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中山大学学报（自然科学版） 2008年第4期47卷 68-71页

作者：舒琥刘晓春张勇袁桃安林浩然中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广东广州510275 广州大学生命科学学院广东广州510006

应用透射电镜技术观察不同时期的性成熟赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)脑垂体的超微结构。结果表明,性成熟赤点石斑鱼脑垂体近椭圆形,由神经垂体和腺垂体两部分组成。神经垂体主要由神经纤维、脑垂体细胞和微血管组成。其中神经分泌纤... 详细信息

应用透射电镜技术观察不同时期的性成熟赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)脑垂体的超微结构。结果表明,性成熟赤点石斑鱼脑垂体近椭圆形,由神经垂体和腺垂体两部分组成。神经垂体主要由神经纤维、脑垂体细胞和微血管组成。其中神经分泌纤维存在A(A1、A2)和B型神经分泌纤维。腺垂体中外侧部(PPD)腺细胞由嗜酸性的GH细胞和嗜碱性的TSH细胞及GTH细胞3类细胞构成。在不同的时期,GTH细胞内的分泌颗粒明显不同。

关键词：赤点石斑鱼脑垂体超微结构

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史氏鲟(Acipenser schrenckii)两种促性腺激素β亚基的原核表达

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中山大学学报（自然科学版） 2008年第2期47卷 89-92页

作者：胡红霞贝锦新刘晓春张勇林浩然中山大学水生经济动物研究所和广东省水生经济动物良种繁育重点实验室

采用遗传工程方法,重组表达史氏鲟两种促性腺激素β亚基蛋白。选用原核表达载体pET-22b(+),分别插入史氏鲟GtHⅠ&Ⅱβ亚基成熟肽cDNA序列,构建成C端含有6个组氨酸(6-His)融合蛋白标签的表达质粒;分别转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)... 详细信息

采用遗传工程方法,重组表达史氏鲟两种促性腺激素β亚基蛋白。选用原核表达载体pET-22b(+),分别插入史氏鲟GtHⅠ&Ⅱβ亚基成熟肽cDNA序列,构建成C端含有6个组氨酸(6-His)融合蛋白标签的表达质粒;分别转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)并诱导表达2个基因。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组融合蛋白相对分子质量分别为:GtHⅠβ亚基大约14 000,GtHⅡβ亚基15 000左右。分别用抗6个组氨酸融合标签的单克隆抗体及兔抗鲟鱼GTH多克隆抗体对2个表达蛋白进行Western-Blot分析,结果显示重组蛋白表达正确且有较高的免疫活性。GTHⅠβ重组蛋白在2 h就有明显的表达,6 h后随着时间增加表达量不再增加;25℃诱导重组蛋白产量比37℃诱导产量低。获得的重组蛋白质将可用于建立鲟鱼GtH的放射免疫测定方法。

关键词：史氏鲟(Acipenser schrenckii) 促性腺激素 β-亚基蛋白质遗传工程

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蓝太阳鱼第一次性周期性腺发育的组织学

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动物学杂志 2008年第1期43卷 88-95页

作者：曹运长李文笙叶卫林浩然中山大学水生经济动物研究所广东省水生经济动物繁殖重点实验室广东省番禺国家级罗非鱼良种场广州511453

蓝太阳鱼（Lepomis cyanellus）是广东省于1997年从北美引进的小型淡水鱼类,本文采用组织切片技术对蓝太阳鱼的性腺发育进行了研究。蓝太阳鱼的性腺发育程序可以分为5个时期。在1月龄,卵巢和精巢处于第Ⅰ期;2-3月龄时,卵巢和精巢发育到... 详细信息

蓝太阳鱼（Lepomis cyanellus）是广东省于1997年从北美引进的小型淡水鱼类,本文采用组织切片技术对蓝太阳鱼的性腺发育进行了研究。蓝太阳鱼的性腺发育程序可以分为5个时期。在1月龄,卵巢和精巢处于第Ⅰ期;2-3月龄时,卵巢和精巢发育到第Ⅱ期;4月龄时发育到第Ⅲ期;5-6月龄时发育到第Ⅳ期;7-8月龄时达到性成熟第Ⅴ期。过冬时,卵巢退化到第Ⅱ-Ⅲ期,而精巢仍停留在第Ⅴ期。成熟卵巢的成熟系数为2.80%-8.10%,成熟精巢的成熟系数为1.45%-3.45%。精巢和卵巢发育都为不完全同步型,且精巢发育比卵巢稍快。蓝太阳鱼的繁殖期在广州地区为3-11月,为多次产卵类型。本文从生殖和生长的关系上对蓝太阳鱼生长缓慢的原因进行了初步探讨,并将蓝太阳鱼作为一种鱼类实验动物的可行性进行了分析。

关键词：蓝太阳鱼精巢卵巢性腺发育

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斜带石斑鱼胸腺的显微和超微结构

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动物学报 2008年第2期54卷 342-355页

作者：吴金英林浩然中山大学生命科学学院水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广州510275

本文通过解剖及组织切片技术、光学显微镜、透射和扫描电子显微镜技术,对斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)胸腺器官组织进行了观察研究。结果表明:斜带石斑鱼胸腺实质主要由胸腺细胞(淋巴细胞)和网状上皮细胞构成。鱼体从Ⅰ龄之后,其... 详细信息

本文通过解剖及组织切片技术、光学显微镜、透射和扫描电子显微镜技术,对斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)胸腺器官组织进行了观察研究。结果表明:斜带石斑鱼胸腺实质主要由胸腺细胞(淋巴细胞)和网状上皮细胞构成。鱼体从Ⅰ龄之后,其胸腺发生明显的变化,与幼鱼有所不同,主要是胸腺可明显区分为三个区域:胸腺外皮质区、内皮质区和髓质区。外皮质区主要由网状上皮细胞、黏液细胞、成纤维细胞和少量淋巴细胞构成,细胞排列疏松;内皮质区主要由密集的淋巴细胞和网状上皮细胞组成,以含有大量的淋巴细胞为特征;髓质区主要由淋巴细胞和较多的网状上皮细胞构成,总体特征是淋巴细胞数量比内皮质区的少,且细胞排列较疏松。外皮质区、内皮质区相当于高等脊椎动物的皮质;髓质区相当于高等脊椎动物的髓质。髓质区之下有结缔组织,在Ⅱ龄以上的成体出现胸腺小体(Hassall's corpuscles)或类似胸腺小体的结构,而且随着年龄的增加,胸腺外皮质区增厚,结缔组织增加,还表现在内皮质区和髓质区组织逐渐萎缩变薄,胸腺的细胞组成类型和淋巴细胞数量上有所变化等等。这些现象在Ⅱ龄鱼开始出现,即胸腺呈现退化迹象,在Ⅲ龄以上鱼体呈现明显的退化和萎缩。胸腺表面扫描电镜结果表明:其上皮细胞表面具有微嵴以及由微嵴组成的指纹状结构,有一些微孔分布。透射和断面扫描电镜的结果进一步表明:胸腺组织内的细胞成分复杂,除了淋巴细胞和网状上皮细胞外,还具有巨噬细胞、肥大细胞、肌样细胞、浆细胞、指状镶嵌细胞和纤维细胞等。

关键词：斜带石斑鱼胸腺显微结构超微结构

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中国大鲵脑cDNA文库构建及促甲状腺激素β亚基基因cDNA的克隆和序列分析

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水产学报 2008年第4期32卷 507-516页

作者：杨丽萍杨慧荣张勇刘云黄海刘晓春蒙子宁黄俊海林浩然中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室珠海市斗门金鲵水产科技有限公司

以大鲵脑组织为材料,提取总RNA,应用CloneminerTM文库构建技术构建了cDNA文库。经检测,文库初始滴度为5.0×***-1,重组率为91.70%,插入片断大小在0.35～3.9kb,平均插入片段大小为0.791kb,文库扩增后滴度为4.0×***-1。随机挑选... 详细信息

以大鲵脑组织为材料,提取总RNA,应用CloneminerTM文库构建技术构建了cDNA文库。经检测,文库初始滴度为5.0×***-1,重组率为91.70%,插入片断大小在0.35～3.9kb,平均插入片段大小为0.791kb,文库扩增后滴度为4.0×***-1。随机挑选200个阳性克隆测序,经生物信息学分析,发现20个片段与已报道的基因有较高同源性,包括促甲状腺激素基因、生长激素基因及催乳素基因等,其中三个克隆为促甲状腺激素β亚基(TSHβ)基因。序列分析表明,TSHβcDNA全长序列为705bp,包含417bp开放读码框,编码138个氨基酸序列,其中前19个氨基酸为大鲵TSHβ亚基信号肽部分,后接119个氨基酸组成的TSHβ亚基成熟肽。同源性分析显示,大鲵TSHβ亚基与两栖类牛蛙、蟾蜍及爪蟾同一蛋白的同源性分别为53.6%、52.2%和60.3%。采用邻接法和最大简约法对部分脊椎动物TSHβ氨基酸序列构建分子系统树,结果显示有尾目大鲵为两栖动物中较早分化的一支,表明其进化地位较原始。RT-PCR组织分布分析发现,TSHβ基因除垂体有表达外,性腺也有少量表达。

关键词：中国大鲵 cDNA文库促甲状腺激素β亚基组织分布

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鲟鱼GtH放射免疫测定方法的建立及催产前后史氏鲟血清GtH含量的变化

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水产学报 2008年第6期32卷 817-824页

作者：胡红霞刘晓春朱华张勇国家淡水渔业工程技术研究中心(北京)暨北京市水产科学研究所中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室

用蛋白质快速液相层析（FPLC）分离俄罗斯鲟鱼脑垂体促性腺激素（GtH）,共获得GtH纯化蛋白4.6mg。用SDS-PAGE变性胶电泳图谱初步分析纯化蛋白,用反相高效液相色谱（rpHPLC）分离出两个亚基,质谱测定α亚基分子量:15 603ku,两个β亚基分... 详细信息

用蛋白质快速液相层析（FPLC）分离俄罗斯鲟鱼脑垂体促性腺激素（GtH）,共获得GtH纯化蛋白4.6mg。用SDS-PAGE变性胶电泳图谱初步分析纯化蛋白,用反相高效液相色谱（rpHPLC）分离出两个亚基,质谱测定α亚基分子量:15 603ku,两个β亚基分子量分别为14 338ku和14 694ku。制备了鲟鱼GtH的兔抗血清多克隆抗体,采用氯胺T法用125I标记抗原,用羊抗兔γ球蛋白做二抗,建立鲟鱼GtH的放射免疫测定方法。测定了催产前后不同时间史氏鲟血清中GtH含量的变化,统计分析表明成功排卵的雌鱼比未排卵和阴性对照组在催产后12h和16h GtH分泌量升高显著,最高达到***-1;催产效应时间与催产后血清中GtH的含量紧密相关。

关键词：史氏鲟俄罗斯鲟促性腺激素放射免疫测定催产

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倒刺鲃四种雌激素受体在雌性生殖周期中的时空表达

倒刺鲃四种雌激素受体在雌性生殖周期中的时空表达

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2008年中国水产学会学术年会

作者：史亚男朱培刘晓春张勇林浩然中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物繁殖重点实验室

雌性脊椎动物中,雌激素具有调节卵黄生成、配子发生以及卵巢发育成熟等生理作用,其作用是通过雌激素受体(ER)介导的。我们已经在雄性倒刺鲃中克隆了四种雌激素受体亚型ERa1、ERa2、ERb1、ERb2。系统进化树分析表明sdERa和sdERb是两种不... 详细信息

雌性脊椎动物中,雌激素具有调节卵黄生成、配子发生以及卵巢发育成熟等生理作用,其作用是通过雌激素受体(ER)介导的。我们已经在雄性倒刺鲃中克隆了四种雌激素受体亚型ERa1、ERa2、ERb1、ERb2。系统进化树分析表明sdERa和sdERb是两种不同的亚型,它们分别有两种高同源性的异形体。本研究通过半定量RT-PCR的方法研究了四种雌激素受体在雌性倒刺鲃中枢组织和外周组织的分布,结果显示sdERa亚型主要分布于中枢组织的端脑、视顶盖-上丘和垂体,外周组织的表达相对较低,其中肝脏和肾脏相对较高,而在卵巢和其他组织几乎检测不到。sdERb亚型广泛分布于中枢组织和外周组织,主要有嗅球、视顶盖-上丘以及垂体、肝脏和卵巢。随后利用实时荧光定量PCR的方法研究了四种受体亚型在卵巢发育不同阶段,在脑、垂体、卵巢和肝脏四种主要组织中的表达模式,并通过放射免疫测定方法(RIA)检测了血清中促性腺激素和性类固醇激素含量的变化。结果显示,脑中sdERb1在卵巢发育过程中有相对高丰度的表达,其他受体亚型则微量表达。垂体中sdERa1、sdERa2和sdERb1的表达量随卵巢的成熟逐渐升高,而sdERb2的表达变化则有着相反的趋势。卵巢中主要表达的是sdERb2亚型,且其表达量随卵巢发育成熟逐渐增加;其次是sdERb1亚型,在卵巢发育晚期其表达量达到最高,而随着卵巢的成熟而逐渐降低。四种受体在肝脏中都有表达,其中sdERa1在卵巢最终成熟的阶段表达量陡增,sdERa2在卵巢发育晚期先达到最高峰,随着卵巢的成熟而逐渐降低,而sdERb两种亚型在卵巢发育成熟的过程中表达量逐渐降低。在整个生殖周期中,黄体生成素(LH)和17-b雌二醇(E2)的血清浓度明显升高,而睾酮(T)始终保持较低的水平。本研究提示sdERb2在卵巢发育成熟的过程中起主要作用,垂体中的sdERa、sdERa2介导E2对LH的反馈作用,进而通过肝脏中的sdERa1诱导卵巢的最终成熟。

关键词：雌激素受体倒刺鲃卵巢黄体生成素睾酮 17b-雌二醇

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我国罗非鱼主要引进种的遗传多样性与亲缘关系的SSR,AFLP与RAPD分析

我国罗非鱼主要引进种的遗传多样性与亲缘关系的SSR,AFLP与RAPD分...

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2008年中国水产学会学术年会

作者：罗雅艳蒙子宁王乐范斌刘晓春张勇林浩然中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁殖重点实验室

运用SSR,AFLP和RAPD三种分子标记分析了我国8个主要引进罗非鱼品种的遗传多样性与亲缘关系。10条RAPD随机引物工产生147个位点,其中130个多态性位点(88.44%)。运用4对AFLP引物对共检测到197条带,其中多态性条带112条(56.85%)。4个微卫... 详细信息

运用SSR,AFLP和RAPD三种分子标记分析了我国8个主要引进罗非鱼品种的遗传多样性与亲缘关系。10条RAPD随机引物工产生147个位点,其中130个多态性位点(88.44%)。运用4对AFLP引物对共检测到197条带,其中多态性条带112条(56.85%)。4个微卫星位点引物共发现19个等位基因,其中3个微卫星位点在8个品种都具有多态性。通过这三种不同分子标记的分析,我们发现红罗非鱼与奥尼罗非鱼的遗传多样性都显著的高于奥利亚的遗传多样性,然而吉富罗非鱼、莫荷罗非鱼、莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼和吉诺玛罗非鱼相互之间的遗传多样性没有显著性差异。用SSR,AFLP和RAPD分别得到的系统进化树的聚类有细微的差异,但是所有的进化树都把8个品种聚为两支:一支包括奥利亚罗非鱼、奥尼罗非鱼、吉富罗非鱼与吉诺玛罗非鱼,另一支包括莫桑比克罗非鱼、莫荷罗非鱼与荷那龙罗非鱼。除了莫荷罗非鱼,其他7个品种罗非鱼都不同程度的显著偏离哈代温伯格平衡。根据FST分析,我们发现53.68%的遗传变异来自于8个品种的不同个体之间,46.32%的遗传变异存在于8个品种彼此之间。

关键词：遗传多样性亲缘关系罗非鱼 SSR AFLP RAPD

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黑青斑河鲀干扰素γ基因的克隆、原核表达和纯化

黑青斑河鲀干扰素γ基因的克隆、原核表达和纯化

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2008年中国水产学会学术年会

作者：陈洁琳卢丹琪贝锦新冯丽娜张勇刘晓春林浩然中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物繁殖重点实验室海南大学海洋学院

本研究采用生物信息学方法在模式鱼类黑青斑河鲀数据库中分析获得黑青斑河鲀IFN候选基因,设计特异引物克隆得到长度为540 bp的黑青斑河鲀IFN开放读码框（ORF）。黑青斑河鲀IFNORF编码一段长度为180个氨基酸的前体蛋白,分子量约为20.17 k... 详细信息

本研究采用生物信息学方法在模式鱼类黑青斑河鲀数据库中分析获得黑青斑河鲀IFN候选基因,设计特异引物克隆得到长度为540 bp的黑青斑河鲀IFN开放读码框（ORF）。黑青斑河鲀IFNORF编码一段长度为180个氨基酸的前体蛋白,分子量约为20.17 kD。黑青斑河鲀IFN与其他鱼类及哺乳类的IFN相比,尽管其基因序列变异较大,但基因结构极为保守,均由4个外显子和3个内含子组成。对已知的IFN氨基酸序列进行进化树分析也表明所得到的黑青斑河鲀IFN与其他鱼类IFN亲缘关系较近。将IFN成熟肽编码序列连接至带有组氨酸标签的表达载体pET15b,构建获得pET15b-IFN原核表达质粒。将该质粒转化大肠杆菌,并通过优化IPTG浓度、温度等条件对其进行诱导表达,在37℃,0.4 mM IPTG诱导4小时得到了大量以不溶形式存在的融合蛋白,大小约为23 kD。然后对重组蛋白进行变性和透析复性,利用其所带的组氨酸标签能高度亲和镍层析柱的特性进行纯化,获得纯度较高的黑青斑河鲀IFN重组蛋白,为后续蛋白功能的研究提供了基础。

关键词：黑青斑河鲀 TFNγ 原核表达包涵体重组蛋白

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斜带石斑鱼多聚免疫球蛋白受体基因的克隆及真核表达分析

斜带石斑鱼多聚免疫球蛋白受体基因的克隆及真核表达分析

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2008年中国水产学会学术年会

作者：冯丽娜卢丹琪贝锦新陈洁琳张勇刘晓春林浩然中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物繁殖重点实验室海南大学海洋学院

本研究采用同源克隆结合RACE方法获得斜带石斑鱼多聚免疫球蛋白受体(polymeric immunoglobulin receptor,pIgR)基因全长cDNA序列。该基因cDNA序列长度为1,440 bp,含有1,029 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)。斜带石斑鱼pIgR ORF编码一段由340个氨基酸组成的前体蛋白,其N端含有由20个氨基酸组成的信号肽,成熟肽由320个氨基酸组成。斜带石斑鱼pIgR蛋白属I型跨膜糖蛋白,其胞外区含有两个免疫球蛋白样结构域(Ig-like domain,ILD)。与其他已知pIgR氨基酸序列同源性分析显示,斜带石斑鱼pIgR与其他鱼类pIgR亲缘关系较近,与哺乳动物pIgR亲缘关系较远。RT-PCR表达模式分析结果表明,斜带石斑鱼pIgR基因在外周组织中有广泛表达。在粘膜免疫相关组织中,后肠表达量最高,皮肤、中肠和胃次之。在淋巴器官中,头肾表达量较高,在胸腺、脾脏中的表达量较低。此外,本研究还首次在脑部不同分区检测到斜带石斑鱼pIgR mRNA的表达,其中以下丘脑的表达量最高。Northern Blot检测结果表明斜带石斑鱼的肠和脾脏中只存在一种形式的pIgR转录产物。将编码pIgR成熟肽的基因序列亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建获得pIgR重组质粒pcDNA-pIgR,并将该质粒瞬时转染COS-7细胞,进行重组蛋白表达。经Western blot方法检测,目的蛋白得到有效表达,分子量约为40 kD。本研究首次利用真核表达系统对斜带石斑鱼pIgR蛋白进行重组表达及鉴定,为深入探讨鱼类抗体与其特异受体间的关系及其转运的分子机制提供基础,并进一步丰富了鱼类免疫分子的研究内容。

关键词：斜带石斑鱼多聚免疫球蛋白受体真核表达

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