目的:建立基于细胞的抗EpCAM+CD3双特异性抗体（bispecific antibody,BsAb）生物学活性报告基因测定方法（reporter gene assay,RGA）。方法:构建稳定表达萤光素酶（luciferase,Luc）的HcT116-Luc细胞为靶细胞,以Hu T78细胞为效应细胞,通过对样品浓度、孵育时间、细胞接种时间、效靶比和细胞接种密度进行优化建立报告基因法,根据人用药品注册技术要求国际协调会（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use,ICH） Q2指导原则和《中华人民共和国药典》（2015）指导原则,对RGA法的特异性、准确性、精密度、线性、代次稳定性和耐用性进行验证。结果:建立RGA方法经优化后的检测条件:效靶比为10∶1;细胞接种密度为1.1×10～4细胞·孔-1; Bs Ab样品以3 000 ng·m L-1为起始浓度1∶3.5向下稀释9个浓度梯度（共10个检测浓度）;系列稀释样品与细胞孵育时间为72 h。孵育结束后测定Luc强度并以4-参数模式拟合剂量-效应曲线,计算样品相对生物学活性。建立RGA法的特异性、耐用性均符合应用要求。采用50%,70%,80%,100%,120%,130%,150%和200%共8个效价浓度进行准确性、精密度和线性验证,8个效价浓度的生物学活性回收率在95.48%～107.37%,变异系数（coefficient of variation,CV）在4.80%～9.97%,均<10%,实测效价与理论效价线性回归分析相关系数r2> 0.99。第14～33代次HcT116-Luc细胞Luc表达情况稳定。结论:基于传代细胞建立的抗EpCAM+CD3 Bs Ab报告基因生物学活性测定方法操作简便,其特异性、精密度、准确性、耐用性方面符合应用要求,可作为此类双特异性抗体活性评价的方法,用于其质量控制中。
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