检索结果-内蒙古大学图书馆

中国生物制品学杂志 2023年第7期36卷 826-832,838页

作者：于雷王光裕裴德宁安怡方史新昌周勇中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的建立双重数字PCR(digital PCR,dPCR)法评价Luc2P系列报告基因细胞系(CHO-K1、Hacat、HEK293和UT7)的萤光素酶(luciferase,Luc)基因稳定性。方法提取Luc2P系列报告基因细胞系的基因组DNA,建立一种双重dPCR法,同时检测内参基因RPP3... 详细信息

目的建立双重数字PCR(digital PCR,dPCR)法评价Luc2P系列报告基因细胞系(CHO-K1、Hacat、HEK293和UT7)的萤光素酶(luciferase,Luc)基因稳定性。方法提取Luc2P系列报告基因细胞系的基因组DNA,建立一种双重dPCR法,同时检测内参基因RPP30和目标基因Luc的拷贝数,以Luc相对拷贝数(copies Luc/copy RPP30)为指标评价Luc基因稳定性;参考《中国药典》三部(2020版)相关要求对建立的方法进行专属性、精密性、线性、准确性和耐用性验证,并分析方法的适用性。结果未转染报告基因的原始细胞检测结果均为阴性,而4种报告基因细胞系中均可检测到阳性结果,且dPCR结果中阴性和阳性区可明显区分;以相对拷贝数为指标,采用芯片式dPCR法重复检测8次同一基因组DNA样品以及同一细胞6次独立提取的基因组DNA样品的相对标准偏差(RSD)均小于10%,Luc和RPP30的线性拟合R~2均大于0.99,建立的方法检测5组加标样本的加标回收率在50%~100%之间,且芯片式dPCR和液滴式dPCR检测结果一致。该方法可区分不同细胞克隆的Luc相对拷贝数,检测3个代次(P8、P12、P31)细胞Luc相对拷贝数的结果高度一致。结论建立的双重dPCR法专属性、精密性、线性、准确性、耐用性和适用性良好,可用于Luc2P系列报告基因细胞系的Luc基因稳定性评价。

关键词：报告基因细胞系萤光素酶稳定性双重数字PCR

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慢病毒载体整合位点检测方法的系统适应性对照品初步研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2023年第10期43卷 791-801页

作者：周小雅贾芳英吴雪伶张可华孟淑芳中国食品药品检定研究院生物制品检定所细胞资源保藏研究中心国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的评估8E5细胞和CD19-CAR-Jurkat细胞作为慢病毒载体整合位点检测方法的系统适应性对照品的可行性。方法选择8E5细胞和CD19-CAR-Jurkat细胞,通过有限稀释法挑选单克隆;建立数字PCR法检测8E5细胞内HIV-1的拷贝数和CD19-CAR-Jurkat细胞... 详细信息

目的评估8E5细胞和CD19-CAR-Jurkat细胞作为慢病毒载体整合位点检测方法的系统适应性对照品的可行性。方法选择8E5细胞和CD19-CAR-Jurkat细胞,通过有限稀释法挑选单克隆;建立数字PCR法检测8E5细胞内HIV-1的拷贝数和CD19-CAR-Jurkat细胞内CAR的拷贝数;采用高通量测序技术(全基因组重测序法、改良的基因组测序法和探针杂交捕获法)对8E5细胞和CD19-CAR-Jurkat细胞的整合位点进行检测,并采用光学基因组图谱技术(optical genome mapping,OGM)对整合位点进行确认。结果经有限稀释法,挑选出3个8E5细胞克隆和6个CD19-CAR-Jurkat细胞克隆。通过数字PCR及流式细胞术检测基因拷贝数,确定8E5-D8和CD19-CAR-Jurkat 2-6作为候选细胞,并扩增冻存。数字PCR检测结果显示,8E5-D8细胞含有约1拷贝/细胞,CD19-CAR-Jurkat 2-6细胞含有约13拷贝/细胞;高通量测序结果显示,8E5-D8细胞有1个整合位点,CD19-CAR-Jurkat 2-6细胞有13个整合位点,与拷贝数检测结果一致。这些整合位点均通过OGM法在染色体亚显微水平进一步得到确认。结论对8E5-D8细胞和CD19-CAR-Jurkat 2-6细胞的插入拷贝数及整合位点的鉴定结果表明,其可作为进一步研制CAR-T细胞慢病毒载体整合位点检测方法的系统适应性对照品。

关键词：慢病毒载体整合位点数字PCR 高通量测序光学基因组图谱技术

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酶联免疫法测定甘精胰岛素中单链前体残留研究

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中国药物警戒 2024年第3期21卷 290-294页

作者：张孝明吕萍胡馨月丁晓丽李晶梁成罡中国食品药品检定研究院化学药品检定所国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京102629

目的建立酶联免疫法检测甘精胰岛素中单链前体残留,为甘精胰岛素药物质量控制和安全性评价提供新方法。方法采用双抗夹心酶联免疫法,以甘精胰岛素原为标准品,建立单链前体残留检测方法,验证方法的重复性、准确度、范围和精密度,并应用... 详细信息

目的建立酶联免疫法检测甘精胰岛素中单链前体残留,为甘精胰岛素药物质量控制和安全性评价提供新方法。方法采用双抗夹心酶联免疫法,以甘精胰岛素原为标准品,建立单链前体残留检测方法,验证方法的重复性、准确度、范围和精密度,并应用该方法检测9批甘精胰岛素原料药。结果在0.156~10.00 ng·mL^(-1)浓度范围内,对甘精胰岛素原标准品进行四参数曲线拟合,曲线相关系数R~2大于0.99,方法准确度较高、重复性良好。重复检测3批甘精胰岛素原料药,平均加标回收率在104%~113%范围内,RSD%小于10%,方法精密度良好。9批样品中单链前体残留量均小于1 ng·mg^(-1)。结论建立的酶联免疫法可用于甘精胰岛素及其他重组人胰岛素类似物中单链前体残留量的质量控制和安全性评价。

关键词：酶联免疫法甘精胰岛素单链前体 C肽质量控制方法学验证安全性回收率

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重组5型腺相关病毒基因组滴度测定用国家标准品的研制

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中国生物制品学杂志 2023年第4期36卷 429-433页

作者：郑红梅于雷李永红史新昌安怡方郭莹韩春梅饶春明周勇中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的研制重组5型腺相关病毒(recombinant type 5 adeno-associated virus,rAAV5)基因组滴度测定用国家标准品。方法对三质粒系统制备的rAAV5-GFP原液,按《中国药典》三部(2020版)相关要求进行鉴别、外观、pH、无菌、基因组滴度、纯度、... 详细信息

目的研制重组5型腺相关病毒(recombinant type 5 adeno-associated virus,rAAV5)基因组滴度测定用国家标准品。方法对三质粒系统制备的rAAV5-GFP原液,按《中国药典》三部(2020版)相关要求进行鉴别、外观、pH、无菌、基因组滴度、纯度、感染滴度等检定,根据结果稀释、分装,制备成候选标准品;采用热加速试验对候选标准品进行稳定性考察;组织3家实验室,采用微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)法对候选标准品进行协作标定。结果候选标准品原液及候选标准品的各项检测指标均符合相关要求;在25、4、-20、-40、-80℃条件下,1、3、4、6个月基因组滴度均无明显下降;经3家实验室协作标定,候选标准品赋值为2.56×10^(12)copies/mL,95%置信区间为2.48×1012~2.64×10^(12)copies/mL。结论研制的rAAV5基因组滴度测定用国家标准品具有良好的稳定性,可用于rAAV5相关产品的质量评价。

关键词：重组5型腺相关病毒微滴式数字PCR 基因组滴度协作标定国家标准品

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中国脑膜炎球菌疫苗发展现状与挑战

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中国公共卫生 2022年第7期38卷 948-951页

作者：徐颖华李亚南叶强中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京102629

接种疫苗是预防流行性脑脊髓膜炎(流脑)最有效、最经济的方法,在过去几十年,随着疫苗的广泛使用,流脑发病率显著下降。目前在中国上市的疫苗主要包括A、C、W、Y群单价和多价多糖脑膜炎球菌疫苗(MPV),A、C群多糖脑膜炎球菌结合疫苗(MPCV-... 详细信息

接种疫苗是预防流行性脑脊髓膜炎(流脑)最有效、最经济的方法,在过去几十年,随着疫苗的广泛使用,流脑发病率显著下降。目前在中国上市的疫苗主要包括A、C、W、Y群单价和多价多糖脑膜炎球菌疫苗(MPV),A、C群多糖脑膜炎球菌结合疫苗(MPCV-AC)以及A、C群脑膜炎球菌多糖结合b型流感嗜血杆菌结合联合疫苗(MPCV-AC-hib)。纵观我国脑膜炎球菌疫苗近50年的发展历程,在疫苗生产、质量控制以及相关研究方面均取得了显著成绩,但仍然面临着流脑疾病负担被低估、脑膜炎球菌疫苗免疫策略尚未完善、不同厂家脑膜炎球菌疫苗免疫程序不统一、无B群脑膜炎球菌疫苗上市等问题和挑战,为此应不断提高流脑监测手段及系统开展流脑疾病负担评价的研究以助力我国脑膜炎球菌疫苗免疫策略和免疫程序的完善,并针对流脑血清群高度可变和易发生抗原漂移的特性通过基因重组等技术研发出免疫力更长、保护效果更好的可预防所有血清群流脑的通用性疫苗。

关键词：流行性脑脊髓膜炎(流脑) 脑膜炎球菌疫苗发展挑战中国

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应用SEC-UV-MALS-RI技术分析重组腺相关病毒(rAAV)的颗粒滴度和实心率

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药物分析杂志 2023年第11期43卷 1840-1846页

作者：李响史新昌王恒韩春梅秦玺周勇中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050 美国怀雅特技术公司北京100089

目的:建立分子排阻色谱(SEC)串联紫外检测器(UV)、多角度激光散射检测器(MALS)和示差检测器(RI)的方法分析重组腺相关病毒(rAAV)的颗粒滴度和实心率。方法:对rAAV、rAAV空壳对照品和二者混合样品进行SEC-UV-MALS-RI串联分析,流动相为50 ... 详细信息

目的:建立分子排阻色谱(SEC)串联紫外检测器(UV)、多角度激光散射检测器(MALS)和示差检测器(RI)的方法分析重组腺相关病毒(rAAV)的颗粒滴度和实心率。方法:对rAAV、rAAV空壳对照品和二者混合样品进行SEC-UV-MALS-RI串联分析,流动相为50 mmol·L^(-1)磷酸盐缓冲液,流速为0.3 mL·min^(-1),进样量为50μL,温度为室温,采集时间为30 min;紫外检测器选择260 nm和280 nm双通道;18角度激光散射检测和示差检测采用系统默认设置;用WYATT软件分析结果。结果:样品颗粒滴度为4.816×10^(12)vp·mL^(-1),RSD为0.37%;空壳对照品颗粒滴度为3.199×10^(12)vp·mL^(-1),RSD为0.75%。按不同预设比例混合的5份样品颗粒滴度的RSD均在3%以内,实心率RSD均在4%以内。混合样品的颗粒滴度和实心率测定结果与预期值基本一致。结论:采用SEC-UV-MALS-RI方法可以分析rAAV制品的颗粒滴度、实心率等项目,适用于rAAV制品颗粒滴度和实心率的质量控制。

关键词：分子排阻色谱多角度激光散射重组腺相关病毒滴度实心率聚体含量

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基于甲型流感病毒血凝素及联用其他保守表位的通用流感疫苗研究进展

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中华微生物学和免疫学杂志 2023年第11期43卷 813-822页

作者：邓玉莹刘书珍李岚舒赵晨燕黄维金中国食品药品检定研究院生物制品检定所艾滋病性病病毒疫苗室国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法与标准化重点实验室北京102629

流感病毒每年造成大量感染及死亡病例,对人类健康构成重大威胁,接种疫苗是预防流感病毒感染的最有效措施。然而,目前的季节性流感疫苗只能预防密切匹配的流行毒株,即使有了广泛的监测和每年的重新制定,每年更新的疫苗仍然比快速演变的... 详细信息

流感病毒每年造成大量感染及死亡病例,对人类健康构成重大威胁,接种疫苗是预防流感病毒感染的最有效措施。然而,目前的季节性流感疫苗只能预防密切匹配的流行毒株,即使有了广泛的监测和每年的重新制定,每年更新的疫苗仍然比快速演变的病毒落后一步,往往导致匹配度不高或疫苗效力低。由于甲型流感病毒的进化变异相对复杂,利用一系列创新技术开发通用流感疫苗对流感病毒提供广泛和持久的保护,是预防流感流行的新思路和新手段。本文对近3年来以血凝素(hemagglutinin,HA)为靶位的通用疫苗研究进行全面整理,综述了基于流感病毒全HA、HA茎部、串联HA和其他保守表位的通用疫苗设计方法及其在疫苗研究中取得的最新进展,同时比较了不同技术优劣和免疫程序及策略的影响等,并强调了有待克服的潜在挑战,为成功开发通用疫苗提供经验和借鉴。

关键词：甲型流感病毒血凝素保守表位通用流感疫苗

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利用高分辨质谱技术综合解析胰岛素类制品复杂二硫键结构

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药学学报 2024年第1期59卷 188-197页

作者：胡馨月丁晓丽孙悦张慧李晶梁成罡中国食品药品检定研究院激素室国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室北京102629

二硫键的正确配对维持了多肽和蛋白类药物的正确折叠方式和高级结构的形成,对产品的质量控制至关重要。为了确保二硫键正确配对,二硫键分析是多肽和蛋白质药物表征中必不可少的重要部分。质谱分析技术可用于二硫键分析,然而,胰岛素及其... 详细信息

二硫键的正确配对维持了多肽和蛋白类药物的正确折叠方式和高级结构的形成,对产品的质量控制至关重要。为了确保二硫键正确配对,二硫键分析是多肽和蛋白质药物表征中必不可少的重要部分。质谱分析技术可用于二硫键分析,然而,胰岛素及其类似物中存在两对没有酶切位点的二硫键,常规的碰撞诱导解离(CID)和高能诱导裂解(HCD)无法实现该复杂二硫键的准确定位。本研究通过3种方法综合定位该复杂二硫键,包括酶切加关键肽段源内碎裂(ISD)法、酶切加部分还原烷基化法、完整蛋白源内碎裂和电子转移解离(ETD)裂解法,并且考察了门冬胰岛素、赖脯胰岛素和甘精胰岛素的适用性,为胰岛素及其类似物二硫键连接方式的质量控制提供了新途径,也为含该类复杂二硫键多肽或蛋白类生物制品的二硫键定位提供借鉴。

关键词：胰岛素及其类似物二硫键定位部分还原烷基化源内碎裂电子转移裂解

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双检测器串联测定聚乙二醇化人生长激素平均修饰率方法研究

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药学学报 2024年第12期59卷 3367-3373页

作者：李懿张孝明胡馨月孙悦王绿音陈度宇吕萍梁成罡李晶中国食品药品检定研究院激素室药品监管科学全国重点实验室国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室国家卫生健康委生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京102629

按照各监管机构的要求,聚乙二醇(PEG)平均修饰率是PEG化蛋白类药物表征与质量控制中的关键属性。本研究基于“PEG化蛋白的示差信号及紫外信号等于该偶联蛋白中PEG和蛋白部分各自处于未偶联状态单独存在时所产生相应信号之和”的基本假设... 详细信息

按照各监管机构的要求,聚乙二醇(PEG)平均修饰率是PEG化蛋白类药物表征与质量控制中的关键属性。本研究基于“PEG化蛋白的示差信号及紫外信号等于该偶联蛋白中PEG和蛋白部分各自处于未偶联状态单独存在时所产生相应信号之和”的基本假设,通过进样20μL的1 mg·mL^(-1)人生长激素(hGH)对照品、2 mg·mL^(-1) PEG对照品和1 mg·mL^(-1) PEG化hGH原液样品,经分子排阻色谱柱分离,测定各溶液在紫外和示差检测器下产生的信号按照推导的公式计算,成功建立了基于分子排阻色谱紫外示差双检测器串联技术的PEG化hGH (怡培生长激素)平均修饰率测定方法,该法专属性良好,重复性良好(RSD=0.63%,n=9),与同时建立的经典酸水解法结果比较,回收率为100.0%,准确性良好。该法操作简单,可及性好,适用于本品PEG平均修饰率质量控制检测。

关键词：分子排阻色谱紫外示差串联检测聚乙二醇化人生长激素平均修饰率

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利用Nb2-11细胞建立PEG化重组人生长激素生物学活性测定方法

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药学学报 2023年第3期58卷 773-778页

作者：张孝明黄盈王绿音李懿李晶梁成罡中国食品药品检定研究院国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京102629 中国药科大学江苏南京211198

本研究利用Nb2-11细胞,通过实验条件参数优化和方法学验证,成功建立了测定聚乙二醇化重组人生长激素(PEG-rhGH)体外生物学活性分析方法,并用该方法开展了PEG-rhGH注射液相对效价检测。研究表明,PEGrhGH与Nb2-11细胞增殖存在量效关系且... 详细信息

本研究利用Nb2-11细胞,通过实验条件参数优化和方法学验证,成功建立了测定聚乙二醇化重组人生长激素(PEG-rhGH)体外生物学活性分析方法,并用该方法开展了PEG-rhGH注射液相对效价检测。研究表明,PEGrhGH与Nb2-11细胞增殖存在量效关系且符合四参数模型,用该方法检测PEG-rhGH的生物学活性准确度高、精密度好。以PEG-rhGH参比品为对照,对6批PEG-rhGH注射液进行相对效价测定,所得曲线线性、回归性和平行性均通过统计学检验,相对效价在95%~105%。本研究建立的PEG-rhGH生物学活性检测方法,可用于PEG-rhGH产品的质量控制。

关键词：聚乙二醇化重组人生长激素生物学活性质量控制方法学验证细胞增殖法

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