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国际医学寄生虫病杂志 2008年第2期35卷 82-86页

作者：武松汤林华 200025 上海中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室 230038 合肥安徽中医学院中西医结合临床学院中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室上海200025

多斑按蚊复合体主要分布于东南亚,其中的部分成员种是马来西亚、泰国、老挝和我国云南等地传疟媒介.该文对多斑按蚊复合体的形态与分子鉴别、地理分布、生态习性与传疟作用等方面进行了综述.

关键词：多斑按蚊生态习性分子生物学

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实时荧光定量PCR测定瑞香素类抗疟化合物对恶性疟原虫核糖核酸还原酶基因表达的影响

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中国病原生物学杂志 2008年第4期3卷 288-291页

作者：黄芳汤林华陈博周水森王琴美中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室上海200025 复旦大学生命科学学院遗传系上海200433

目的测定瑞香素类抗疟化合物对恶性疟原虫核糖核酸还原酶（RNR）基因表达的影响。方法体外同步培养的恶性疟原虫经瑞香素及其衍生物DA78与DA79作用后,抽提总RNA,并合成相应的特异性引物,运用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）... 详细信息

目的测定瑞香素类抗疟化合物对恶性疟原虫核糖核酸还原酶（RNR）基因表达的影响。方法体外同步培养的恶性疟原虫经瑞香素及其衍生物DA78与DA79作用后,抽提总RNA,并合成相应的特异性引物,运用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）测定瑞香素类抗疟化合物对恶性疟原虫RNR基因表达的影响。结果恶性疟原虫体外经瑞香素及其衍生物作用后的RNR基因扩增标准曲线在10^5～10^9拷贝（copies）/ml范围内呈良好的线性关系,R^2为0.997 52;瑞香素及其衍生物DA78与DA79对恶性疟原虫RNR作用后,其原始拷贝数分别为81 173.23、124 830.83和74 801.35,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.01）,而瑞香素的铁螯合能力被饱和后,对该基因的表达未产生显著抑制（P〉0.01）。结论瑞香素类抗疟化合物体外抑制恶性疟原虫RNR的基因表达,RNR可能作为瑞香素类抗疟化合物抗疟作用的候选靶分子之一。

关键词：瑞香素疟原虫,恶性核糖核酸还原酶实时荧光定量聚合酶链反应

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日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因的克隆、表达及各虫期转录和表达情况的研究

日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因的克隆、表达及各虫期转录和...

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全国寄生虫学与热带医学学术研讨会

作者：孔娟冯正徐斌邓王平鞠川胡薇中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室华东理工大学生物工程学院

目的克隆和表达日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因1(SjAPRT1),并研究该基因在各虫期转录和蛋白表达情况。方法根据文献报道的SjAPRT1序列(GenBank Accesion:AAW24796)设计引物,RT-PCR扩增目的基因,分析其在日本血吸虫各虫期转录本差... 详细信息

目的克隆和表达日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因1(SjAPRT1),并研究该基因在各虫期转录和蛋白表达情况。方法根据文献报道的SjAPRT1序列(GenBank Accesion:AAW24796)设计引物,RT-PCR扩增目的基因,分析其在日本血吸虫各虫期转录本差异。将目的基因亚克隆至载体pET28a,转化至大肠埃希菌BL21菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。纯化的蛋白免疫小鼠和家兔,Western blotting分析其免疫反应性及在各虫期蛋白表达差异。结果 RT-PCR扩增结果显示在虫卵、尾蚴、童虫和成虫均检测到SjAPRT1基因转录本(561bp),SjAPRT1基因亚克隆入pET28a并得到表达。Western blotting分析结果表明纯化的重组蛋白SjAPRT1可被日本血吸虫感染兔血清识别,各虫期中只有成虫蛋白可被SjAPRT1多抗兔血清识别,在Mr25 000处有特异性条带出现。结论日本血吸虫SjAPRT1基因在体外获得表达,并在日本血吸虫虫卵、尾蚴、童虫和成虫中均发现SjAPRT1基因转录本,但只在日本血吸虫成虫中检测到目的蛋白。其表达蛋白具有一定的抗原性,它有可能成为日本血吸虫疫苗的候选抗原和具有良好的免疫诊断价值。

关键词：日本血吸虫腺嘌呤磷酸核糖转移酶转录本抗原性

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巢式PCR鉴定上海一株牛源牛隐孢子虫

巢式PCR鉴定上海一株牛源牛隐孢子虫

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全国寄生虫学与热带医学学术研讨会

作者：袁忠英刘晖沈玉娟陈盛霞曹建平中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心遵义医学院寄生虫学教研室江苏大学医学技术学院

隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是一种以腹泻为主要症状的全球性的人兽共患原虫病,是世界六大腹泻病之一,在寄生虫性腹泻中占首位,病例遍及6大洲90多个国家,但目前该病仍无有效的预防和治疗药物。本实验用改良抗酸染色法检查牛粪,鉴定... 详细信息

隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是一种以腹泻为主要症状的全球性的人兽共患原虫病,是世界六大腹泻病之一,在寄生虫性腹泻中占首位,病例遍及6大洲90多个国家,但目前该病仍无有效的预防和治疗药物。本实验用改良抗酸染色法检查牛粪,鉴定为含有隐孢子虫卵囊,油镜下观察卵囊形态,并随机测量50个卵囊大小。用美国Genmed公司粪便DNA分离+高质纯化试剂盒,按其说明书提取卵囊基因组DNA。以隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板,根据隐孢子虫18S rRNA序列设计2对引物,巢式PCR扩增。扩增产物测序后登陆NCBI BLAST进行同源性比对和搜索,下载相关序列,利用Clustal X软件对测得序列与相应下载的序列进行比对,然后用MEGA4.0软件中的邻接法(neighbour-joiningmethod,NJ)构建系统发育树,用自展值检验(Bootstrap test)估计所建系统发育树的可靠性,重复次数为1 000。结果 :上海株牛源隐孢子虫卵囊呈圆形或椭圆形,大小为(5.6±0.49)μm×(5.2±0.51)μm。扩增出的18S rRNA基因片段为812bp。由此序列构建的系统发育树显示,上海株牛源隐孢子虫与巴西牛隐孢子虫(Cryptospridium bovis)序列一致性为100%,二者在种系发育树上为同一分支,亲缘关系最近;与中国青海、蒙古、美国、突尼斯等地的牛隐孢子虫序列一致性均为99%。结果提示上海株牛源隐孢子虫为牛隐孢子虫(***)。

关键词：牛隐孢子虫 PCR 序列一致性

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巢式PCR-RFLP分析两株牛源隐孢子虫

巢式PCR-RFLP分析两株牛源隐孢子虫

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全国寄生虫学与热带医学学术研讨会

作者：刘晖袁忠英沈玉娟冯耀宇曹建平遵义医学院寄生虫学教研室中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室世界卫生组织疟疾、血吸虫病和丝虫病合作中心华东理工大学资源与环境工程学院

隐孢子虫(Cryptospridium spp.)是一种能引起人、畜和野生动物感染的肠道原虫,是儿童和免疫缺陷者腹泻的重要病原,动物与人之间可相互感染,并可通过食物和水源引起爆发流行。隐孢子虫基因分析是分类学研究的重要手段,可以鉴定基因型或...

隐孢子虫(Cryptospridium spp.)是一种能引起人、畜和野生动物感染的肠道原虫,是儿童和免疫缺陷者腹泻的重要病原,动物与人之间可相互感染,并可通过食物和水源引起爆发流行。隐孢子虫基因分析是分类学研究的重要手段,可以鉴定基因型或发现隐种。本实验通过18S rRNA巢式聚合酶链反应(Nested PCR)-限制片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析鉴定上海(SH-BOV)和徐州(XZ-BOV)两株牛源隐孢子虫虫种/基因型。

关键词：

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日本血吸虫金属蛋白酶基因的克隆和表达及其对小鼠的免疫保护性研究

日本血吸虫金属蛋白酶基因的克隆和表达及其对小鼠的免疫保护性研...

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全国寄生虫学与热带医学学术研讨会

作者：徐斌冯正鞠川许学年莫筱谨邓王平孔娟胡薇中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所世界卫生组织疟疾、血吸虫和丝虫病合作中心卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室华中师范大学昆虫学研究所华东理工大学生物工程学院

目的克隆和表达日本血吸虫金属蛋白酶(metalloprotease)编码基因并纯化表达产物,观察其在成虫体内定位及在小鼠的免疫试验。方法根据表达序列标签(EST)测序的结果设计引物,从含有金属蛋白酶基因的日本血吸虫cDNA克隆(SJM2CFB04,简称SjB... 详细信息

目的克隆和表达日本血吸虫金属蛋白酶(metalloprotease)编码基因并纯化表达产物,观察其在成虫体内定位及在小鼠的免疫试验。方法根据表达序列标签(EST)测序的结果设计引物,从含有金属蛋白酶基因的日本血吸虫cDNA克隆(SJM2CFB04,简称SjB04)中扩增得到该编码基因片段,亚克隆至原核表达载体pET28a中表达,应用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物,蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫原性。应用间接免疫荧光法,观察金属蛋白酶在血吸虫成虫体内的分布。将18只C57BC/6分成两组,实验组用25μg SjB04重组蛋白免疫小鼠,共3次,每次间隔2周;对照组用同剂量的佐剂免疫。第三次免疫后2周,每鼠腹部感染40±2条尾蚴,攻击后第37天起连续收集6 d小鼠粪便,计算每克粪虫卵数和减卵率;第42天剖杀小鼠,门静脉灌注收集成虫并计算减虫率。结果获得了SjB04基因(ORF528 bp)的编码序列,成功构建了原核表达载体,并在大肠埃希菌中表达,经组氨酸标签亲和层析法获得纯化重组蛋白SjB04。免疫荧光法检测结果显示,SjB04主要定位于日本血吸虫成虫的肠管表皮。Western blotting分析结果显示,该纯化重组蛋白SjB04能被感染兔血清和免疫兔血清识别,在相对分子质量(Mr)29 800处出现一清晰条带。用该纯化蛋白免疫C57BC/6小鼠后,减虫率为27.1%,粪减卵率为57.8%。结论克隆获得的日本血吸虫SjB04重组蛋白主要定位于日本血吸虫成虫的肠管表皮,该蛋白对日本血吸虫感染的C57BC/6小鼠可明显减少粪卵排出量。

关键词：日本血吸虫金属蛋白酶免疫保护力

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恶性疟原虫裂殖子表面蛋白MSP1-42基因的合成及其表达

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国际医学寄生虫病杂志 2008年第3期35卷 124-127页

作者：陈勤梁婉琪钱炳俊曹建平徐馀信张大兵汤林华 200025上海中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室世界卫生组织疟疾、血吸虫和丝虫病合作中心上海交通大学-中科院上海生命科学研究院-美国宾州州立大学生命科学联合研究中心上海200240

目的利用大肠杆菌表达系统表达可溶性的恶性疟原虫(3D7株)裂殖子表面蛋白1C末端MSP1-42蛋白.方法采用两步PCR法拼接合成全长msp1-42基因,将测序正确的msp1-42基因构建至pET32a(+)表达载体,获得pET32amsp表达质粒,热激转化至宿主菌Rose... 详细信息

目的利用大肠杆菌表达系统表达可溶性的恶性疟原虫(3D7株)裂殖子表面蛋白1C末端MSP1-42蛋白.方法采用两步PCR法拼接合成全长msp1-42基因,将测序正确的msp1-42基因构建至pET32a(+)表达载体,获得pET32amsp表达质粒,热激转化至宿主菌Rosetta gami(DE3)中进行诱导表达,用免疫印迹法检测表达产物.结果全合成了恶性疟原虫3D7株msp1-42基因,合成基因在Rosetta gami(DE3)中以可溶性形式高水平表达,所表达的重组蛋白能与识别MSP1-19构象表位的单克隆抗体mAb5.9、PfCP2.9兔血清及恶性疟患者血清发生免疫反应.结论合成的msp1-42基因能在大肠杆菌表达系统中以可溶性的形式表达,所表达的重组蛋白MSP1-42具有抗原性.

关键词：恶性疟原虫基因合成裂殖子表面蛋白1 大肠杆菌

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多重PCR技术检测恶性疟原虫抗药性相关分子标志的方法研究

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2007年第6期25卷 451-456页

作者：张国庆汤林华官亚宜周水森郑彬黄芳武松刘燕中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室世界卫生组织疟疾血吸虫病和丝虫病合作中心上海200025

目的建立恶性疟原虫5个主要抗药性相关基因的单管多重PCR扩增方法,用于恶性疟原虫抗药性分子标志检测。方法依据各基因参考序列,运用Primer Premier 5.0和Oligo6.0软件,设计5对特异性引物,采用Hot Start Taq DNA聚合酶,设置递增延伸温度... 详细信息

目的建立恶性疟原虫5个主要抗药性相关基因的单管多重PCR扩增方法,用于恶性疟原虫抗药性分子标志检测。方法依据各基因参考序列,运用Primer Premier 5.0和Oligo6.0软件,设计5对特异性引物,采用Hot Start Taq DNA聚合酶,设置递增延伸温度,对恶性疟原虫标准株(3D7、Dd2和HB3)、分离株(FCC1/HN、CMH/YN)、现场标本(来源于海南、云南和缅甸)、近缘虫种对照(间日疟原虫、伯氏疟原虫、食蟹猴疟原虫、杜氏利什曼原虫和牛源隐孢子虫)和空白对照(以H2O为模板)进行5个抗药性相关基因(包括恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因Pfcrt、多药抗性基因Pfmdr1、二氢喋酸合成酶基因Pfdhps、二氢叶酸还原酶基因Pfdhfr和三磷酸腺苷酶第6亚基基因PfATPase6)的单管多重PCR扩增,2%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果,测定扩增产物序列,并与参考序列(3D7株)比对。结果经电泳,恶性疟原虫标准株、分离株和现场标本的多重PCR扩增产物均可见5条目标条带。测序结果与参考序列比对,高度同源,最低同源性为98.5%。模板DNA量达0.1ng即满足扩增要求,近缘虫种对照和空白对照未见扩增产物。结论多重PCR技术实现了单管1次反应完成5个抗药性相关基因的扩增,该方法灵敏,特异性好,有助于提高恶性疟原虫抗药性分子标志的检测效率。

关键词：恶性疟原虫药物抗性单核苷酸多态性多重PCR

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安氏隐孢子虫热休克蛋白编码基因的克隆、表达和分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2007年第3期25卷 163-170页

作者：刘海鹏曹建平李小红卢潍媛沈玉娟徐馀信臧炜刘述先中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室世界卫生组织疟疾血吸虫病和丝虫病合作中心上海200025

目的克隆、表达和分析安氏隐孢子虫Mr70000热休克蛋白(CaHSP70)的部分编码基因。方法依据公布的CaHSP70基因序列设计引物,以江苏徐州安氏隐孢子虫(XZ-BOV)总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增目的编码基因。PCR产物经TA克隆后,亚克隆入pE... 详细信息

目的克隆、表达和分析安氏隐孢子虫Mr70000热休克蛋白(CaHSP70)的部分编码基因。方法依据公布的CaHSP70基因序列设计引物,以江苏徐州安氏隐孢子虫(XZ-BOV)总RNA为模板,反转录PCR(RT-PCR)扩增目的编码基因。PCR产物经TA克隆后,亚克隆入pET28a原核表达载体,构建重组质粒pET28a-CaHSP70,转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并获得纯化的重组蛋白(简称为rCaHSP70)。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹(Western blotting)和ELISA对该重组蛋白进行分析和鉴定。采用相关生物信息学软件对序列进行分析。结果根据克隆的目的基因序列推导的氨基酸序列与GenBank登录的CaHSP70一致。SDS-PAGE和Western blotting分析显示,重组蛋白(rCaHSP70)Mr约为43000(含6个组氨酸),以包涵体的形式存在,可被辣根过氧化物酶标记的抗组氨酸抗体、安氏隐孢子虫感染的小鼠血清、微小隐孢子虫感染的儿童血清和rCaHSP70免疫小鼠血清识别。rCaHSP70存在多个功能位点和潜在的抗原决定簇。种系发生分析表明XZ-BOV与安氏隐孢子虫进化关系最近。ELISA检测结果表明,rCaHSP70免疫的C57BL/6小鼠与BALB/c小鼠血清特异性抗体滴度均显著高于免疫前。结论XZ-BOVHSP70部分编码基因的克隆获得成功,研究获得的重组蛋白具有一定的免疫原性和免疫反应性。

关键词：安氏隐孢子虫热休克蛋白重组抗原表位分析

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卫氏并殖吸虫感染循环抗原检测方法的建立与应用

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2007年第6期25卷 513-515页

作者：陈韶红李浩周晓农中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所卫生部寄生虫病原与媒介生物学重点实验室世界卫生组织疟疾血吸虫病和丝虫病合作中心上海200025

用CAg-dot-ELISA法和CAb-ELISA法分别对并殖吸虫病临床诊断患者、并殖吸虫病流行区人群、卫氏并殖吸虫早期感染者及其他寄生虫感染者进行循环抗原和抗体检测。用CAg-dot-ELISA检测70份卫氏并殖吸虫病临床诊断患者血清,阳性29份,敏感性为... 详细信息

用CAg-dot-ELISA法和CAb-ELISA法分别对并殖吸虫病临床诊断患者、并殖吸虫病流行区人群、卫氏并殖吸虫早期感染者及其他寄生虫感染者进行循环抗原和抗体检测。用CAg-dot-ELISA检测70份卫氏并殖吸虫病临床诊断患者血清,阳性29份,敏感性为41.5%(29/70),与华支睾吸虫病和日本血吸虫病患者血清分别有25%(5/20)和20%(4/20)的交叉反应,与其他寄生虫感染者血清和健康人血清(60份)均为阴性,特异性为93.6%。CAb-ELISA检测70例卫氏并殖吸虫病临床诊断患者血清阳性67份,敏感性为95.7%(67/70),与华支睾吸虫病和日本血吸虫病患者血清分别有25%(5/20)和20%(4/20)的交叉反应,对其他寄生虫感染者血清和健康人血清的特异性为92.1%。CAg-dot-ELISA和CAb-ELISA分别检测并殖吸虫病流行区人群220份血清,阳性率分别为0和3.2%(7/220)。CAg-dot-ELISA法对辅助诊断并殖吸虫早期感染有一定价值。

关键词：卫氏并殖吸虫多克隆抗体循环抗原 ELISA dot-ELISA

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