在基于液相色谱-质谱联用的蛋白质组学定量方法中,基于等重多肽末端标记的定量方法由于不增加一级谱的复杂度,并且具有碎片离子特异性高、定量准确度高、动态范围宽等优点,日益受到人们的重视[1]。尽管如此,由于不同标记的肽段在质谱中同时碎裂,增加了谱图的复杂度,容易造成误匹配,因而不利于多肽和蛋白质的鉴定。为此,我们发展了一种基于成对碎片离子(Paired Ion based Scoring Algorithm。PISA)的打分算法,以提高蛋白质鉴定和定量的数目。在等重多肽末端标记实验中,来自不同样品肽段的N端和C端分别使用含有不同同位素的试剂进行标记,使得其摩尔质量相同,从而可以在质谱中同时碎裂。因此在二级质谱图中,带有不同标记的多肽碎片离子成对存在。在PISA算法中,对于候选肽段,首先计算其理论碎片离子,然后与实验质谱图进行匹配。对于某一理论碎片离子,只有其轻/重标记的形式都能在实验质谱图中得到匹配,才认为该离子得到匹配。以匹配到的碎片离子数目加上匹配到碎片离子总强度占实验质谱图所有离子总强度的比例作为候选肽段的的分值,进行多肽的搜索和鉴定。然后以小鼠淋巴道转移肝癌细胞株蛋白质Lys-C酶解产物为样品,对其使用含有不同同位素甲醛进行等重标记后,使用PISA及其它商品化和开源软件进行分析。结果表明,与商业化软件Mascot以及开源软件Morpheus相比,在1%的假阳性率下,PISA可以鉴定到更多的谱图、唯一性肽段以及蛋白质,提高的比例在30%-177%之间。PISA算法鉴定数目较高的主要原因是由于采用成对碎片离子作为丰度特征,降低了碎片离子的误匹配概率。除了上述优点,PISA算法在定性时以成对碎片离子对肽段进行打分,因此可以方便地通过对这些成对碎片离子的强度进行比较而得到定量结果,[因此可以同时实现高可信度定性和定量。最后,由于每一个得到鉴定的谱图都含有数对碎片离子,因此定量的覆盖率达到100%。我们进一步将该方法应用于小鼠肝癌高低转移细胞株蛋白表达差异分析。在一维色谱分离条件下,总共鉴定到820个蛋白,发现4个蛋白(主要是纤维蛋白原)和6个蛋白质(主要是组蛋白)在高转移细胞株中上调和下调。综上所述,我们发展了一种基于成对碎片离子打分和对等重多肽末端标记的蛋白质组同时定性和定量新算法,并通过对实际复杂蛋白质样品的鉴定和定量评价其性能。由于采用成对碎片离子作为丰度特征,降低了碎片离子的误匹配概率,蛋白质鉴定和定量数目优于其它软件。
脂质是一类重要的代谢物,参与能量动态平衡,构筑细胞膜,信号转导等诸多生命过程。脂质组学（Lipidomics）是基于质谱技术的研究脂质代谢的有力手段。然而大部分的脂质组学只能获取"快照式（snapshot）"的静态脂质代谢指纹,无法对脂质代谢的动态过程（如合成、转化、降解等）进行深入研究。将稳定同位素标记的前体分子引入实验体系中,可帮助捕获脂质动态代谢信息。经典方法有气相色谱-同位素比例质谱（gas-chromatography-isotope ratio mass spectrometry,GC-IRMS）、基于气相色谱-质谱联用（gas-chromatography mass spectrometry,GC-MS）的质量同位素异构体分布分析（mass isotopomer distribution analysis。MIDA）。上述方法样品预处理复杂,且无法实现分子水平上的MID分析。相反,基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）结合二级质谱（MS/MS）可提高分子特异性。目前有报道,通过LC-MS测定胆固醇酯、磷脂、三酰甘油、鞘脂或酯酰辅酶A等脂质库对稳定同位素前体的吸收,来研究干预下的脂质代谢应答。然而,这些研究只关注少数脂质。鉴于此,我们发展并评价了一种基于稳定同位素标记辅助的脂质组学,并结合非靶向的同位素异构体（isotopomer）筛选的新型策略,以实现对脂质代谢网络的动态过程研究。该策略首先通过细胞培养等方式引入稳定同位素标记的脂质合成前体分子;脂质提取物用超高效液相色谱-高分辨质谱联用以全扫描形式进行脂质组学数据采集;随后对采集的质谱信息以非靶向模式进行同位素异构体的筛选和匹配,检测尽可能多的标记脂质,并获取该标记脂质的相关同位素异构体组成信息。通过计算[C+C]和[C/(C+C)],同时得到脂质代谢指纹（等同于常规的脂质组学）和与动态过程相关联的标记信息。我们发展了相应的自动化程序以辅助该质谱数据的解析过程。在用C全标记棕榈酸([U-C]-palmitate)培养的人类骨骼肌细胞中,我们在>7000离子中检测到692个脂质同位素异构体离子,归属于203个脂质分子,覆盖磷脂酰胆碱（PC）,溶血磷脂酰胆碱（LPC）,磷脂酰乙醇胺（PE）,溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）,磷脂酰丝氨酸（PS）,磷脂酰肌醇（PI）,神经酰胺（Cer）,二氢神经酰胺（dHCer）,已糖苷神经酰胺（HexCer）,鞘磷脂（SM）,二酰甘油（DG）,三酰甘油（TG）共12类脂质。基于稳定同位素标记的MS/MS,有助于确定标记位置,研究合成来源,辅助验证结构鉴定和同位素异构体的匹配。对QC（quality contro1）样本的考察表明该方法稳健可靠重复性好,变异系数（CV）中值在所有脂质的水平([C+C]),和标记脂质的标记比例(C/[C+C])中分别为6.91%和3.74%.该策略成功应用于人类骨骼肌细胞在脂毒性环境下的脂质代谢研究。通过构建包含动态过程的脂质代谢网络,揭示了不同脂质对于过量[U-C]-pahnitate造成的脂毒性下的动态代谢应答过程。综上,我们发展了一种基于稳定同位素标记辅助的脂质组学,并结合非靶向的同位素异构体（isotopomer）筛选的新型策略,在获得静态脂质代谢指纹的同时,可以捕获包含其中的动态代谢过程。该方法具有高度的分子特异性和广泛的网络覆盖能力,方法重复、稳健、可靠,为深入研究脂质代谢开辟了新思路,以期对生物体系的病理生理过程、代谢扰动获得更深刻全面的理解。
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