目的:建立糖原磷酸化酶(GPa)抑制剂的体外高通量筛选模型。方法:用梯度离心方法提取大鼠肝脏GPa,以葡萄糖-1-磷酸作为底物,通过测定反应中磷酸根的释放量,间接反映肝脏GPa的活性。通过对反应体系的优化,调整反应条件,建立96孔微孔板的高通量筛选模型,用咖啡因对此模型进行验证,并评价高通量技术参数[Z′-因子(Z-′factor),信号本底比(signal to background,S/B),信噪比(signal to noise,S/N)]。用此模型对5 000个样品(包括合成化合物、天然提取物)组成的随机库进行体外筛选,考察这些样品对GPa的抑制作用。结果:确定反应体系条件是:反应温度25℃,反应时间30 m in,底物浓度0.5 mmol.L-1,大鼠肝脏GPa的用量为250 ng。用此条件测定咖啡因对GPa的抑制曲线,计算其半数抑制浓度(IC50)为(285.3±39.6)μmol.L-1,与文献报道(IC50=240μmol.L-1)基本一致;本模型技术参数Z′-因子=0.79,S/B=0.45,S/N=11.32,表明此模型可以用于高通量筛选。应用此模型筛选得到有活性的化合物9个,其IC50在3.56~45.75μmol.L-1。结论:建立的体外GPa抑制剂高通量筛选模型具有快速、微量、准确的特点,可以作为研究降糖药的工具。
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