检索结果-内蒙古大学图书馆

山西医科大学学报 2025年第3期56卷 290-293页

作者：崔春博武刚俞小娟刘春雨李萌倪永波崔永霏于传飞王兰中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室卫生部生物技术产品检定及标准化重点实验室国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室北京102629

目的建立并验证一种测定单克隆抗体药物中微量蛋白质含量的方法。方法采用高效液相色谱-荧光检测器(high performance liquid chromatography-fluorescence detector,HPLC-FLD)法建立单抗药物中蛋白质含量的检测方法,并对方法的专属性... 详细信息

目的建立并验证一种测定单克隆抗体药物中微量蛋白质含量的方法。方法采用高效液相色谱-荧光检测器(high performance liquid chromatography-fluorescence detector,HPLC-FLD)法建立单抗药物中蛋白质含量的检测方法,并对方法的专属性、线性、重复性、中间精密度、准确度和耐用性进行验证。结果该方法专属性强。在250~750 ng进样量范围内,蛋白质进样量与峰面积呈良好的线性关系,决定系数R^(2)>0.99。两名实验人员分别在3个工作日对同一份供试品溶液进行18次独立测定,其蛋白质含量的变异系数为3.03%,蛋白质含量验证溶液(550 ng)的回收率在90%~110%内。6次蛋白质含量验证溶液(550 ng)蛋白质含量测定值的RSD为2.88%。不同色谱柱检测蛋白质含量验证溶液(550 ng)的变异系数为1.86%。结论成功建立了检测单克隆抗体药物中微量蛋白质含量的高效液相色谱法,该方法专属性强、重复性好、精密度及准确度高,可对单克隆抗体药物中微量蛋白质含量进行质量控制。

关键词：高效液相色谱荧光检测器单克隆抗体药物微量含量测定质量控制

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均相时间分辨荧光法测定抗PD-1/PD-L1单抗药物活性

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药物分析杂志 2019年第1期39卷 45-50页

作者：孙亮李萌于传飞王兰中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室卫生部生物技术产品检定及标准化重点实验室北京102629

目的:探索并建立一种均相时间分辨荧光(homogeneous time-resolved fluorescence,HTRF)检测方法,用于快速、灵敏、稳定检测单克隆抗体的活性。方法:将检测试剂、待检样品加入96半孔板,室温振荡孵育3 h后在酶标仪上读取荧光信号值,用软... 详细信息

目的:探索并建立一种均相时间分辨荧光(homogeneous time-resolved fluorescence,HTRF)检测方法,用于快速、灵敏、稳定检测单克隆抗体的活性。方法:将检测试剂、待检样品加入96半孔板,室温振荡孵育3 h后在酶标仪上读取荧光信号值,用软件对信号值进行四参数曲线拟和,根据四参数方程计算单抗的相对活性;同时对该方法进行验证。结果:本文构建的检测方法呈典型的反S型剂量效应曲线,且反应缓冲液中添加0.4 mol·L^(-1)氟化钾可提高荧光响应值。对该方法进行验证,专属性强,只与抗PD-1/PD-L1单抗发生反应;2名不同分析人员重复检测6次,相对效价范围为85%～117%,总RSD为13%;准确性良好,不同浓度供试品溶液回收率均在80%～120%范围内;理论相对活性与实际测得相对活性线性良好,相关系数在0.99以上,斜率接近1.0,符合方法验证要求。结论:通过对HTRF检测条件的摸索及验证,建立了一种新型测定单抗活性的方法,且该方法快速简便,可用于单抗的前期筛选或后期活性检测。

关键词：均相时间分辨荧光单克隆抗体药物活性程序性死亡因子程序性死亡因子受体氟化钾

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康柏西普质量标准优化和提高

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药物分析杂志 2019年第1期39卷 1-12页

作者：张峰于传飞王文波武刚贺庆刘爱兵宋晓婕柯潇王兰中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室卫生部生物技术产品检定方法及标准化重点实验室北京102629 成都康弘药业集团股份有限公司成都610000

目的:为在更高水平上控制康柏西普质量,进一步确保产品的安全性和有效性,对其生物学活性、非还原SDS-PAGE纯度、唾液酸含量、糖基化项目的检测方法和不溶性微粒的质量标准进行提高。方法:建立和验证康柏西普3个质量控制方法,包括康柏西... 详细信息

目的:为在更高水平上控制康柏西普质量,进一步确保产品的安全性和有效性,对其生物学活性、非还原SDS-PAGE纯度、唾液酸含量、糖基化项目的检测方法和不溶性微粒的质量标准进行提高。方法:建立和验证康柏西普3个质量控制方法,包括康柏西普生物学活性的荧光素酶报告基因分析(reporter gene assay,RGA)方法、唾液酸含量的反相高效液相色谱(reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)测定方法和糖谱的离子交换高效液相色谱(ion exchange-high performance liquid chromatography,IEX-HPLC)测定方法,并对非还原十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)纯度测定方法的凝胶浓度和上样量进行优化,按照2015年版《中华人民共和国药典》通则0903,采用光阻法测定不溶性微粒。结果:生物学活性测定中,RGA法在准确度、精密度和中间精密度等方面均优于人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)增殖抑制法,且能够更好地反映康柏西普生物学活性的变化;非还原SDS-PAGE纯度检测中,4%～15%梯度胶较10%固定浓度凝胶对主带和杂带的分离度高,3μg上样量时,能够更准确地测定康柏西普纯度;间苯二酚法测定唾液酸含量中,N-糖的非唾液酸单糖亦可与间苯二酚反应,产物在580 nm处有光吸收,从而影响检测结果,本研究建立的RP-HPLC法通过4,5-亚甲二氧基-1,2-邻苯二胺盐酸盐(4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride,DMB)标记排除该影响,检测结果更准确;建立的IEX-HPLC糖谱测定方法可以有效控制影响康柏西普关键质量属性的N-糖基化类型;康柏西普成品的不溶性微粒检测结果能够满足USP<789>要求。结论:所建立/优化的质控方法和提高的质量标准可在更高水平上对康柏西普质量进行控制。

关键词：康柏西普唾液酸糖谱不溶性微粒报告基因分析十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨电泳

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基于报告基因的抗HER2单克隆抗体ADCC生物学活性测定方法的建立及应用

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药物分析杂志 2019年第1期39卷 51-61页

作者：刘春雨王馨于传飞徐刚领王兰中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室卫生部生物技术产品检定方法及标准化重点实验室北京102629 福建省医疗器械与药品包装材料检验所福州350001

目的:利用转基因细胞法建立抗人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)单抗的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)生物学活性检测方法。方法:利用Jurkat-hFcγRⅢa-NFAT转基因细胞系作为效应细胞,SKBR3细胞系作为靶细胞,通过荧光素酶检测系统(BioGloTM Luciferase Assay system)进行抗HER2单抗的ADCC生物学活性检测,同时对试验条件进行优化及方法学验证,并将该检测方法用于不同类型的抗HER2单抗ADCC效应的评价。结果:抗HER2单抗在该方法中存在量效关系,且符合四参数方程式:y=(A-D)/[1+(x/C)~B]+D,方法经优化后确定靶细胞为SKBR3细胞,抗体稀释起始工作质量浓度为4 000 ng·mL^(-1),1∶4倍的稀释倍数,效靶比为15∶1,诱导时间为20 h。该方法具有良好的专属性;3次独立检测的板间、日间最大诱导倍数(fold of induction,FI)及半数有效浓度(concentration for 50%of maximal effect,EC50)的RSD均小于10%; 4个不同稀释组回收率样本经3次测定,相对效价分别为(46.27±2.01)%、(71.18±1.55)%、(133.17±9.91)%以及(166.55±15.73)%;对应的回收率分别为(92.53±4.01)%、(94.91±2.07)%、(106.54±7.93)%、(111.04±10.48),RSD均小于10%,且该方法也适用于不同变性程度及各类抗HER2单抗的ADCC效应评价。结论:本研究利用转基因细胞法成功建立抗HER2单抗ADCC生物学活性检测方法,该方法专属性强、重复性好,准确性高,可作为抗HER2单抗ADCC生物学活性的常规检测方法。

关键词：抗人表皮生长因子受体2单克隆抗体抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用生物学活性荧光素酶检测系统报告基因

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糖基化修饰对重组CTLA4-Ig稳定性影响的研究

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药物分析杂志 2019年第1期39卷 70-77页

作者：朱磊单改仙王兰火箭军总医院特勤医学科北京100088 解放军第306医院放疗科北京100101 中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室卫生部生物技术产品检定方法及标准化重点实验室北京102629

目的:探讨糖基化修饰对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4抗体融合蛋白(CTLA4-Ig)融合蛋白稳定性的影响。方法:应用多种糖苷酶N-糖苷酶F(PNGase F)、内切糖苷酶F2(EndoF2)、唾液酸酶(neuraminidase)和O-糖苷酶(O-glycosidase)对样品进行处理... 详细信息

目的:探讨糖基化修饰对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4抗体融合蛋白(CTLA4-Ig)融合蛋白稳定性的影响。方法:应用多种糖苷酶N-糖苷酶F(PNGase F)、内切糖苷酶F2(EndoF2)、唾液酸酶(neuraminidase)和O-糖苷酶(O-glycosidase)对样品进行处理。通过分子排阻色谱(SEC)测定不同酶切时间处理后样品纯度变化;应用差示扫描荧光(DSF)测定样品整体热力学参数的变化;应用差示扫描量热(DSC)测定样品各结构域热力学参数变化;在45℃条件下加热,分别于0、1、3、5、7、9、11和12周取样,通过SEC测定样品纯度的变化。结果:在N-糖苷酶F、内切糖苷酶F2和唾液酸酶分别处理过程中,CTLA4-Ig的聚体含量逐渐增加,而O-糖苷酶酶切过程中,聚体虽无明显变化,但碎片含量逐渐增加;经DSF测定,N-糖苷酶F和内切糖苷酶F2处理后解链温度(T_m)均明显下降,而唾液酸酶和O-糖苷酶处理后T_m无明显变化;经DSC测定,N-糖苷酶F和内切糖苷酶F2处理后T_m1下降,T_m2不变,T_m3上升,而唾液酸酶处理后T_m1和T_m3都略微有所上升,T_m2基本不变,O-糖苷酶处理后T_m值均变化;加速试验过程中,N-糖苷酶F和唾液酸酶处理样品的聚体上升,内切糖苷酶F2处理样品的的聚体不变;O-糖苷酶处理样品的的聚体不变,而碎片偏高。结论:通过多种分析手段研究发现,糖基化修饰与CTLA4-Ig的稳定性密切相关。

关键词：细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4抗体融合蛋白融合蛋白单抗类药物糖基化修饰稳定性 N-糖基化 O-糖基化

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抗CD52单克隆抗体ADCC转基因测活方法的建立

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微生物学免疫学进展 2019年第5期47卷 27-33页

作者：刘春雨于传飞崔永霏肖启东黄璟王兰中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室卫生部生物技术产品检定方法及标准化重点实验室

目的建立转基因细胞法测定抗CD52单克隆抗体(单抗)的抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)生物学活性检测方法。方法 ①以Ramos细胞系作为靶细胞,以Jurkat-hFcγRⅢa/FcεRIγ-NFAT转基... 详细信息

目的建立转基因细胞法测定抗CD52单克隆抗体(单抗)的抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC)生物学活性检测方法。方法 ①以Ramos细胞系作为靶细胞,以Jurkat-hFcγRⅢa/FcεRIγ-NFAT转基因细胞系作为效应细胞,通过荧光素酶检测系统(Bright-GloTM luciferase Assay System)建立抗CD52单抗的ADCC生物学活性检测方法;②对靶细胞、量效范围、效靶比及诱导时间进行优化并进行方法学验证;③研究建立的方法应用于对不同抗CD52单抗的ADCC生物学活性检测。结果建立抗CD52单抗的ADCC生物学活性检测方法,抗CD52单抗在该方法中存在量效关系,符合四参数方程:y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D;经优化后确定抗体量效范围为起始质量浓度360μg/mL,4倍系列稀释9个稀释度;效靶比为3∶1,诱导时间为6.0h;该方法具有良好的专属性;4个不同稀释组回收率样品经3次测定,相对效价分别为(45.58±4.67)%、(71.61±9.45)%、(122.92±7.92)%和(149.94±14.58)%;对应的回收率分别为(91.16±9.34)%、(95.49±12.60)%、(98.34±6.34)%和(99.96±9.72)%,上述结果的变异系数(coefficientofvariation,CV)均小于15%;且该方法也适用于不同抗CD52单抗的ADCC效应评价。结论利用转基因细胞法成功建立了抗CD52单抗ADCC生物学活性检测方法,该方法专属性强、准确性高、重复性好,可用于评价抗CD52单抗的ADCC生物学活性。

关键词：抗CD52单克隆抗体单克隆抗体抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用生物学活性报告基因

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微流数字成像技术在单克隆抗体不溶性微粒检测中的应用

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中国药学杂志 2018年第1期53卷 58-63页

作者：郭莎曹俊霞于传飞张峰高凯王兰中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室卫生部生物技术产品检定及标准化重点实验室北京100050

目的探讨微流数字成像技术(microflow digital imaging,MDI)在单克隆抗体(单抗)不溶性微粒检测中的应用价值。方法本实验首先采用聚苯乙烯乳胶微粒作为标准颗粒,研究了MDI方法的稳定性和准确性,之后采用MDI技术对两组单抗中≥10μm和≥2... 详细信息

目的探讨微流数字成像技术(microflow digital imaging,MDI)在单克隆抗体(单抗)不溶性微粒检测中的应用价值。方法本实验首先采用聚苯乙烯乳胶微粒作为标准颗粒,研究了MDI方法的稳定性和准确性,之后采用MDI技术对两组单抗中≥10μm和≥25μm不溶性微粒的总数进行检测并对其微粒组成进行分析。一组为3家企业针对表皮生长因子受体(EGFR)靶点单抗,分析其不溶性微粒的组成与分布情况。另一组为某企业肿瘤坏死因子-α(TNF-α)靶点的单抗分别在4℃、37℃及6 000 lx光照条件下储存后的样品,观察不同储存条件对蛋白稳定性的影响。结果 MDI法对聚苯乙烯标准颗粒表现出较好的稳定性和准确性。通过对不溶性微粒的组成分析发现针对EGFR的单抗中,企业1和企业2不溶性微粒数量相当,但在非蛋白颗粒与蛋白颗粒占比上明显不同,企业3不溶性微粒数量远远大于企业1与企业2,且蛋白颗粒与非蛋白颗粒含量均较高,提示3家企业应采取不同策略控制不溶性微粒。通过对某企业TNF-α靶点的单抗在不同条件储存后的不溶性微粒进行分析发现,37℃及6 000 lx光照条件下储存后的样品蛋白颗粒数量急剧增加,说明储存条件对单抗中蛋白的稳定性有较大影响。结论 MDI技术不但能提供不溶性微粒粒径与数量的信息,还能提供形态和类别的信息,为不溶性微粒的控制以及单抗质量的提高提供依据。

关键词：微流数字成像技术单克隆抗体不溶性微粒光阻法

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基于毛细管区带电泳的IgG2型单抗电荷异质性分析方法的建立

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中国药学杂志 2018年第8期53卷 627-631页

作者：王文波于传飞张峰武刚高凯王兰中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室卫生部生物技术产品检定及标准化重点实验室北京100050

目的建立IgG2型单抗毛细管区带电泳(CZE)电荷异质性分析方法。方法通过对三乙基四胺(TETA)和6-氨基己酸(EACA)浓度,以及电泳缓冲液pH和毛细管分离温度等参数进行优化,建立能够有效分离和定量IgG2单抗电荷异构体的CZE分析方法,并对该方... 详细信息

目的建立IgG2型单抗毛细管区带电泳(CZE)电荷异质性分析方法。方法通过对三乙基四胺(TETA)和6-氨基己酸(EACA)浓度,以及电泳缓冲液pH和毛细管分离温度等参数进行优化,建立能够有效分离和定量IgG2单抗电荷异构体的CZE分析方法,并对该方法进行方法学验证和应用评价。结果 TETA和EACA浓度,以及电泳缓冲液pH和毛细管分离温度的变化,会影响IgG2单抗的电荷异构体分离效果,通过一系列参数的优化,最终确定了方法参数(400 mmol·L^(-1)EACA/0.05%TETA,pH 6.2,分离电压30 kV,分离温度35℃)。建立的CZE分析方法可以有效地对IgG2单抗电荷异构体进行分离,并具有良好的精密度,峰面积的RSD值小于3.0%。该方法同样适用于IgG1和IgG4型单抗的电荷异质性分析,同时,根据电泳图谱和迁移时间,能够对不同亚型和靶点的单抗进行有效的区分鉴别。结论建立的IgG2型单抗毛细管区带电泳方法,可有效分离电荷异构体,并具有良好的精密度,可作为平台方法应用于IgG2型单抗的电荷异质性分析和鉴别。

关键词： IgG2单抗电荷异质性毛细管区带电泳方法优化质量控制

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超高效液相色谱串联Qda质谱法检测单抗N糖的研究

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中国药学杂志 2018年第3期53卷 223-227页

作者：王文波于传飞张峰徐刚领高凯王兰中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室卫生部生物技术产品检定及标准化重点实验室北京100050

目的利用超高效液相色谱串联Qda质谱法对单抗的N糖谱进行定性和定量分析。方法对单抗Fc上的N糖链利用糖苷酶F进行酶切释放,然后用Rapi Fluor-MS染料进行标记,通过Qda质谱对N糖进行糖型鉴别、荧光检测器进行定量检测。结果超高效液相色... 详细信息

目的利用超高效液相色谱串联Qda质谱法对单抗的N糖谱进行定性和定量分析。方法对单抗Fc上的N糖链利用糖苷酶F进行酶切释放,然后用Rapi Fluor-MS染料进行标记,通过Qda质谱对N糖进行糖型鉴别、荧光检测器进行定量检测。结果超高效液相色谱串联Qda质谱法能够准确的对单抗N糖进行定性定量检测,单个糖型的实测m/z值在理论值±0.5内。利用该方法对原研抗CD20人鼠嵌合单抗和生物类似药候选药物的N糖进行分析表明,3个候选药物的N糖谱与原研抗体基本一致,但在部分糖型种类和比例上存在一定的差异,总的岩藻糖修饰糖型比例基本一致。对CHO细胞、NS0细胞和SP2/0细胞表达的单抗N糖进行比对分析显示,3种细胞表达单抗的主要糖型为G0F-N、G0F、Man5、G1Fa、G1Fb和G2F,占总糖型比例的80%以上。相比于NS0细胞和SP2/0细胞,CHO细胞表达抗体糖型种类相对较为简单,共11种糖型。而NS0细胞和SP2/0细胞表达单抗糖型种类和结构较复杂,分别检测到22和26种糖型,其中含有多种复杂的唾液酸和半乳糖修饰糖型,虽然这些糖型所占比例较低,但可能与单抗的体内半衰期和免疫原性相关。结论超高效液相色谱串联Qda质谱法作为快速准确的N糖分析方法,可应用于单抗N糖的质控研究中。

关键词：单克隆抗体 N糖基化修饰 Qda质谱生物类似药抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用

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一种新的抗肿瘤靶点-CD47

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药物分析杂志 2018年第7期38卷 1099-1105页

作者：郭莎于传飞张峰刘春雨李萌王文波付志浩俞小娟王兰中国食品药品检定研究院单克隆抗体产品室卫生部生物技术产品检定及标准化重点实验室北京100050

肿瘤细胞可以通过多种途径逃避机体免疫系统的识别和清除,如诱导免疫抑制的肿瘤微环境,降低肿瘤细胞的免疫原性等;其中,肿瘤细胞逃避天然免疫系统如巨噬细胞等吞噬细胞清除的机制之一是上调细胞表面"别吃我"(don’t eat me)... 详细信息

肿瘤细胞可以通过多种途径逃避机体免疫系统的识别和清除,如诱导免疫抑制的肿瘤微环境,降低肿瘤细胞的免疫原性等;其中,肿瘤细胞逃避天然免疫系统如巨噬细胞等吞噬细胞清除的机制之一是上调细胞表面"别吃我"(don’t eat me)信号的表达。整合素相关蛋白(IAP,即CD47)便是一种重要的自我信号,它通过与巨噬细胞上的配体信号调节蛋白α(SIRPα)结合,进而抑制巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬;此外,在天然免疫细胞如树突状细胞等向适应性免疫T细胞提呈抗原的过程中,CD47也发挥着抑制作用。因此,CD47在肿瘤免疫中发挥着重要的调节作用,靶向CD47是一个潜在的抗肿瘤方向。本文对CD47的抗肿瘤作用进行了详述,包括分子结构、信号转导、调节吞噬与促凋亡作用及成药性考虑等。

关键词：整合素相关蛋白信号调节蛋白α 凝血酶致敏蛋白1 免疫治疗吞噬作用抗原提呈联合用药

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