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中国新药杂志 2024年第6期33卷 598-604页

作者：李响秦玺裴德宁于雷史新昌周勇中国食品药品检定研究院国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室

目的:应用超高压液相色谱方法对促红素N-糖链分析并进行方法学验证，为相应质控方法的建立和验证提供参考。方法:用N-糖苷酶将促红素N-糖链酶切下后，进行2-AB衍生化标记，采用磁珠法纯化后进行液相分析，以pH 4.4的100 mmol·L-1... 详细信息

目的:应用超高压液相色谱方法对促红素N-糖链分析并进行方法学验证，为相应质控方法的建立和验证提供参考。方法:用N-糖苷酶将促红素N-糖链酶切下后，进行2-AB衍生化标记，采用磁珠法纯化后进行液相分析，以pH 4.4的100 mmol·L-1甲酸铵溶液为流动相A液，70%乙腈为流动相B液，梯度洗脱70.0 min,荧光检测器检测，激发光波长260 nm、发射光波长430 nm。对该方法进行了相应的方法学验证。结果:考察了方法进样和制备重复性，峰簇1～5的峰面积百分比的RSD不高于4.08%,保留时间的RSD均不高于2.89%。方法中间精密度考察结果显示，峰簇1～5的峰面积百分比的RSD不高于11.85%,保留时间的RSD均不高于8.05%。方法准确度考察中，峰簇2,3,4相对峰面积回收率分别为98.28%～113.01%,98.68%～102.96%,98.51%～100.75%。在蛋白含量为2.5～7.5 mg·mL-1（即促红素蛋白量50～150μg）时，峰簇1～5峰面积线性回归的决定系数均>0.99。设定方法定量限为蛋白量50μg,所制备的样品4℃放置48 h内稳定。结论:实验结果显示该方法的专属性、精密度、准确度和线性均良好，可为促红素N-糖质控方法的建立和验证提供参考。

关键词： N-糖链促红素方法学验证 2-AB标记质量控制

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利用高分辨质谱技术综合解析胰岛素类制品复杂二硫键结构

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药学学报 2024年第1期59卷 188-197页

作者：胡馨月丁晓丽孙悦张慧李晶梁成罡中国食品药品检定研究院激素室国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室北京102629

二硫键的正确配对维持了多肽和蛋白类药物的正确折叠方式和高级结构的形成,对产品的质量控制至关重要。为了确保二硫键正确配对,二硫键分析是多肽和蛋白质药物表征中必不可少的重要部分。质谱分析技术可用于二硫键分析,然而,胰岛素及其... 详细信息

二硫键的正确配对维持了多肽和蛋白类药物的正确折叠方式和高级结构的形成,对产品的质量控制至关重要。为了确保二硫键正确配对,二硫键分析是多肽和蛋白质药物表征中必不可少的重要部分。质谱分析技术可用于二硫键分析,然而,胰岛素及其类似物中存在两对没有酶切位点的二硫键,常规的碰撞诱导解离(CID)和高能诱导裂解(HCD)无法实现该复杂二硫键的准确定位。本研究通过3种方法综合定位该复杂二硫键,包括酶切加关键肽段源内碎裂(ISD)法、酶切加部分还原烷基化法、完整蛋白源内碎裂和电子转移解离(ETD)裂解法,并且考察了门冬胰岛素、赖脯胰岛素和甘精胰岛素的适用性,为胰岛素及其类似物二硫键连接方式的质量控制提供了新途径,也为含该类复杂二硫键多肽或蛋白类生物制品的二硫键定位提供借鉴。

关键词：胰岛素及其类似物二硫键定位部分还原烷基化源内碎裂电子转移裂解

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重组抗淀粉样β肽单克隆抗体药物的质量控制研究

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中国新药杂志 2024年第12期33卷 1224-1232页

作者：武刚于传飞李萌崔永霏郭璐韵梅玉婷杨雅岚徐刚领王兰中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室/药品监管科学全国重点实验室/国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室/国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室

目的:研究并建立针对抗淀粉样肽(amyloid-β,Aβ)单克隆抗体的关键质量属性质量控制方法。方法:基于胰蛋白酶酶切和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进行肽指纹图谱分析，分子排阻色谱法(SE-HPLC)进行单体聚体纯度分析，采用还原/非还原十... 详细信息

目的:研究并建立针对抗淀粉样肽(amyloid-β,Aβ)单克隆抗体的关键质量属性质量控制方法。方法:基于胰蛋白酶酶切和反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进行肽指纹图谱分析，分子排阻色谱法(SE-HPLC)进行单体聚体纯度分析，采用还原/非还原十二烷基硫酸钠毛细管电泳法(CE-SDS)进行大小变异体纯度分析，采用阳离子色谱法(CEX-HPLC)进行电荷变异体纯度分析，采用HILIC-UPLC法进行寡糖分析，采用ELISA法测定Aβ抗原相对结合活性。其他各项指标均应符合《中华人民共和国药典》2020年版以及其他相关要求。结果:肽指纹图谱起到良好的鉴别作用；SE-HPLC法中单体相对百分含量为(99.40±0.00)%,聚体的相对百分含量为(0.55±0.00)%;还原CE-SDS法中轻重链之和的相对百分含量为(98.11±0.08)%,非还原CE-SDS法的主峰相对百分含量为(96.57±0.15)%,HHL峰相对百分含量为(1.91±0.10)%;CEX-HPLC法中主成分相对百分含量为(75.08±0.06)%,酸性变异体的相对百分含量为(16.12±0.05)%,碱性变异体的相对百分含量为(8.80±0.05)%;HILIC-UPLC寡糖图谱分析的(G0F+G1F+G2F),Man5,G0相对百分含量分别为(91.56±0.04)%,(1.21±0.03)%,(2.60±0.01)%;ELISA法中与Aβ抗原的相对结合活性为(101.40±0.53)%。结论:针对抗Aβ单抗的质量属性，研究建立质控方法并进行质量研究，确保产品安全有效和质量可控，为该类单抗产品的质量控制方法和策略提供参考依据。

关键词：淀粉样肽单克隆抗体鉴别纯度分析生物学活性

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mRNA疫苗质量控制研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2024年第10期44卷 912-916页

作者：刘晶晶李玉华中国食品药品检定研究院虫媒病毒疫苗室国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及标准化重点实验室国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室北京102629

mRNA疫苗在碱基修饰和脂质递送系统等创新技术的不断驱动下,因研发快、生产周期短、无需大规模细胞和病毒培养等特点而广受关注,在应对COVID-19疫情方面发挥了重要作用,成为了新发突发传染病防控的重要技术路线。目前,mRNA技术产品已在... 详细信息

mRNA疫苗在碱基修饰和脂质递送系统等创新技术的不断驱动下,因研发快、生产周期短、无需大规模细胞和病毒培养等特点而广受关注,在应对COVID-19疫情方面发挥了重要作用,成为了新发突发传染病防控的重要技术路线。目前,mRNA技术产品已在传染性疾病的预防、自身免疫疾病、罕见病以及癌症治疗等多个方向证明了其功效和优势。本文综述了预防用mRNA疫苗原液和制剂的生产工艺,重点讨论了mRNA疫苗全生产过程中的质量控制要点,以及全生命周期质量控制理念,强调了mRNA疫苗质量的重要性,为预防用mRNA产品发展提供科学技术参考。

关键词： mRNA疫苗传染性疾病生产工艺质量控制

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英夫利西单抗活性候选国家标准品的一级结构表征

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药物分析杂志 2025年第3期45卷 460-474页

作者：李玮玉张佳龄李萌俞小娟武刚于传飞王兰中国食品药品检定研究院药品监管科学全国重点实验室国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室北京102629

目的:对英夫利西单抗活性候选国家标准品进行一级结构表征,为该单抗的后续研究提供技术依据。方法:基于超高效液相色谱-串联质谱(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS)对英夫利西单抗活性候选国... 详细信息

目的:对英夫利西单抗活性候选国家标准品进行一级结构表征,为该单抗的后续研究提供技术依据。方法:基于超高效液相色谱-串联质谱(ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS)对英夫利西单抗活性候选国家标准品的完整相对分子质量、轻重链亚基相对分子质量进行检测;使用UPLC-MS/MS对英夫利西单抗活性候选国家标准品的序列覆盖率、糖基化位点及二硫键进行分析。结果:英夫利西单抗活性候选国家标准品的完整相对分子质量为148515;轻链相对分子质量23435、重链相对分子质量50827;英夫利西单抗活性候选国家标准品轻链序列覆盖率100%、重链序列覆盖率100%;该单抗活性候选标准品糖基化位点位于重链N300;共有16对二硫键,2条重链链内各4对,链间2对,2条轻链链内各2对,2组轻重链间各1对。结论:对英夫利西单抗活性候选国家标准品进行一级结构确证,为后续该单抗标准物质的建立和分析方法的标准化及产品质量控制提供技术保障。

关键词：英夫利西国家标准品一级结构高效液相色谱串联质谱表征

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新型冠状病毒中和抗体生物学活性的测定

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中国药学杂志 2024年第4期59卷 353-362页

作者：俞小娟王安陈奔蒋雯李纲王荣娟张姣王文波段茂芹于传飞王兰中国食品药品检定研究院国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室北京102629 迈威(上海)生物科技股份有限公司上海201210

目的开发针对新型冠状病毒中和抗体生物学活性及免疫学特性分析的方法。方法使用生物膜层干涉法(biolayer interferometry,BLI)分析9MW3311中和抗体Fab和S1-RBD的亲和力常数;分别使用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,... 详细信息

目的开发针对新型冠状病毒中和抗体生物学活性及免疫学特性分析的方法。方法使用生物膜层干涉法(biolayer interferometry,BLI)分析9MW3311中和抗体Fab和S1-RBD的亲和力常数;分别使用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和流式细胞分选法评价中和抗体结合片段(antibody binding fragment,Fab端)和S蛋白的相对结合活性和对ACE2的阻断结合活性;使用假病毒体系评价中和抗体的体外细胞学活性;使用表面等离子共振法(surface plasmon resonance,SPR)测定抗体Fc段与Fcγ和FcRn受体的亲和力常数;使用ELISA法测定抗体Fc段和C1q受体的结合活性;采用PBMC法确定中和抗体的体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)、补体(First subcomponent of the C1 complex)介导的细胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity,CDC);使用假病毒系统评价中和抗体的依赖性感染增强作用(antibody-dependent enhancement,ADE)效应。结果3批9MW3311中和抗体和参比品与S1-RBD的亲和力常数KD(mol·L^(-1))值分别为1.15×10^(-9),1.01×10^(-9),1.15×10^(-9)和9.45×10^(-10);ELISA和FACS分别测得3批中和抗体相对参比品的结合活性为101%、96%、100%及98%、113%、108%;ELISA和FACS分别测得3批中和抗体相对参比品对ACE2的阻断活性为100%、95%、91%及94%、101%、94%;3批中和抗体相对参比品对假病毒的中和活性分别91%、93%、108%;3批9MW3311中和抗体和参比品分别与FcγR和FcRn均有同等水平的亲和力;9MW3311无ADCC和CDC活性;LALA突变的中和抗体可有效避免ADE效应。结论初步建立了新型冠状病毒中和抗体生物学活性及免疫学特性分析的方法,可用于该类型制品的常规质量控制和放行。

关键词：新型冠状病毒中和抗体生物学活性免疫学特性

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利用LC-MS/MS法解析化学修饰型胰岛素类似物的氨基酸序列

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中国新药杂志 2023年第3期32卷 301-310页

作者：胡馨月丁晓丽孙悦秦希月张慧李晶梁成罡中国食品药品检定研究院激素室国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室吉林大学

目的:德谷胰岛素和地特胰岛素是以长链脂肪酸化学修饰为代表的第3代胰岛素类似物，有必要建立专属性强、灵敏度高的LC-MS/MS法测定化学修饰型胰岛素类似物的氨基酸序列。方法:氨基酸序列测定方法的色谱参数为ACQUITY UPLC peptide BEH ... 详细信息

目的:德谷胰岛素和地特胰岛素是以长链脂肪酸化学修饰为代表的第3代胰岛素类似物，有必要建立专属性强、灵敏度高的LC-MS/MS法测定化学修饰型胰岛素类似物的氨基酸序列。方法:氨基酸序列测定方法的色谱参数为ACQUITY UPLC peptide BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm, 1.7μm, 300?）,流动相A为0.1%甲酸/水溶液，流动相B为0.1%甲酸/乙腈溶液，梯度洗脱，流速0.3 mL·min-1;质谱参数为MSE采集模式，碰撞能量为30～40 eV。结果:德谷胰岛素和地特胰岛素序列覆盖率良好，化学修饰位点的碎片离子y1&可检出，中高强度离子的离子强度RSD在15%之内，可有效区分与其他未修饰胰岛素的序列。结论:建立了重复性好、专属性强和耐用性好的脂肪侧链修饰型胰岛素类似物氨基酸序列LC-MS/MS方法，为该类产品序列结构的研究方法提供了借鉴意义。

关键词：脂肪侧链修饰型胰岛素类似物德谷胰岛素地特胰岛素 LC-MS/MS法氨基酸序列定位酶切

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超高效液相色谱-串联四极杆-轨道阱高分辨质谱法测定甘精胰岛素单链前体残留量

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中国药学杂志 2023年第7期58卷 611-618页

作者：胡馨月丁晓丽秦希月孙悦李懿李晶梁成罡中国食品药品检定研究院激素室国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室北京102629 吉林大学长春130015

目的胰岛素单链前体是胰岛素生产工艺中的相关杂质,关系到该类产品的安全性和有效性,有必要建立准确度好、灵敏度高的检测胰岛素单链前体残留量的液质方法。本研究以甘精胰岛素单链前体为例,为胰岛素及其类似物单链前体液质联用方法开... 详细信息

目的胰岛素单链前体是胰岛素生产工艺中的相关杂质,关系到该类产品的安全性和有效性,有必要建立准确度好、灵敏度高的检测胰岛素单链前体残留量的液质方法。本研究以甘精胰岛素单链前体为例,为胰岛素及其类似物单链前体液质联用方法开发提供参考与借鉴。方法色谱柱ACQUITY UPLC peptide CSH C18(2.1 mm×150 mm, 130?,1.7μm);流动相A为体积分数0.1%甲酸-水溶液,流动相B为0.1%甲酸-乙腈溶液,梯度洗脱,流速0.3 mL·min^(-1),柱温60℃,检测波长214 nm。Orbitrap Exploris 480液质联用仪,ESI+电喷雾电离源,数据检测模式为平行反应监测(PRM),定量离子对1 155.6/1 151.5。结果甘精胰岛素单链前体在1~100 ng·mL^(-1)内峰面积与浓度有良好的线性关系(r=0.999 2),方法平均回收率为97%(n=9)。结论经方法学验证,本法能准确测定甘精胰岛素中单链前体胰岛素前体的残留量,方法精密度、重复性、准确度和耐用性良好。

关键词：胰岛素单链前体液质联用工艺相关杂质残留量高分辨质谱平行反应监测

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阿达木单抗生物学活性质控方法的建立和验证

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中国新药杂志 2023年第14期32卷 1423-1431页

作者：贾哲郭莎王文波杨雅岚龙彩凤王兰刘万卉烟台大学药学院中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及标准化重点实验室国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室

目的:建立基于肿瘤坏死因子-α（TNF-α）中和活性测定法的阿达木单抗生物学活性检测方法，为实现阿达木单抗同类产品生物学活性的平行比对研究提供技术手段。方法:以小鼠成纤维细胞L929为实验细胞，对TNF-α和放线菌素D（Act-D）等关... 详细信息

目的:建立基于肿瘤坏死因子-α（TNF-α）中和活性测定法的阿达木单抗生物学活性检测方法，为实现阿达木单抗同类产品生物学活性的平行比对研究提供技术手段。方法:以小鼠成纤维细胞L929为实验细胞，对TNF-α和放线菌素D（Act-D）等关键试剂进行标准化，并通过摸索细胞接种量、关键试剂浓度、阿达木单抗稀释梯度、孵育时间等对方法进行优化，并对优化后的方法进行实验室内的方法学验证与实验室间的联合验证，证实该方法的性能表现及对阿达木单抗原研药和生物类似药的适用性。结果:阿达木单抗在该方法中存在量效关系，优化后的方法确定细胞密度为2×10～4个·孔-1、TNF-α和Act-D浓度分别为1和400 ng·mL-1、抗体起始浓度为1 000 ng·mL-1、稀释比为1∶2.5、铺板时间和孵育时间为18和24 h,方法学验证表明该方法专属性合理、精密度好、准确性高，联合验证结果满意。结论:该方法适用于目前已上市的5家阿达木单抗，可以作为阿达木单抗生物学活性的平台化质控方法，便于国家药品抽验工作开展及各产品间的平行比较，同时也为国家标准品建立提供了可选的评价手段，为未来《中华人民共和国药典》对阿达木单抗各论的收载提供了技术支撑。

关键词：阿达木单抗原研药生物类似药生物学活性优化验证

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抗体类药物蛋白A残留检测方法的方法学验证

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中国新药杂志 2022年第12期31卷 1169-1177页

作者：付志浩钟欣徐刚领于传飞王兰中国食品药品检定研究院国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室

目的:对抗体类药物的蛋白A残留ELISA法检测进行方法学验证，为业界相应质控方法的建立和验证提供参考。方法:将640～10 pg·mL-1系列稀释的蛋白A标准品分别加标至3个不同稀释浓度的抗体类样品中，加入至预包被抗蛋白A单抗的ELISA板... 详细信息

目的:对抗体类药物的蛋白A残留ELISA法检测进行方法学验证，为业界相应质控方法的建立和验证提供参考。方法:将640～10 pg·mL-1系列稀释的蛋白A标准品分别加标至3个不同稀释浓度的抗体类样品中，加入至预包被抗蛋白A单抗的ELISA板条中，洗涤后加入生物素标记的检测抗体，洗涤后加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（SA-HRP）,再次洗涤后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物，然后加入终止液后进行酶标仪读板，利用标准曲线回算加标样品的蛋白A含量。2个实验员分别进行3 d实验，每天进行3次独立实验，对该方法进行了全面的方法学验证。结果:各样品各浓度加标点的准确性均满足70%～130%,重复性和中间精密度均≤20%,方法的范围为10～640 pg·mL-1,方法的定量限为10 pg·mL-1,该方法专属性良好。另外该方法具有良好的蛋白A配基通用性。结论:对方法的准确性、精密度、线性、范围、定量限和专属性进行了全面的验证，为相应方法学验证的科学性和合理性设计提供了参考。

关键词：蛋白A残留单克隆抗体方法学验证质量控制酶联免疫吸附测定

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