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Si-GATA-3对AR小鼠PBMCs中Th1/Th2细胞亚群功能的体外调节

昆明医科大学学报 2022年第8期43卷 7-16页

作者：李玉晓贺铭王天蓉姚永刚王雨昆明医科大学第一附属医院耳鼻咽喉头颈外科云南昆明650032 昆明医科大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室云南昆明650500 中国科学院昆明动物研究所动物模型与人类疾病机理重点实验室云南昆明650223 中山大学附属第七医院耳鼻咽喉科广东深圳517108

目的研究RNAi介导的GATA-3基因慢病毒载体si-GATA-3在体外对变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)小鼠PBMCs中Th2、Th1细胞亚群功能的调节作用。方法构建RNAi介导的GATA-3基因慢病毒载体siGATA-3,并进行包装、纯化和滴定。BALB/C小鼠随机分... 详细信息

目的研究RNAi介导的GATA-3基因慢病毒载体si-GATA-3在体外对变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)小鼠PBMCs中Th2、Th1细胞亚群功能的调节作用。方法构建RNAi介导的GATA-3基因慢病毒载体siGATA-3,并进行包装、纯化和滴定。BALB/C小鼠随机分为AR组和正常对照组。用卵蛋白构建BALB/C小鼠变应性鼻炎模型,抽取其外周血并分离外周血中单个核细胞(PBMCs),随机分为3组,即si-GATA-3组、siNC组和AR组。进行细胞培养,然后分别用si-GATA-3、si-NC和生理盐水对3组变应性鼻炎小鼠的PBMCs进行干预72 h,用生理盐水代替si-GATA-3干预正常对照组小鼠的PBMCs。干预结束分离PBMCs和细胞培养上清液。分别用荧光定量qPCR和Western bloting方法检测PBMCs中GATA-3 mRNA、T-bet mRNA和GATA3、T-bet蛋白的相对表达量;用ELISA技术检测细胞培养上清液中IL-4和IFN-γ的含量。结果构建出RNAi介导的GATA-3基因慢病毒载体si-GATA-3,其滴度为5×10^(8) TU/mL。制备出BALB/C小鼠的AR模型。Si-GATA-3组PBMCs中GATA-3 mRNA、GATA-3蛋白的相对表达量和上清液中IL-4的含量均明显低于AR组和si-NC组的表达量(P<0.01),AR组和si-NC组中3者的表达量均明显高于正常对照组(P<0.01);AR组3者表达量和si-NC组无差异(P>0.05)。si-GATA-3组PBMCs中T-bet mRNA及其蛋白的相对表达量明显高于AR组和si-NC组的表达量(P<0.01),AR组和si-NC组中二者的表达量均明显低于对照组(P<0.01);AR组的二者表达量和si-NC组无差异(P>0.05)。但si-GATA-3组细胞培养上清液中IFN-γ的含量高于正常对照组(P<0.05),AR组与si-NC组中IFN-γ明显高于正常对照组和si-GATA-3组(P<0.01);AR组与si-NC组之间IFN-γ的表达,差异无统计学意义(P>0.05)。结论si-GATA-3能有效的下调Th2细胞中GATA-3 mRNA、GATA-3蛋白和IL-4的表达,并上调Th1细胞中T-bet mRNA和T-bet蛋白的表达,体外能有效地纠正小鼠AR模型中PBMCs中Th2/Th1的免疫失衡。

关键词：鼻炎变应性 RNA干扰 GATA-3 T-bet 慢病毒载体模型小鼠

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碳离子辐照对神经胶质瘤干细胞杀伤的研究

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原子核物理评论 2017年第2期34卷 231-235页

作者：孙放张栩锐赵旭东周光明王菊芳中国科学院近代物理研究所空间辐射生物学实验室兰州730000 中国科学院大学北京100049 中国科学院昆明动物研究所动物模型与人类疾病机理重点实验室昆明650223

虽然重离子束治癌已经被证明有着射程精确、入口坪区剂量小、相对生物学效应高等显著优点,但重离子辐照对肿瘤干细胞所产生的辐射生物学效应特性依旧不明确。本研究使用人源神经胶质瘤干细胞来研究在面对肿瘤干细胞时,重离子相对于传统... 详细信息

虽然重离子束治癌已经被证明有着射程精确、入口坪区剂量小、相对生物学效应高等显著优点,但重离子辐照对肿瘤干细胞所产生的辐射生物学效应特性依旧不明确。本研究使用人源神经胶质瘤干细胞来研究在面对肿瘤干细胞时,重离子相对于传统X射线是否有明显的生物学优势。实验结果证明,在神经胶质瘤干细胞中,2 Gy碳离子造成的DNA损伤的修复率比X射线造成的损伤修复率要低;MTT实验则证明经过碳离子辐照的肿瘤干细胞活力要比X射线辐照的肿瘤干细胞低得多。综上所述,面对神经胶质瘤干细胞,碳离子能更有效地靶向肿瘤干细胞从而相对于传统X射线有明显的生物学优势。这些发现对于更好地理解重离子束治癌相关的生物学效应有重要的作用。

关键词：重离子辐照肿瘤干细胞神经胶质瘤

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树鼩IL-2全长编码序列的克隆及分子特征分析

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Zoological Research 2013年第2期34卷 121-126页

作者：黄晓燕李明利徐娟高跃东王文广殷安国李晓飞孙晓梅夏雪山代解杰中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 中国科学院昆明动物研究所动物模型与人类疾病机理重点实验室:免疫生物学实验室云南昆明650223 中国科学院昆明生物多样性大型仪器区域中心云南昆明650223 中国科学院昆明动物研究所遗传资源与进化国家重点实验室云南昆明650223 昆明理工大学生命科学与技术学院云南昆明650500

树鼩作为多种人类疾病模型已受到广泛关注,而免疫因子对于树鼩模型评价至关重要,但目前对其白细胞介素-2(IL-2)的研究鲜有报道。该实验以经ConA(concanavalin)诱导培养的树鼩淋巴细胞总RNA为模板,RT-PCR克隆出465bp的树鼩IL-2全长编码序... 详细信息

树鼩作为多种人类疾病模型已受到广泛关注,而免疫因子对于树鼩模型评价至关重要,但目前对其白细胞介素-2(IL-2)的研究鲜有报道。该实验以经ConA(concanavalin)诱导培养的树鼩淋巴细胞总RNA为模板,RT-PCR克隆出465bp的树鼩IL-2全长编码序列,并采用ClustalW软件分析其序列和分子特征。结果表明树鼩IL-2cDNA编码一个由154个氨基酸组成的蛋白质,其cDNA及氨基酸序列与人的同源性分别为93%及80%,且其整体结构与人IL-2相似。MEGA5.0软件构建的进化树表明,树鼩与人及恒河猴的亲缘关系较近。Pymol软件对树鼩和人IL-2氨基酸序列进行的三维结构模建表明,两者的IL-2分子三维空间结构基本相似,表面大部分区域所带电荷相同,但在某些区域差异较大,且树鼩多出一个糖基化位点,这些差异对抗体的结合可能存在影响。该研究为今后树鼩IL-2单克隆抗体的制备及功能研究奠定了基础。

关键词：树鼩 IL-2 克隆结构功能

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树鼩CD4全长编码序列的克隆及分子特征分析

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Zoological Research 2012年第1期33卷 60-66页

作者：田巍威高跃东郭彦黄京飞肖昌李作生张华堂西南大学生物技术学院重庆北碚400715 云南沃森生物技术股份有限公司云南昆明650106 中国科学院昆明动物研究所动物模型与人类疾病机理重点实验室免疫生物学实验室云南昆明650223 中国科学院昆明生物多样性大型仪器区域中心云南昆明650223 中国科学院昆明动物研究所遗传资源与进化国家重点实验室云南昆明650223

树鼩作为多种人类疾病研究模型的可能性已受到广泛关注,但尚缺乏研究其免疫功能的基本标志以及单克隆抗体。该实验首先以树鼩外周血总RNA为材料,通过RT-PCR扩增得到长度为1365bp的树鼩CD4全长编码序列,并确定了数据库中缺失的两个片段,... 详细信息

树鼩作为多种人类疾病研究模型的可能性已受到广泛关注,但尚缺乏研究其免疫功能的基本标志以及单克隆抗体。该实验首先以树鼩外周血总RNA为材料,通过RT-PCR扩增得到长度为1365bp的树鼩CD4全长编码序列,并确定了数据库中缺失的两个片段,进而通过ClustalW等软件对其序列和分子特征进行分析,发现树鼩CD4氨基酸序列胞外和胞内域保守性较好,且与人类和猴的亲缘关系较近。虽然树鼩和人CD4分子表面大部分区域均带正电荷,但与人CD4胞外域D1相比,树鼩CD4D1结构区域表面带负电荷较多,且多出两个N-糖基化位点。这些差异对抗体的结合可能存在影响。该研究为今后树鼩CD4单克隆抗体制备及功能研究奠定了基础。

关键词：树鼩 CD4分子 RT-PCR 结构功能单克隆抗体

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树鼩CD127全长编码序列的克隆及分子特征分析

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国际免疫学杂志 2012年第4期35卷 293-298页

作者：田巍威高跃东郭彦黄京飞肖昌李作生张华堂西南大学生物技术学院重庆400715 中国科学院昆明生物多样性大型仪器区域中心中国科学院昆明动物研究所遗传资源与进化国家重点实验室 650223 中国科学院昆明动物研究所动物模型与人类疾病机理重点实验室免疫生物学实验室 650223 成都军区疾病预防控制中心昆明650223

目的树鼩可作为多种人类疾病研究的良好模型，但其免疫系统各类细胞表面标志、功能以及在疾病发生、发展过程中的作用和意义尚无系统研究。研究以获得树购调节性T细胞（Tr）相关分子CD127为目的，以分析其分子特征。方法提取树胸外周血... 详细信息

目的树鼩可作为多种人类疾病研究的良好模型，但其免疫系统各类细胞表面标志、功能以及在疾病发生、发展过程中的作用和意义尚无系统研究。研究以获得树购调节性T细胞（Tr）相关分子CD127为目的，以分析其分子特征。方法提取树胸外周血总RNA反转录，经巢式PCR扩增获得目的片段，进而以DiscoveryStudio等生物软件进行分析。结果扩增得到全长为1392bp的树鼩CD127编码序列，确定了现有数据库中缺失的一处未知片段。树鼩CD127与人、黑猩猩亲缘关系较近，其氨基酸序列具有较高保守性，蛋白质三维结构整体与人相似，但N糖基化位点数目以及电荷分布存在差异。结论所得序列能够编码具有正常功能的蛋白，全长序列为后续单克隆抗体制备奠定了基础，有助于鉴定树鼩Treg细胞以及相关疾病机理的研究。

关键词：树鼩 CD127 RT-巢式PCR 结构单克隆抗体

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树鼩IL-2基因序列的克隆及分子特征分析

树鼩IL-2基因序列的克隆及分子特征分析

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首届昆明灵长类动物模型学术论坛

作者：黄晓燕代解杰李明利徐娟高跃东王文广殷安国李晓飞孙晓梅中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 中国科学院昆明动物研究所动物模型与人类疾病机理重点实验室免疫生物学实验室云南昆明650223 中国科学院昆明生物多样性大型仪器区域中心云南昆明650223 中国科学院昆明动物研究所遗传资源与进化国家重点实验室云南昆明650223 中

树鼩作为人类疾病良好模型己受到广泛关注,但对其白细胞介素一2方面的研究尚属空白.本实验以培养的树鼩淋巴细胞总RNA为材料,通过RT-PCR技术克隆出长度约为465bp的树鼩IL-2完整开放阅读框(ORF),并通过Clustal W等软件对其序列和分子特... 详细信息

树鼩作为人类疾病良好模型己受到广泛关注,但对其白细胞介素一2方面的研究尚属空白.本实验以培养的树鼩淋巴细胞总RNA为材料,通过RT-PCR技术克隆出长度约为465bp的树鼩IL-2完整开放阅读框(ORF),并通过Clustal W等软件对其序列和分子特征进行了分析,发现树鼩IL-2 cDNA编码一个由154个氨基酸组成的蛋白质,采用MEGA5.0构建进化树发现,树鼩与人、恒河猴亲缘关系较近.

关键词： Tree shrews Interleukin 2 Cloning Structure Function

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树鼩CD3ε全长编码序列的克隆及分子特征分析

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Zoological Research 2010年第5期31卷 483-489页

作者：李乙江高跃东郭彦陆彩霞黄京飞夏雪山代解杰范泉水李作生张华堂云南农业大学动物科学技术学院云南昆明650201 成都军区疾病预防控制中心云南昆明650032 中国科学院昆明动物研究所动物模型与人类疾病机理重点实验室免疫生物学实验室云南昆明650223 中国科学院昆明生物多样性大型仪器区域中心云南昆明650223 中国科学院昆明动物研究所遗传资源与进化国家重点实验室云南昆明650223 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南昆明650118 昆明理工大学生命科学与技术学院

树鼩可作为人类疾病的良好模型,但缺乏对其免疫功能研究的基本标志和单克隆抗体。该研究应用RT-PCR技术,分别从3只树鼩的肝脏、脾脏和血液中克隆了CD3ε全长编码序列并用Discovery Studio等软件对其分子特征进行了分析。结果显示,树鼩CD... 详细信息

树鼩可作为人类疾病的良好模型,但缺乏对其免疫功能研究的基本标志和单克隆抗体。该研究应用RT-PCR技术,分别从3只树鼩的肝脏、脾脏和血液中克隆了CD3ε全长编码序列并用Discovery Studio等软件对其分子特征进行了分析。结果显示,树鼩CD3εcDNA的开放阅读框全长582bp,编码193个氨基酸。树鼩与其他哺乳动物的CD3ε蛋白整体结构近似,与人和恒河猴CD3ε的亲缘关系较近,胞内域与跨膜域高度保守,但胞外域出现2个潜在的糖基化位点,表面电荷亦存在差异。该研究为今后制备树鼩CD3单克隆抗体及功能研究奠定初步的基础。

关键词：树鼩 CD3ε cDNA 克隆结构功能单克隆抗体

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树鼩IL-2Rα(CD25)基因的分离、鉴定及表达分析

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中国科学技术大学学报 2009年第7期39卷 722-727页

作者：邵晓丽张旭东张远旭张华堂何有文中国科学院昆明动物研究所动物模型和人类疾病机理重点实验室人类疾病灵长类模型研究海外团队和免疫生物学实验室云南昆明650223 中国科学技术大学生命科学学院安徽合肥230027 中国科学院昆明动物研究所动物模型和人类疾病机理重点实验室人类疾病灵长类模型研究海外团队和免疫生物学实验室云南昆明650223 中国科学院昆明动物研究所动物模型和人类疾病机理重点实验室人类疾病灵长类模型研究海外团队和免疫生物学实验室云南昆明650223 杜克大学医学中心免疫学系北卡罗来纳州达勒姆市NC27710

.3%～66.4%.RT-PCR检测发现,tsCD25 mRNA分布于树鼩的外周血、脾脏和肺,并受PMA 和 ionomycin 刺激的调节.我们的结果为下一步制备tsCD25单克隆抗体,抑制CD4+CD25+Tregs功能以及开展有关的研究工作奠定了基础.

关键词：树鼩 CD25 逆转录-聚合酶链式反应组织分布

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树鼩肝细胞体外分离培养体系的复建及主要影响因素分析

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Zoological Research 2009年第1期30卷 24-30页

作者：张顶高丽张远旭孙丽冯悦何有文夏雪山张华堂中国科学院昆明动物研究所动物模型与人类疾病机理重点实验室免疫生物学实验室和人类疾病灵长类动物模型研究团队云南昆明650223 中国科学院研究生院北京100049 昆明理工大学生物与化学工程学院云南昆明650224

树鼩(Tupaia Belangeri)与人和灵长类亲缘关系较为接近,是乙型肝炎研究中备受关注的小动物模型,而其原代肝细胞的分离和培养则是建立HBV体外感染模型及应用和基础研究的关键的第一步,但由于以往的文献报道均较为简要,需要较长时间的摸... 详细信息

树鼩(Tupaia Belangeri)与人和灵长类亲缘关系较为接近,是乙型肝炎研究中备受关注的小动物模型,而其原代肝细胞的分离和培养则是建立HBV体外感染模型及应用和基础研究的关键的第一步,但由于以往的文献报道均较为简要,需要较长时间的摸索。本研究通过与机械分离法的直接比较,验证了两步灌注法在树鼩肝细胞分离中的优越性。进而发现,在分离后的体外培养过程中,二甲基亚砜不仅能够促进和维持原代肝细胞的分化,而且能够显著地抑制纤维状细胞群的出现。同时,肝细胞生长因子(HGF)和表皮生长因子(EGF)能够促进肝细胞在体外长期存活。在此优化的条件下,原代培养可持续4—5周,并且较多的细胞聚集形成类似肝窦结构的形态,从而为乙型肝炎病毒感染机理研究和药物筛选提供了必备的先决条件,也为丙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒及单纯疱疹病毒等研究和药物筛选提供了可能。

关键词：树鼩肝细胞二甲基亚砜肝细胞生长因子表皮生长因子分化

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树鼩PD-1基因的分离、鉴定及表达分析(英文)

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中国科学技术大学学报 2009年第7期39卷 714-721页

作者：张旭东邵晓丽张远旭张华堂何有文中国科学技术大学生命科学学院安徽合肥230027 中国科学院昆明动物研究所动物模型和人类疾病机理重点实验室人类疾病灵长类模型研究海外团队和免疫生物学实验室云南昆明650223 杜克大学医学中心免疫学系北卡罗来纳州达勒姆市nc27710

PD-1(Programmed cell death 1)是一种抑制性的受体,是免疫球蛋白超家族的成员.大量研究证明PD-1能被诱导而在活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞、NKT细胞和单核细胞上表达,从而在慢性感染的病因学中起着重要作用.树鼩(Tupaiabelangeri)做为... 详细信息

PD-1(Programmed cell death 1)是一种抑制性的受体,是免疫球蛋白超家族的成员.大量研究证明PD-1能被诱导而在活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞、NKT细胞和单核细胞上表达,从而在慢性感染的病因学中起着重要作用.树鼩(Tupaiabelangeri)做为一个理想的模型可被应用于许多人类感染性疾病如乙型病毒性肝炎.为了充分利用树鼩对于感染性疾病的宿主免疫应答模型,我们分离出树鼩PD-1基因.利用迅速扩增cDNA末端PCR(RACE-PCR)技术,从树鼩脾组织中克隆了PD-1基因的全长cDNA序列.序列分析显示树鼩PD-1 cDNA的开放阅读框编码一个由242个氨基酸组成的跨膜蛋白,并且和人类、灵长类和啮齿类中的同源基因有高度相似性.组织分布分析表明在所检测的几种组织中PD-1基因只在脾中表达.此外,淋巴细胞刺激实验显示,利用PMA和ionomycin刺激新鲜分离的树鼩外周血单核细胞(PBMCs)能够诱导PD-1 mRNA水平上的表达.我们的结果为将来进一步探讨树鼩的免疫功能提供了良好的基础.

关键词：树鼩 PD-1 迅速扩增cDNA末端PCR 表达外周血单核细胞

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