疫苗免疫草鱼后,可增强脾脏、头肾和鳃组织中IgM、IL-1β、C3、C-凝集素及溶菌酶基因mRNA表达,提高草鱼抗Av感染的能力。

关键词：维氏气单胞菌灭活疫苗实时荧光定量PCR 免疫相关基因免疫保护

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多子小瓜虫感染后草鱼TLR信号通路基因的表达动态

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南方农业学报 2019年第9期50卷 1885-1892页

作者：赵飞谭爱萍孔璐璐刘付翠邓玉婷潘厚军张瑞泉姜兰中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业农村部渔用药物创制重点实验室/广东省水产动物免疫技术重点实验室广州510380 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

【目的】明确草鱼Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号通路基因在防御多子小瓜虫(Ichthyophthiriusmultifiliis)感染过程中的免疫作用,为有效防控鱼类多子小瓜虫感染提供理论参考。【方法】以多子小瓜虫感染草鱼后,采用实时荧光定量... 详细信息

【目的】明确草鱼Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号通路基因在防御多子小瓜虫(Ichthyophthiriusmultifiliis)感染过程中的免疫作用,为有效防控鱼类多子小瓜虫感染提供理论参考。【方法】以多子小瓜虫感染草鱼后,采用实时荧光定量PCR检测分析在不同时间点(感染后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d和7 d)草鱼部分TLRs基因(TLR1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白基因(MyD88和TRIF)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及细胞因子(IL-1β、TNF-α和IFN)在其皮肤和脾脏中的表达动态变化。【结果】草鱼感染多子小瓜虫后,TLR1、TLR2、TLR9、TLR20和TLR21基因在皮肤和脾脏中的表达主要呈上调趋势,TLR4基因在皮肤中主要呈上调表达,在脾脏中则主要呈下调表达;TLR信号通路接头蛋白基因MyD88和TRIF的表达变化趋势明显不同,其中,MyD88基因的表达在感染后第1~3 d均呈显著上调趋势(P<0.05,下同),而TRIF基因的表达在整个试验过程中绝大多数时间点与对照组无显著差异(P>0.05);IRAK4和IRAK1在皮肤和脾脏中的表达也主要呈上调趋势,但在脾脏中IRAK4在感染后第1 d和IRAK1在感染后第6 h的表达呈显著下调趋势;IL-1β和TNF-α在绝大多数时间点均显著上调,但IFN的表达基本没有变化。【结论】草鱼TLR信号通路中的部分TLRs基因(TL1、TLR2、TLR4、TLR9、TLR20和TLR21)、接头蛋白基因(MyD88)、信号转导分子(IRAK4和IRAK1)及下游细胞因子(IL-1β和TNF-α)均参与防御多子小瓜虫感染的免疫反应,尤其是在感染早期和中期发挥关键作用。

关键词：草鱼多子小瓜虫 Toll样受体(TLR) 信号通路基因表达

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大口黑鲈蛙虹彩病毒细胞增殖条件的优化

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中国预防兽医学报 2024年第10期46卷 1026-1033页

作者：刘聪付小哲林强牛银杰罗霞梁红茹马宝福李宁求上海海洋大学水产与生命学院上海201306 中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业农村部渔用药物创制重点实验室/广东省水产动物免疫技术与绿色养殖重点实验室广东广州510385

为优化大口黑鲈蛙虹彩病毒(LMBV)在细胞中的最佳增殖条件,本研究通过测定鳜脑组织细胞系(CPB)和鲤鱼上皮瘤(EPC)细胞系的生长曲线后,分别以不同MOI(1、0.1、0.01)LMBV感染不同初始细胞数量的CPB细胞(2.5×10^(5) 个/mL、4×10^(... 详细信息

为优化大口黑鲈蛙虹彩病毒(LMBV)在细胞中的最佳增殖条件,本研究通过测定鳜脑组织细胞系(CPB)和鲤鱼上皮瘤(EPC)细胞系的生长曲线后,分别以不同MOI(1、0.1、0.01)LMBV感染不同初始细胞数量的CPB细胞(2.5×10^(5) 个/mL、4×10^(5) 个/mL、5×10^(5) 个/mL,根据细胞生长曲线确定为对数生长期及接近该期的细胞数量,后同)和EPC细胞(1×10^(6)个/mL、2×10^(6)个/mL、3×10^(6)个/mL),28℃培养至细胞完全病变,采用荧光定量PCR(qPCR)和Muench-Reed法分别测定病毒拷贝数和病毒滴度(TCID_(50))。结果显示,以MOI 0.1的LMBV感染4×10^(5) 个/mL CPB细胞时病毒产量最高,此时病毒拷贝数为107.4拷贝/μL,病毒滴度为108.75TCID_(50)/mL;以MOI 0.1的LMBV感染1×10^(6)个/mL EPC细胞时病毒产量最高,此时病毒拷贝数为10^(5.8)拷贝/μL,病毒滴度为105.54TCID_(50)/mL。表明CPB细胞更适合LMBV的增殖。为进一步筛选LMBV在CPB细胞中的最佳增殖条件,分别采用异步法接种病毒(初始CPB细胞数量分别为2.5×10^(5) 个/mL、4×10^(5) 个/mL及5×10^(5) 个/mL,LMBV的MOI分别为1、0.1及0.01)和同步接种病毒(初始CPB细胞数量分别为2.5×10^(5) 个/mL、4×10^(5) 个/mL及5×10^(5) 个/mL,FBS含量分别为4%、6%、8%及10%,LMBV的MOI分别为1、0.1及0.01),28℃培养至各组细胞完全病变后,分别采用上述qPCR和Muench-Reed法测定各组细胞中的病毒拷贝数和病毒滴度,比较两种接种方式LMBV的最佳增殖条件。结果显示,采用异步接种病毒时,当初始CPB细胞的数量为4×10^(5) 个/mL、MOI为0.1时LMBV拷贝数和病毒滴度均最高,分别为10^(7.18)拷贝/μL和10^(8.22)TCID_(50)/mL;采用同步接种病毒时,当初始CPB细胞的数量为4×10^(5) 个/mL、FBS含量为8%、MOI为0.1时获得的LMBV拷贝数和滴度均最高,分别为107.54拷贝/μL和10^(8.67)TCID_(50)/mL。上述结果表明,当初始CPB细胞数量为4×10^(5) 个/mL、FBS含量为8%、LMBV的MOI为0.1,并且采用同步接种病毒的方式是LMBV在CPB细胞中的最佳增殖条件。综上,本研究首次筛选到LMBV的易感细胞系,确定了LMBV在CPB细胞中的最佳增殖条件,为LMBV的大量生产及疫苗的研发提供了数据参考及技术指导。

关键词：大口黑鲈蛙虹彩病毒同步接种病毒异步接种病毒

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大口黑鲈弹状病毒Taq Man荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

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中国预防兽医学报 2024年第4期46卷 379-384页

作者：孔明慧梁红茹李宁求林强牛银杰罗霞马宝福付小哲上海海洋大学水产与生命学院上海201306 中国水产科学研究院珠江水产研究所农村农业部渔用药物创制重点实验室/广东省水产动物免疫技术与绿色养殖重点实验室广东广州510380

为建立快速、敏感的大口黑鲈弹状病毒(MSRV)流行株Taq Man荧光定量PCR (qPCR)方法,本研究采用NCBI分析MSRV流行株N基因的保守序列,设计特异性引物和Taq Man探针,以构建的并经PCR和测序鉴定正确的重组质粒标准品p MD18-MSRV-N为模板,通... 详细信息

为建立快速、敏感的大口黑鲈弹状病毒(MSRV)流行株Taq Man荧光定量PCR (qPCR)方法,本研究采用NCBI分析MSRV流行株N基因的保守序列,设计特异性引物和Taq Man探针,以构建的并经PCR和测序鉴定正确的重组质粒标准品p MD18-MSRV-N为模板,通过优化各反应条件初步建立MSRV的Taq Man q PCR检测方法。结果显示,建立的Taq Man q PCR方法标准曲线的R2为0.9906,质粒标准品在6.79×10^(8)拷贝/μL~6.79×10^(2)拷贝/μL范围内与Ct值均存在较好的线性关系。采用该方法检测MSRV及相关病毒,评估该方法的特异性,结果显示,该方法可以特异性检测MSRV,而草鱼出血病病毒、神经坏死病毒、鲤春病毒血症病毒、大口黑鲈双RNA病毒、鳜蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、石斑鱼虹彩病毒、大口黑鲈蛙虹彩病毒等8种常见鱼类病毒检测结果均为阴性;采用建立的方法检测不同浓度的质粒标准品(6.79×10^(8)拷贝/μL~6.79×10^(1)拷贝/μL),评估该方法的敏感性,结果显示,该方法的检测限为6.79×10^(2)拷贝/μL,比文献中的常规PCR方法敏感1 000倍;以不同批次或同一批次提取的不同浓度的质粒标准品作为模板,分别利用该方法检测,评估该方法的重复性,结果显示,该方法批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。采用该方法和文献中的常规PCR同时检测71份临床发病的大口黑鲈、鳜鱼、鲮鱼组织样品,结果显示阳性率为16.9%(12/71),阴性率为83.1%(59/71),且阳性样品均是从发病大口黑鲈的组织样品中检测到,而发病的鳜鱼、鲮鱼组织样品中均未检测到该病毒;常规PCR方法的阳性率为9.9%(7/71),阴性率为90.1%(64/71),二者的总符合率为93.0%。本研究建立的MSRV Taq Man q PCR方法特异性强、敏感性高、重复性和准确性均较好,可用于大口黑鲈临床样品的检测,为MSRV的快速检测提供了可行的技术手段。

关键词：大口黑鲈弹状病毒 Taq Man荧光定量PCR N基因

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加州鲈源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及耐药性分析

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南方农业学报 2021年第2期52卷 465-474页

作者：陈绮梨常藕琴张德峰任燕石存斌中国水产科学研究院珠江水产研究所/农业农村部渔用药物创制重点实验室/广东省水产动物免疫技术重点实验室广州510380 仲恺农业工程学院广州510225

【目的】明确引起佛山市三水某水产种苗有限公司育种基地加州鲈(Micropterus salmonoides)体表出血和溃烂的病原菌,并进行药物敏感性分析,为该病的临床诊断及科学防控提供科学依据。【方法】采用常规细菌分离方法从患病加州鲈的肝脏、... 详细信息

【目的】明确引起佛山市三水某水产种苗有限公司育种基地加州鲈(Micropterus salmonoides)体表出血和溃烂的病原菌,并进行药物敏感性分析,为该病的临床诊断及科学防控提供科学依据。【方法】采用常规细菌分离方法从患病加州鲈的肝脏、脾脏和肾脏等组织中分离病原菌,经革兰氏染色和磷钨酸负染后,使用光学显微镜和透射电子显微镜观察菌体形态及其染色特性;通过ATB Expression生化鉴定仪和Biolog微生物自动鉴定系统进行生理生化特性鉴定,基于16S rRNA序列和gyrB基因序列进行分子生物学鉴定,经人工回归感染试验和组织病理学观察进一步确定病原菌的致病性及其对组织细胞的损伤,同时以K-B纸片扩散法测定其药敏特性。【结果】从患病加州鲈肝脏中分离获得1株优势菌株(180803bj_jzl),为周鞭毛的革兰氏阴性杆菌,Biolog微生物系统自动鉴定其为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)的可能性高达99.4%;基于16S rRNA序列和gyrB基因序列相似性构建的系统发育进化树均显示,分离菌株180803bj_jzl与弗氏柠檬酸杆菌聚类为一支,与GenBank已公布弗氏柠檬酸杆菌参考菌株的16S rRNA序列相似性均在99.00%以上,gyrB基因序列相似性则在91.00%以上。人工回归感染7 d内的累积死亡率达60%,临床症状与自然发病加州鲈的症状基本相同;其肝脏组织中央静脉和肝窦有红细胞淤积,肝细胞质内有大量空泡,呈散在变性坏死;脾脏的白髓与红髓分界不清,脾窦和脾小血管内有嗜铁血红素中心;鳃小片上皮细胞与毛细血管分离,呈球拍状,部分上皮细胞坏死脱落,只残存少量鳃小片骨架。分离菌株180803bj_jzl对氟罗沙星、氧氟沙星、大观霉素、新霉素、庆大霉素、恩诺沙星和诺氟沙星等7种抗菌药物敏感,对多西环素、四环素、乙酰螺旋霉素、罗红霉素、头孢氨苄和阿莫西林等15种抗菌药物已产生耐药性。【结论】弗氏柠檬酸杆菌感染可引起加州鲈体表出血和溃疡,且具有较强的毒力,致使肝脏、脾脏和鳃等组织病理损伤,实际生产中可选用新霉素和恩诺沙星等渔用抗菌药物进行防治。

关键词：加州鲈弗氏柠檬酸杆菌分离鉴定耐药性

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9株鱼源鰤诺卡氏菌生物学特征和致病性比较

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微生物学通报 2021年第8期48卷 2733-2749页

作者：罗愿邓玉婷赵飞谭爱萍张美超姜兰中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室广东广州510380 上海海洋大学水产与生命学院上海201306 农业农村部水产品质量安全控制重点实验室北京100141

【背景】鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是一种革兰氏阳性好氧菌,易引起鲈形目鱼类结节病发生,近几年对大口黑鲈、杂交鳢等名优鱼类的危害越来越大。【目的】比较分析9株不同年份、不同地区患结节病的不同淡水鱼品种分离的鰤诺卡氏菌的... 详细信息

【背景】鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是一种革兰氏阳性好氧菌,易引起鲈形目鱼类结节病发生,近几年对大口黑鲈、杂交鳢等名优鱼类的危害越来越大。【目的】比较分析9株不同年份、不同地区患结节病的不同淡水鱼品种分离的鰤诺卡氏菌的种间同源关系、生长特性、致病性以及药物敏感性差异,为进一步研究制定相应的防控与治疗措施提供基础数据和科学依据。【方法】在9株试验菌生理生化实验鉴定结果基础上,采用16SrRNA基因序列比对、限制性片段长度多样性比较菌株间的同源性;扩增看家基因secA1基因序列进行不同来源菌株种内相似度比对;通过体外培养比较不同菌株的生长情况;人工注射感染分析9株试验菌对大口黑鲈的致病性差异;采用微量肉汤二倍稀释法测试9株试验菌对13种抗菌药物的最小抑菌浓度;运用PCR技术检测菌株携带毒力基因和耐药基因的情况。【结果】生理生化结果显示9株试验菌与鰤诺卡氏菌的基本理化特征相符;9株试验菌聚类分析聚为一类,种内相似度高,限制性片段长度多样性酶切图谱相同,生长特性无明显差异;9株试验菌对大口黑鲈致病性无显著差异,但毒力基因携带情况略有不同,其均携带mce1A、mig和pup基因,而dop和whiB3只在部分菌株检出;9株试验菌均对氟甲喹和氨苄西林耐药,除NS1外,都对磺胺间甲氧嘧啶耐药,对大部分抗菌药物敏感,主要携带blaTEM和sul1耐药基因。【结论】不同时间、不同地区及不同宿主分离的9株鰤诺卡氏菌在生物学特性、致病性和药物敏感性等方面无明显差异;同源性相近,提示华南地区感染淡水鱼的鰤诺卡氏菌可能为同一流行株型。研究结果为鰤诺卡氏菌的发病机制及防控技术的进一步研究奠定了基础。

关键词：鰤诺卡氏菌同源性致病性药物敏感性

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一株鳢源鰤诺卡氏菌致病性与全基因组分析

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微生物学通报 2022年第6期49卷 2193-2211页

作者：张美超邓玉婷赵飞谭爱萍罗愿李东铭姜兰黄志斌中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室广东省水产动物免疫技术重点实验室广东广州510380 上海海洋大学水产与生命学院上海201306 农业农村部水产品质量安全控制重点实验室北京100141

【背景】鰤诺卡氏菌是一种典型的条件致病菌,感染鳢、鲈等多种名优鱼类,易造成存在机体损伤或免疫机能下降的鱼持续性感染,给水产养殖业造成了巨大损失。【目的】了解临床分离鳢源鰤诺卡氏菌对乌斑杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)的致病性,... 详细信息

【背景】鰤诺卡氏菌是一种典型的条件致病菌,感染鳢、鲈等多种名优鱼类,易造成存在机体损伤或免疫机能下降的鱼持续性感染,给水产养殖业造成了巨大损失。【目的】了解临床分离鳢源鰤诺卡氏菌对乌斑杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)的致病性,并从全基因组层面了解该病原菌的基因组和致病因子信息,为鰤诺卡氏菌后续病原学及鰤诺卡氏菌病防治技术和疫苗的开发研究提供有利的数据支撑。【方法】鰤诺卡氏菌NK201610020通过回归感染试验和发病鱼靶器官组织病理分析,了解鰤诺卡氏菌的毒力和病理特征。通过对试验菌进行全基因组测序和比较基因组学分析,挖掘该菌的基因组与毒力特征。【结果】回归感染试验结果显示,除1.5×10^(3)组外,其余5个感染组致死率高达90%,LD_(50)为1.079×10^(3)CFU/mL,说明试验菌毒力较强。组织病理学观察到肝、脾、肾呈现严重的病理损伤,而且有肉芽肿结构形成。试验菌全基因组测序发现,全基因组大小为8294329bp,GC含量为68.10%,共预测到编码基因7812个。比较基因组学分析发现,不同地区不同宿主来源鰤诺卡氏菌在基因组基础特征层面无明显差异,而且一致性在99.9%以上。通过毒力基因数据库比对,预测试验菌全基因组中有171个编码序列可能为毒力基因,其功能主要与细胞壁合成、营养代谢、细菌持续感染相关。【结论】鰤诺卡氏菌毒力强,基因组序列保守,携带多种毒力因子,研究结果为进一步研究鰤诺卡氏菌的致病机制提供了有利的数据支撑。

关键词：鰤诺卡氏菌致病性全基因组分析毒力基因

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鳜弹状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

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中国预防兽医学报 2019年第9期41卷 929-934页

作者：梁红茹蔡秀珠范芷仪林强付小哲刘礼辉黄志斌牛银杰林蠡李宁求中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室/广东省水产动物免疫技术重点实验室广东广州510380 仲恺农业工程学院动物科技学院广东广州570228

为建立快速、准确检测鳜弹状病毒(SCRV)的TaqMan荧光定量PCR方法,本实验根据弹状病毒N基因中的保守序列,设计合成了一对特异性引物和TaqMan探针,以构建的标准质粒为模板,经条件优化后建立了SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并对该方法... 详细信息

为建立快速、准确检测鳜弹状病毒(SCRV)的TaqMan荧光定量PCR方法,本实验根据弹状病毒N基因中的保守序列,设计合成了一对特异性引物和TaqMan探针,以构建的标准质粒为模板,经条件优化后建立了SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验。结果显示,建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法标准曲线的相关系数为0.999,质粒标准品在1×10~8拷贝/μL^1×10~1拷贝/μL范围内有较好的线性关系;该方法可以特异性检测SCRV,但对草鱼出血病病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)、石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、传染性脾肾坏死病(ISKNV)、神经坏死病毒(NNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)等7种常见鱼类病毒检测结果均为阴性;最低可检测到的质粒标准品浓度为102拷贝/μL,比常规PCR方法灵敏100倍;该方法组内与组间变异系数均小于2%。采用该方法对35份临床样品进行检测,结果显示阳性检出率为31%,而普通PCR阳性检出率为14%,该方法检出率比常规PCR高。本研究建立的SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法为SCRV的快速检测提供了可行的技术手段。

关键词：鳜鱼弹状病毒 N基因 TaqMan荧光定量PCR

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鳜蛙病毒及鳜弹状病毒双重PCR检测方法的建立及应用

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中国预防兽医学报 2021年第3期43卷 290-295页

作者：梁红茹黄瑜聪付小哲林强刘礼辉牛银杰黄志斌林蠡李宁求中国水产科学研究院珠江水产研究所农业农村部渔用药物创制重点实验室/广东省水产动物免疫技术重点实验室广东广州510380 仲恺农业工程学院动物科技学院广东广州570228

为建立可以同时检测鳜蛙病毒(SCRIV)和鳜弹状病毒(SCRV)的方法,本研究参考GenBank中登录的SCRIV MCP基因和SCRV N基因序列保守片段分别设计特异性引物,将扩增的MCP基因和N基因分别克隆于pEASY-T1载体,构建重组质粒标准品p-SCRIV和p-SCRV... 详细信息

为建立可以同时检测鳜蛙病毒(SCRIV)和鳜弹状病毒(SCRV)的方法,本研究参考GenBank中登录的SCRIV MCP基因和SCRV N基因序列保守片段分别设计特异性引物,将扩增的MCP基因和N基因分别克隆于pEASY-T1载体,构建重组质粒标准品p-SCRIV和p-SCRV,通过优化退火温度和引物浓度建立了可以同时检测SCRIV(400 bp)和SCRV(280 bp)的双重PCR方法。利用该方法对传染性胰坏死病毒、草鱼呼肠孤病毒、锦鲤疱疹病毒、新加坡石斑鱼虹彩病毒、神经坏死病毒、传染性脾肾坏死病毒、罗非鱼湖病毒及鲤春病毒血症病毒等鱼类常见病毒均无扩增条带,而仅对SCRIV和SCRV有特异性扩增条带,特异性较强;该方法对p-SCRIV的检测下限是1 000拷贝/μL,对p-SCRV检测下限是430拷贝/μL,敏感性较高。对21份临床样品的检测结果表明该双重PCR方法的扩增结果与单一PCR扩增结果一致,二者的符合率为100%。本研究建立的双重PCR检测方法特异性较强,敏感性较高,可以用于上述两种病毒的快速鉴别检测和分子流行病学调查。

关键词：鳜蛙病毒鳜弹状病毒双重PCR

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