目的:研究免疫细胞治疗产品EAL细胞在小鼠体内的分布特征,为其临床应用提供安全性依据。方法:活体成像检测:采用C57BL/6小鼠,分阴性对照组和供试品组,阴性对照组(尾静脉注射,iv)给予生理盐水,供试品组给予DiR标记的EAL细胞,iv单次给药,于3 h及1,3,6,9,15和21 d 7个时间点,麻醉动物后进行活体成像,检测DiR标记的细胞在小鼠体内的分布。流式细胞仪检测:采用C57BL/6小鼠,分阴性对照组和供试品组,阴性对照组给予非转基因鼠源的EAL细胞,供试品组给予GFP转基因鼠源的EAL细胞,iv单次给药,于3 h及1,3,6,9,15和21 d 7个时间点麻醉解剖,依次取外周血、脾脏、肝脏、肺脏、胸腺、淋巴结、肾脏、骨髓,流式细胞仪检测GFP+EAL细胞在上述组织器官中所占的比例及分布数量。结果:EAL细胞注射进入动物体内后,其分布水平在给药后3 h至给药后3 d处于较高水平,随时间延长分布水平逐步降低,在给药后d 21可以降低至约峰值的65%以上,分布较高的脏器为肝脏、肺脏、脾脏、淋巴结和外周血液,其他器官有少量分布;同时,流式细胞检测及活体成像检测结果具有较好的一致性。结论:EAL细胞回输小鼠后,在体内不会广泛分布和长期存续,具有较好的临床前安全性。
目的:研究槟榔碱在体外培养下对大鼠胚胎软骨发育的影响,从而探究槟榔碱的胚胎致畸性。方法:取受孕d 14大鼠胚胎肢芽,前肢芽利用微团培养技术进行体外培养,根据半数细胞增殖抑制浓度(IC50-P)和半数细胞分化抑制浓度(IC50-D)及其比值判定受试物的致畸性;利用离体器官技术培养后肢芽,随机分为空白对照(0 mg·mL-1槟榔碱)、低剂量(0.1 mg·mL-1槟榔碱)、中剂量(1 mg·mL-1槟榔碱)、高剂量(10 mg·mL-1槟榔碱)、阳性对照(100 ng·mL-15-氟尿嘧啶)5个实验组,分别在体外培养24,72和120 h后收获,在体视镜下进行形态学评分后,石蜡包埋、切片、HE染色和甲苯胺蓝染色观察细胞和软骨形态,并通过免疫组化技术研究槟榔碱对在各组软骨细胞骨形态发生蛋白2（BMP-2）表达的影响。结果:在微团模型中根据欧洲替代方法验证中心（European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM）预测模型判定槟榔碱为胚胎中晚期发育毒性化学物,为非特异性弱致畸物;在整体肢芽器官模型中,1 mg·mL-1（中剂量）及以上浓度的槟榔碱会对肢芽器官造成发育毒性,10 mg·mL-1（高剂量）从给药24 h后便能产生显著毒性,各剂量组在72 h培养后发育状况出现了显著的剂量相关性;从病理切片结果可以看出,槟榔碱会进一步影响增殖软骨细胞和肥大软骨细胞的增殖分化,从而影响肢芽指掌与肢臂的发育;在BMP-2表达的免疫组化结果中,BMP-2的表达强度呈现与槟榔碱剂量相关性,槟榔碱的剂量越大,阳性表达程度越低,反映软骨细胞增殖分化放缓。结论:大于1 mg·mL-1的槟榔碱在大鼠胚胎肢芽体外培养中有生长抑制作用,可初步认为槟榔碱对胚胎中后期发育具有弱致畸性,可能是通过影响BMP-2的表达来抑制软骨细胞的增殖分化。
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