检索结果-内蒙古大学图书馆

中国新药杂志 2023年第8期32卷 853-857页

作者：安怡方史新昌于雷李响周勇中国食品药品检定研究院/卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室

目的:利用人促红素cIEF-MS检测结果，解析其糖链单糖组成。方法:经cIEF检测后获得cIEF峰，并对每个峰进行了MS检测，得到每个峰的高分辨质谱分子量，扣除蛋白分子量后，将分子量差值与单糖残基分子量组合数据库进行比对(精度约0.01%),... 详细信息

目的:利用人促红素cIEF-MS检测结果，解析其糖链单糖组成。方法:经cIEF检测后获得cIEF峰，并对每个峰进行了MS检测，得到每个峰的高分辨质谱分子量，扣除蛋白分子量后，将分子量差值与单糖残基分子量组合数据库进行比对(精度约0.01%),获得一系列质量数基本相符的单糖组合方式，并对单糖数量及单糖之间关系合理性进行分析。结果:经cIEF检测后获得10个cIEF峰，MS检测获得不少于32个峰质量数，比较后获得各质量数对应的一系列单糖组合形式，文中只列举了离子数量最高峰P3的组合形式，经有效性分析结果显示其最具有延伸性的组合方式为19个GlcNAc/GlaNAc残基、22个Man/Gla残基、12个Neu5Ac残基和3个Fuc残基。结论:获得人促红素蛋白糖链单糖组合方式，为进一步完整蛋白糖型的解析和表征奠定基础。

关键词：毛细管等电聚焦电泳质谱联用人促红素等电点异构体 N-糖基化修饰 O-糖基化修饰单糖残基组合

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致病性钩端螺旋体分子进化研究进展

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疾病监测 2024年第11期39卷 1471-1476页

作者：李彬石刚叶强徐颖华中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京102629

钩端螺旋体病(钩体病)是由致病性钩端螺旋体(钩体)引起的一种人兽共患的自然疫源性疾病。伴随着全球气候的变暖和日益城市化,致病性钩体为适应环境变化自身也持续进行适应性进化和改变。近年来,各种分子分型和组学技术的快速发展,对该... 详细信息

钩端螺旋体病(钩体病)是由致病性钩端螺旋体(钩体)引起的一种人兽共患的自然疫源性疾病。伴随着全球气候的变暖和日益城市化,致病性钩体为适应环境变化自身也持续进行适应性进化和改变。近年来,各种分子分型和组学技术的快速发展,对该病原体基因遗传多样性、分子进化和致病机制有了更深入认识。本研究通过总结和梳理当前钩体病的流行趋势及病原体分子分型方法,并详细综述其致病性分子进化及其机制最新研究进展,为后续钩体的分子流行病监测和新疫苗研发等工作提供借鉴和参考。

关键词：钩端螺旋体致病性分子进化基因组学蛋白质组学毒力蛋白

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rAAV5基因组滴度测定的数字PCR方法研究

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药物分析杂志 2023年第11期43卷 1826-1832页

作者：郑红梅秦玺李永红于雷毕华饶春明朱留强杨靖清史新昌周勇中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的:建立并验证重组5型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus type 5,rAAV5)基因组滴度测定的数字PCR方法,并对微滴数字PCR方法和芯片数字PCR方法进行比较。方法:分别用不同浓度的SDS和EDTA前处理r AAV5样品,用微滴数字PCR... 详细信息

目的:建立并验证重组5型腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus type 5,rAAV5)基因组滴度测定的数字PCR方法,并对微滴数字PCR方法和芯片数字PCR方法进行比较。方法:分别用不同浓度的SDS和EDTA前处理r AAV5样品,用微滴数字PCR测其基因组滴度,对病毒样品前处理试剂进行优化;在其他试验条件不变的情况下,分别设置微滴数字PCR的退火温度为60、58、54、52℃,以WPRE引物扩增,比较扩增效果,对数字PCR的退火温度进行优化;分别采用微滴数字PCR和芯片数字PCR测定rAAV5的基因组滴度并比较。结果:终浓度为1%SDS和62.5 mmol·L^(-1)EDTA按1∶1(v/v)的比例混合后前处理rAAV5,测定的基因组拷贝数较高,前处理液裂解效果较好;当退火温度为54℃时,微滴数字PCR中阳性微滴和阴性微滴分离效果最好,扩增特异性最强;2种测定结果的试验室内精密度和回收率接近,测定同一裂解样本的结果较为接近(在1个数量级)。结论:初步建立了数字PCR方法并验证,为后续的进一步验证奠定基础。

关键词：重组5型腺相关病毒基因组滴度微滴数字PCR 芯片数字PCR 基因治疗

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基因治疗产品质量控制策略及面临挑战

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中国新药杂志 2022年第21期31卷 2090-2100页

作者：于雷史新昌秦玺王光裕李响周勇中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室

近年来基因疗法进入快速发展阶段，越来越多的产品进入临床研究阶段或获批上市，适应证涉及遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等。体内基因治疗产品是指在体内通过对人体细胞的遗传物质进行修饰、表达外源基因、操纵细胞基因表... 详细信息

近年来基因疗法进入快速发展阶段，越来越多的产品进入临床研究阶段或获批上市，适应证涉及遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病等。体内基因治疗产品是指在体内通过对人体细胞的遗传物质进行修饰、表达外源基因、操纵细胞基因表达或调控细胞生物学特性等方式达到治疗疾病目的的药品，其结构、功能及生产工艺较传统蛋白类药物更加复杂，潜在的安全性风险更高，如病毒安全性和遗传毒性。因此，质量控制工作面临更多挑战。本文基于体内基因治疗产品的研发、生产和质量控制现状以及相关法规、技术指南，探讨了基于“质量源于设计”理念的质量控制策略以及目前生产和质量控制面临的挑战和解决方案，为相关产品的质量控制提供参考。

关键词：体内基因治疗质量源于设计质量风险评估生产工艺质量控制

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重组人促卵泡激素体外生物学活性测定方法的联合验证

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药学学报 2023年第3期58卷 760-766页

作者：王绿音吕萍张慧李晶梁成罡中国食品药品检定研究院激素室国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京102629

为探索基于报告基因的重组人促卵泡激素体外生物学活性测定方法的标准化应用前景,进行实验室间的联合验证。按照《中华人民共和国药典》2020年版通则9401对该方法进行相对准确度、中间精密度、线性与范围等方法学验证;联合3个实验室采... 详细信息

为探索基于报告基因的重组人促卵泡激素体外生物学活性测定方法的标准化应用前景,进行实验室间的联合验证。按照《中华人民共和国药典》2020年版通则9401对该方法进行相对准确度、中间精密度、线性与范围等方法学验证;联合3个实验室采用本方法测定来自不同生产企业的6批制剂及3批原液的体外生物学活性,对测定结果进行实验室间一致性分析以及实验室内、实验室间精密度分析;据联合验证中发现的问题对方法进行调整优化。实验室内方法学验证的结果符合《中华人民共和国药典》2020版四部通则9401的要求;针对联合验证中发现的问题,对细胞铺板培养基、标准品及供试品的预稀释缓冲液、加药后吸弃上清方式进行了优化,优化后各实验室之间的测定结果无显著差别(P>0.05),具有统计学等效性;实验室内及实验室间精密度良好,几何变异系数(GCV%)均小于15%。综上,本方法具有良好的实验室内重复性及实验室间重现性,且适用于不同生产厂家的重组人促卵泡激素制剂与原液产品,有望作为测定此类产品体外生物学活性的标准化方法进行推广。

关键词：生物学活性重组人促卵泡激素报告基因法方法学验证联合验证

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报告基因法测定人绒毛膜促性腺激素生物活性

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药学学报 2024年第2期59卷 432-438页

作者：黄盈张孝明李鹤洋王绿音张慧吕萍李晶高向东梁成罡中国药科大学江苏南京211198 中国食品药品检定研究院国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京102629

本研究根据人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)与受体结合后激活cAMP信号通路,构建一种LHCGR-CRE-luc-HEK293转基因细胞系,采用荧光素酶检测系统对hCG进行生物活性检测,利用四参数拟合分析计算样品相对效价。并且对... 详细信息

本研究根据人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)与受体结合后激活cAMP信号通路,构建一种LHCGR-CRE-luc-HEK293转基因细胞系,采用荧光素酶检测系统对hCG进行生物活性检测,利用四参数拟合分析计算样品相对效价。并且对该方法条件进行优化,对方法的专属性、相对准确度、精密度和线性进行验证。结果显示,hCG浓度与报告基因表达量存在量效关系,且符合四参数曲线。经优化后,条件确定为hCG初始浓度为2.5μg·mL-1,稀释倍数为1∶4,细胞数为每孔10000~15000个,诱导时间为6 h。该方法具有良好的专属性,相对准确度的相对偏倚范围在-8.9%~3.4%,线性回归方程相关系数为0.996,中间精密度几何变异系数范围为3.3%~15.0%,线性范围为50%~200%。本研究成功建立并验证了一种报告基因法检测hCG生物学活性,可以用于hCG生物活性检测和质量控制。

关键词：报告基因法人绒毛膜促性腺激素四参数曲线生物活性方法学验证

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促红素N-糖链的超高压液相色谱分析方法验证

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中国新药杂志 2024年第6期33卷 598-604页

作者：李响秦玺裴德宁于雷史新昌周勇中国食品药品检定研究院国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室

目的:应用超高压液相色谱方法对促红素N-糖链分析并进行方法学验证，为相应质控方法的建立和验证提供参考。方法:用N-糖苷酶将促红素N-糖链酶切下后，进行2-AB衍生化标记，采用磁珠法纯化后进行液相分析，以pH 4.4的100 mmol·L-1... 详细信息

目的:应用超高压液相色谱方法对促红素N-糖链分析并进行方法学验证，为相应质控方法的建立和验证提供参考。方法:用N-糖苷酶将促红素N-糖链酶切下后，进行2-AB衍生化标记，采用磁珠法纯化后进行液相分析，以pH 4.4的100 mmol·L-1甲酸铵溶液为流动相A液，70%乙腈为流动相B液，梯度洗脱70.0 min,荧光检测器检测，激发光波长260 nm、发射光波长430 nm。对该方法进行了相应的方法学验证。结果:考察了方法进样和制备重复性，峰簇1～5的峰面积百分比的RSD不高于4.08%,保留时间的RSD均不高于2.89%。方法中间精密度考察结果显示，峰簇1～5的峰面积百分比的RSD不高于11.85%,保留时间的RSD均不高于8.05%。方法准确度考察中，峰簇2,3,4相对峰面积回收率分别为98.28%～113.01%,98.68%～102.96%,98.51%～100.75%。在蛋白含量为2.5～7.5 mg·mL-1（即促红素蛋白量50～150μg）时，峰簇1～5峰面积线性回归的决定系数均>0.99。设定方法定量限为蛋白量50μg,所制备的样品4℃放置48 h内稳定。结论:实验结果显示该方法的专属性、精密度、准确度和线性均良好，可为促红素N-糖质控方法的建立和验证提供参考。

关键词： N-糖链促红素方法学验证 2-AB标记质量控制

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CGE-LIF方法分析重组腺相关病毒(rAAV)衣壳蛋白的比例含量

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药物分析杂志 2023年第11期43卷 1833-1839页

作者：李响高铁史新昌陈泓序唐红梅秦玺周勇中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050 SCIEX中国北京100015

目的:建立毛细管凝胶电泳串联激光诱导荧光检测器(CGE-LIF)方法分析重组腺相关病毒(rAAV)衣壳蛋白VP1、VP2和VP3比例含量并进行方法学验证。方法:CGE-LIF分析rAAV衣壳蛋白方法为:rAAV样品加入4%SDS-150 mmol·L^(-1)NEM的溶液预变性... 详细信息

目的:建立毛细管凝胶电泳串联激光诱导荧光检测器(CGE-LIF)方法分析重组腺相关病毒(rAAV)衣壳蛋白VP1、VP2和VP3比例含量并进行方法学验证。方法:CGE-LIF分析rAAV衣壳蛋白方法为:rAAV样品加入4%SDS-150 mmol·L^(-1)NEM的溶液预变性(70℃,5 min);再加入P503染料标记(70℃,10 min);再加入1%SDS进行变性(70℃,5 min),然后混匀上机检测。方法验证包括准确性、精密度、线性、检测限、定量限,耐用性等。另外考察了P503、TAMRA、FQ 3种染料条件及rAAV不同血清型和部分批间一致性。结果:CGE-LIF分析不同血清型rAAV(包括2、5、8、9、10型)可将其衣壳蛋白VP1、VP2和VP3基线分离并且峰形尖锐。准确性显示衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的实测结果与预期结果的相关系数r>0.99;重复性结果显示每个衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的迁移时间RSD均<1.5%,校正峰面积百分比的RSD均<5%;中间精密度结果显示衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的迁移时间RSD均<1.5%,校正峰面积百分比RSD均<5%;线性结果显示在0.6×10^(12)~3.0×10^(12)vg·mL^(-1)范围内与衣壳蛋白校正峰面积线性关系良好;VP3检测限和定量限分别为7.2×10^(10)vg·mL^(-1)和2.2×10^(11)vg·mL^(-1)。用3种不同染料(P503、FQ和TAMRA)进行CGE-LIF检测,结果良好。该方法的批间稳定结果较为理想。结论:建立了rAAV衣壳蛋白CGE-LIF分析方法,所建方法可以对rAAV产品3种衣壳蛋白进行分离和相对定量。

关键词：毛细管凝胶电泳重组腺相关病毒(rAAV) 衣壳蛋白 LIF检测器比例含量

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人粒细胞刺激因子生物学活性协标品均匀度分析

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中国新药杂志 2022年第9期31卷 850-853页

作者：朱留强刘兰于雷丁有学史新昌周勇中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室

目的:分析人粒细胞刺激因子生物学活性协作标定样品（以下简称协标品）均匀度。方法:利用协标品协作标定数据中同一次实验中A组和B组配对数据差值估算协标品引入的不确定度，进而估算协标品的均匀度；以数据两两间差值的标准差和协标品... 详细信息

目的:分析人粒细胞刺激因子生物学活性协作标定样品（以下简称协标品）均匀度。方法:利用协标品协作标定数据中同一次实验中A组和B组配对数据差值估算协标品引入的不确定度，进而估算协标品的均匀度；以数据两两间差值的标准差和协标品引入的不确定度共同估计国际标准品引入的不确定度。结果:协标品的不确定度为0.27×10～6 IU·支-1;扣除实验影响，协标品均匀度约为3%;国际标准品带来的不确定度为0.49×10～6 IU·支-1。结论:探讨生物学活性协标品均匀度分析方法，为其他标准品协作标定提供方案参考，也为该标准品的应用提供数据支持。

关键词：人粒细胞刺激因子生物学活性协作标定样品协作标定均匀度不确定度

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In-cell Western法测定人胰岛素生物学活性

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中国新药杂志 2023年第10期32卷 1000-1006页

作者：王绿音杨艳枫梁誉龄张慧李晶梁成罡中国食品药品检定研究院激素室国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室中国药科大学

目的:利用in-cell Western(ICW)技术研究基于转基因细胞的人胰岛素生物学活性测定方法。方法:以CHO-INSR B1284为靶细胞，用不同浓度的人胰岛素刺激靶细胞，采用ICW技术检测人胰岛素受体酪氨酸磷酸化水平，进行人胰岛素的体外生物学活... 详细信息

目的:利用in-cell Western(ICW)技术研究基于转基因细胞的人胰岛素生物学活性测定方法。方法:以CHO-INSR B1284为靶细胞，用不同浓度的人胰岛素刺激靶细胞，采用ICW技术检测人胰岛素受体酪氨酸磷酸化水平，进行人胰岛素的体外生物学活性测定；根据《中华人民共和国药典》2020年版通则9401“生物制品生物活性/效价测定方法”对该方法进行专属性、相对准确度、中间精密度、线性与范围等方法学验证；以重组人胰岛素国家标准品为参比品，采用本方法测定人胰岛素原料药及其他人胰岛素类似物的生物学活性相对效价。结果:不同浓度的人胰岛素作用于CHO-INSR B1284细胞后具有较好的剂量依赖性；5个效价浓度的待测品经8次测定，相对效价的几何均值分别为：(63.76±4.38)%,(78.01±5.97)%,(99.52±4.62)%,(122.84±7.4)%,(151.71±8.81)%,相对偏倚均在±5%范围内，对应的几何变异系数(GCV,%)均<11%,GCV的置信上限均<20%;采用该方法能有效检测人胰岛素及其胰岛素类似物的效价。结论:利用ICW技术的人胰岛素体外生物学活性测定法专属性强、准确度高、精密度好，可作为人胰岛素生物学活性的常规检测方法。

关键词：生物学活性人胰岛素转基因细胞 in-cell Western 方法学验证

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