检索结果-内蒙古大学图书馆

中国药品标准 2022年第3期23卷 229-235页

作者：史新昌秦玺于雷王光裕陶磊李响裴德宁李永红周勇中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050 北京可瑞生物科技有限公司北京102206

本文旨在为基因治疗产品研发者开展制品研发和生产等活动提供必要质量控制原则,适用于以病毒为载体的基因治疗制品,也适用于溶瘤病毒类制品。本文通过借鉴类似制品成熟的、有效的、实用性被证明的策略和方法阐述基因治疗制品质量控制生... 详细信息

本文旨在为基因治疗产品研发者开展制品研发和生产等活动提供必要质量控制原则,适用于以病毒为载体的基因治疗制品,也适用于溶瘤病毒类制品。本文通过借鉴类似制品成熟的、有效的、实用性被证明的策略和方法阐述基因治疗制品质量控制生物通用技术要求,希望对整个行业的发展提供帮助。基因治疗制品制造和质量控制应依照风险评估、全过程控制和全生命周期管理理念,以保障制品质量为最终目的,并通过对各个制造环节的控制实现制品的低安全风险的稳定生产。

关键词：基因治疗制品病毒载体生物制品生产质量控制原则通用技术要求

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U-2 OS细胞/CCK-8法测定1型单纯疱疹病毒溶瘤活性

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药物分析杂志 2020年第1期40卷 31-36页

作者：胡金盼李永红史新昌李响于雷郑红梅饶春明中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的:建立U-2 OS细胞/CCK-8比色法,用于测定1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)溶瘤活性。方法:选择3株对HSV-1敏感的的细胞株,在细胞培养板上以梯度浓度的HSV-1感染一定时间后,加入CCK-8进行显色,用酶标仪检测后采用... 详细信息

目的:建立U-2 OS细胞/CCK-8比色法,用于测定1型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)溶瘤活性。方法:选择3株对HSV-1敏感的的细胞株,在细胞培养板上以梯度浓度的HSV-1感染一定时间后,加入CCK-8进行显色,用酶标仪检测后采用四参数曲线法进行量效关系拟合。在选择出量效关系最好的细胞株基础上,对方法的各项实验条件进行优化,并采用活性测定标准品对结果进行校正分析。对建立的方法初步验证准确性和精密度,并用上述方法对3批样品的溶瘤活性进行检测。结果:优化后的实验采用U-2 OS细胞株,1∶4的样品系列稀释比例,5×10^4 PFU·mL^-1的样品系列稀释初始浓度,每孔2.5×10^4个细胞的铺板数量,72 h感染时间和4 h CCK-8试剂反应时间等条件进行样品测定,得到的四参数方程拟合的量效关系曲线R^2大于0.99,信噪比较高,初步验证结果显示该方法的回收率为113.4%,日间精密度分析的几何变异系数(GCV)为21.8%。3批测试样品的溶瘤活性分别为3.52×10^3、3.93×10^4和1.61×10^5 U·mL^-1。结论:建立的U-2 OS细胞/CCK-8法可用于以HSV-1为载体的基因治疗药物溶瘤活性测定。

关键词： 1型单纯疱疹病毒(HSV-1) 溶瘤活性标准品校正量效关系拟合四参数曲线法 U-2 OS细胞 CCK-8显色法

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基因治疗产品中病毒颗粒的微粒特性研究

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药物分析杂志 2020年第1期40卷 62-69页

作者：于雷裴德宁王光裕胡金盼李永红饶春明中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的:研究基因治疗产品中病毒颗粒的微粒特性及粒径分布情况。方法:采用扫描电镜、动态光散射法、微流数字成像法、光阻法及目测法对腺病毒(adenovirus,AdV)、腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)和单纯疱疹病毒(herpes simplex vir... 详细信息

目的:研究基因治疗产品中病毒颗粒的微粒特性及粒径分布情况。方法:采用扫描电镜、动态光散射法、微流数字成像法、光阻法及目测法对腺病毒(adenovirus,AdV)、腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)和单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)基因治疗产品中病毒颗粒的微粒特性、粒径分布及制剂外观进行观察研究。结果:扫描电镜结果显示,AdV、AAV、HSV均存在不完整颗粒(空心病毒颗粒、衣壳碎片),HSV病毒存在包膜脱落或融合的情况;动态光散射法结果显示AdV对温度敏感,易形成聚集体,AAV的粒径分布不均一,变异度大,HSV实测粒径偏大且分布不均一;微流数字成像法、光阻法及目测法结果提示样品中存在的50μm以上的微粒,与典型的蛋白聚集体形态相似,且50μm以上的颗粒数与液体的浊度呈正相关,100μm以上颗粒与絮状沉淀物相关。结论:不同病毒的微粒特性也不相同,微粒分布情况及动态变化过程与聚集体的形成有关,可采用多种方法优势互补,对微粒进行全范围监测。

关键词：基因治疗产品病毒颗粒微粒特性聚集体不溶性微粒可见异物

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基因治疗产品的质量控制分析方法及研究进展

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药物分析杂志 2020年第1期40卷 4-12页

作者：李永红毕华秦玺饶春明中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

基因治疗产品近年来已成为国内外药物研发的热点。对研发阶段的基因治疗产品开展质量研究,建立相应的质量控制方法和质量标准,是产品安全、有效的重要保证和产业化进程中的重要环节之一。基因治疗产品的质量控制项目包括鉴别、含量、效... 详细信息

基因治疗产品近年来已成为国内外药物研发的热点。对研发阶段的基因治疗产品开展质量研究,建立相应的质量控制方法和质量标准,是产品安全、有效的重要保证和产业化进程中的重要环节之一。基因治疗产品的质量控制项目包括鉴别、含量、效价、纯度、杂质和其他常规检测项目等。本文较为详细地介绍了在各种基因治疗产品中这些质控项目可采用的分析方法。对于新型基因治疗产品,迫切需要研究适当的分析方法进行有效的质量控制,而已批准上市或进入临床研究产品的质控方法和标准则需要进一步的提高和完善。

关键词：基因治疗产品质量控制质量标准分析方法安全性有效性鉴别试验含量效价纯度杂质

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牛痘病毒粒细胞巨噬细胞集落刺激因子注射液的生物学活性测定方法研究

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药物分析杂志 2020年第1期40卷 52-57页

作者：毕华裴德宁丁有学刘兰史新昌韩春梅李永红饶春明中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的:建立牛痘病毒粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(vaccinia virus/GM-CSF)注射液的生物学活性测定方法。方法:采用噬斑法进行感染滴度测定,结合定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)进行病毒基因组滴度/感染... 详细信息

目的:建立牛痘病毒粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(vaccinia virus/GM-CSF)注射液的生物学活性测定方法。方法:采用噬斑法进行感染滴度测定,结合定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)进行病毒基因组滴度/感染滴度测定;采用TF-1细胞增殖法,四参数方程拟合处理试验数据,检测不同浓度梯度的样品感染Hela细胞后表达的GM-CSF生物学活性;采用ELISA法,二次方程拟合处理试验数据,检测不同浓度梯度样品感染Hela细胞后的GM-CSF的表达量;采用ELISA法进行β半乳糖苷酶活性测定;采用肿瘤细胞(UACC 257)和正常细胞(GM 00038)进行溶瘤活性测定。结果:测定了1批牛痘病毒粒细胞巨噬细胞集落刺激因子注射液,其病毒感染滴度为6.5×10^8 PFU·mL^-1,病毒基因组滴度/感染滴度为27,各浓度梯度孔GM-CSF表达量均大于10 pg,GM-CSF生物学活性为181 rGCU,溶瘤活性为144 rOnU,β-半乳糖苷酶活性为124 rBU。结论:对牛痘病毒GM-CSF注射液的生物学活性进行了相对全面的测定,各个项目均符合规定,能够用于该产品的质量控制,同时对同类产品的质量控制具有借鉴意义。

关键词：牛痘病毒粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) 生物学活性感染滴度溶瘤活性 β-半乳糖苷酶活性 GM-CSF的表达量基因治疗质量控制

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聚乙二醇化重组人促红素不同位点修饰率的测定

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药物分析杂志 2020年第9期40卷 1697-1701页

作者：陶磊史新昌李响韩春梅周勇饶春明中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的:测定聚乙二醇化重组人促红素(PEG-EPO)中不同修饰位点的修饰率。方法:将重组促红素(EPO)及PEG-EPO样品分别用Lys-C蛋白酶进行酶切,在含0.1%三氟乙酸的流动相体系下液质联用测定液质肽图;通过质谱鉴定各肽段,在215 nm波长采集的肽... 详细信息

目的:测定聚乙二醇化重组人促红素(PEG-EPO)中不同修饰位点的修饰率。方法:将重组促红素(EPO)及PEG-EPO样品分别用Lys-C蛋白酶进行酶切,在含0.1%三氟乙酸的流动相体系下液质联用测定液质肽图;通过质谱鉴定各肽段,在215 nm波长采集的肽图中积分计算各肽段的峰面积百分比;根据EPO及PEG-EPO肽图中对应肽段峰面积百分比的变化,利用软件计算各位点的修饰率。结果:所建立的方法成功计算出PEG-EPO中9个位点的修饰率。该方法还用于3家企业的产品比较,结果显示:3家企业的产品在PEG修饰方面的总体趋势一致,但在个别位点存在修饰率的差异,比如N-末端和Lys45。结论:该方法可用于PEG-EPO制品的常规质量控制,以及不同企业产品的比对研究。

关键词：聚乙二醇重组人促红素修饰率液质肽图 Lys-C蛋白酶质量控制液质联用比对研究

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SEC-HPLC法测定溶瘤腺病毒注射液的纯度

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药物分析杂志 2020年第1期40卷 48-51页

作者：李永红韩春梅毕华陶磊李响饶春明中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的:建立检测溶瘤腺病毒注射液纯度的分子排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC法)。方法:采用XBridge BEH SEC分析柱和Waters 2695/2489高效液相色谱系统,以含150 mol·L^-1氯化钠的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)为流动相进行等度洗脱,流速0.5 m... 详细信息

目的:建立检测溶瘤腺病毒注射液纯度的分子排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC法)。方法:采用XBridge BEH SEC分析柱和Waters 2695/2489高效液相色谱系统,以含150 mol·L^-1氯化钠的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)为流动相进行等度洗脱,流速0.5 mL·min^-1,检测波长260 nm,采用峰面积归一法检测溶瘤腺病毒注射液纯度,并对方法的专属性、线性、重复性、中间精密度、检测下限和定量下限等指标进行考察。结果:空白溶剂无干扰峰出现;未经纯化和热处理的溶瘤腺病毒溶液中溶瘤腺病毒峰与其他杂质峰分离度均大于2.0;溶瘤腺病毒的进样量在2×108^2×10^10病毒颗粒(VP)范围内,浓度与吸收峰的线性关系良好(R^2=0.9985);6次进样测得的峰面积的RSD为0.78%;中间精密度试验的RSD为4.7%;检测下限为2.3×10^6 VP,定量下限为6.7×10^6 VP。3批溶瘤腺病毒注射液的纯度分析结果分别为99.84%、99.80%、99.64%。结论:SEC-HPLC法可用于检测溶瘤腺病毒注射液的纯度。

关键词：溶瘤腺病毒基因治疗产品质量控制纯度分子排阻高效液相色谱法

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重组9型腺相关病毒基因组滴度测定方法的改进和初步验证

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药物分析杂志 2020年第1期40卷 58-61页

作者：郑红梅李永红胡金盼史新昌于雷饶春明中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京100050

目的:对重组9型腺相关病毒(rAAV-9)基因组滴度测定方法进行优化和初步验证,提高测定结果的精密度。方法:通过比较SDS和EDTA及不同浓度SDS的裂解效果,对病毒裂解方法进行优化;通过比较质粒和病毒分别做对照品时的测定结果,选择合适的对照... 详细信息

目的:对重组9型腺相关病毒(rAAV-9)基因组滴度测定方法进行优化和初步验证,提高测定结果的精密度。方法:通过比较SDS和EDTA及不同浓度SDS的裂解效果,对病毒裂解方法进行优化;通过比较质粒和病毒分别做对照品时的测定结果,选择合适的对照品;通过比较平行线法和传统单点法的分析结果,选择合适的统计方法。结果:SDS裂解效果显著高于EDTA,终浓度为0.1%的SDS裂解效果最佳;以病毒为对照品,采用平行线法进行统计分析的结果变异度最小(RSD为13.7%),优于质粒做对照品的检测结果(RSD为35.9%)及单点法的分析结果(RSD为23.1%)。结论:本方法优于传统的重组腺相关病毒基因组滴度测定方法,可应用于以rAAV-9为载体的基因治疗药物的质量控制。

关键词：重组9型腺相关病毒基因治疗载体实时荧光定量PCR技术基因组滴度平行线法同质对照品精密度

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无细胞百白破联合疫苗腺苷酸环化酶毒素液质联用定量检测方法的建立和应用

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微生物学免疫学进展 2022年第1期50卷 22-29页

作者：卫辰吴燕蔡心怡晁哲王丽婵马霄中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京102629 武汉生物制品研究所有限责任公司细菌类疫苗室湖北武汉430200

目的建立不同工艺配方的无细胞百白破联合疫苗(diphtheria, tetanus and acellular Pertussis combined vaccine, DTaP)中腺苷酸环化酶毒素(adenylate cyclase toxin, ACT)的液质联用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)定量检测方法。方法对百日咳疫苗精制液、原液、DTaP成品和ACT参考品进行酶解前处理,采用BioC18 (2.1 mm×150 mm, 3μm)为固定相,0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液为流动相,梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,柱温为35℃,多反应监测模式(multiple reaction monitoring, MRM)对特定离子对进行检测。以ACT参考品建立标准曲线,对样品中的ACT准确定量,并对方法进行验证及初步应用。结果肽段ITGDAQANVLR特异性良好,在1.25~31.25μg/mL范围内线性良好(R^(2)>0.99),残差平方和为2.55,不同基质稀释标准曲线的残差平方和分别为3.08和1.32,基质效应较弱。DTaP成品回收率为80%~109%、原液回收率为93%~121%、精制液回收率为112%~120%;进样精密度为2.32%;中间精密度<20%,具备较好的准确性、精密度,且不同型号仪器的系统适用性研究结果一致。将该方法用于检测4个厂家的无细胞百白破联合疫苗多个工序段含有百日咳疫苗的样品,其中2个厂家的样品均有ACT检出,且ACT在共纯化阶段不断富集达100~250倍,另2个厂家产品仅在发酵液和盐析液中检出。结论建立的LC-MS/MS检测方法准确性和精密度都比较好,基质效应弱,可用于DTaP中ACT的定量检测和工艺过程监测。

关键词：无细胞百白破联合疫苗腺苷酸环化酶毒素质量控制液相色谱串联质谱

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呼吸道合胞病毒滴度间接免疫荧光检测方法的建立及验证

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中国生物制品学杂志 2022年第8期35卷 1002-1005,1012页

作者：宋月爽陈晓旭潘东卢井才张立娜刘禹壮原秀娟段盛博袁若森赵慧长春百克生物科技股份公司吉林长春130012 吉林大学生命科学院吉林长春130012 中国食品药品检定研究院呼吸道病毒疫苗室卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京102629

目的建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)滴度的间接免疫荧光检测方法,并进行验证。方法以Synagis(Palivizumab)为一抗,荧光标记羊抗人IgG为二抗,建立用于RSV滴度检测的间接免疫荧光法,并对HEp-2细胞接种密度(3×... 详细信息

目的建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)滴度的间接免疫荧光检测方法,并进行验证。方法以Synagis(Palivizumab)为一抗,荧光标记羊抗人IgG为二抗,建立用于RSV滴度检测的间接免疫荧光法,并对HEp-2细胞接种密度(3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104个/孔)、细胞培养液中胎牛血清浓度(2.5%、5%、10%、20%)、病毒培养时间(20、24、26、30、38、48 h)、抗体稀释度[一抗:1∶(1000/3)、1∶1000、1∶3000、1∶9000,二抗:1∶(400/3)、1∶400、1∶1200]进行优化。验证方法的特异性、线性范围、准确性、重复性。结果建立的方法最佳工作条件:HEp-2细胞接种密度为6×104个/孔,胎牛血清浓度为2.5%,病毒培养时间为24~26 h,一抗稀释度为1∶1000,二抗稀释度为1∶400。RSV可见特异性荧光,狂犬病病毒、流感病毒、风疹病毒均未见荧光;RSV滴度理论值在1.70×107~5.43×103 FFU/mL范围内,与检测值呈良好的线性关系,回归方程为y=1.0313 x-0.2508,R2=0.9897;准确性验证回收率在70%~130%范围内;重复性验证RSD均≤15%。结论建立的RSV滴度间接免疫荧光检测方法具有良好的特异性、准确性、重复性,且检测周期短,可用于RSV滴度快速检测。

关键词：呼吸道合胞病毒间接免疫荧光法病毒滴度

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