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第七届全国石斑鱼类繁育与养殖产业化论坛

作者：刘云王庆李琳丽赵密叶智锋陈嘉兴张勇林浩然中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广东广州 510275

斜带石斑鱼是典型的雌雄同体雌性先熟鱼类,首次性分化均为雌性.斜带石斑鱼首先分化为雌性的分子机制还知之甚少.在哺乳类,视黄酸(retinoic acid,RA)是启动生殖细胞减数分裂的关键信号,减数分裂在性分化的早期启动是性别向雌性发育的标...

斜带石斑鱼是典型的雌雄同体雌性先熟鱼类,首次性分化均为雌性.斜带石斑鱼首先分化为雌性的分子机制还知之甚少.在哺乳类,视黄酸(retinoic acid,RA)是启动生殖细胞减数分裂的关键信号,减数分裂在性分化的早期启动是性别向雌性发育的标志事件.在本研究中,我们通过分析石斑鱼不同性腺发育时期的转录组数据发现： RA合成酶编码基因aldh1 a2和aldh1 a3的表达量在原始生殖细胞增殖期(50d-11od)显著上升,并在卵原细胞启动减数分裂时期(180d-240d)高表达,随着卵母细胞进入生长期后表达量持续下降,在成熟的卵巢中检测不到表达.而RA分解酶编码基因(cyp26a1,cyp26b1和cyp26c1)在早期性腺发育过程中都处于低表达状态,而在性分化结束后表达上升.这些数据表明,在斜带石斑鱼性腺发生早期合成了大量的RA.为了进一步研究视RA信号在性分化中的作用,我们采用RA合成酶的抑制剂4-二乙氨基苯甲醛(DEAB)进行投喂实验.结果表明：在180天,DEAB投喂组的生殖细胞数量显著低于对照组;在210天,DEAB投喂组没有生殖细胞;而DEAB+RA拯救组的生殖细胞数量与对照组无明显区别.这些结果表明：石斑鱼性腺发育早期RA信号较强,能够刺激石斑鱼早期PGC的增殖以及减数分裂的启动,进而促使性腺朝雌性发育.

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体外诱导斜带石斑鱼卵母细胞成熟技术的初步探索

体外诱导斜带石斑鱼卵母细胞成熟技术的初步探索

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第七届全国石斑鱼类繁育与养殖产业化论坛

作者：唐霖彭诚赵密张勇刘云李水生林浩然中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广东广州 510275

水产养殖的主要目标之一是获得大量可育的卵,斜带石斑鱼作为重要的海水养殖鱼类,有关其卵母细胞成熟调控的研究几乎是一片空白.对此,本研究旨在建立体外诱导石斑鱼卵子成熟和卵子排放的技术,并进一步探索石斑鱼卵成熟的分子机制.对性成...

水产养殖的主要目标之一是获得大量可育的卵,斜带石斑鱼作为重要的海水养殖鱼类,有关其卵母细胞成熟调控的研究几乎是一片空白.对此,本研究旨在建立体外诱导石斑鱼卵子成熟和卵子排放的技术,并进一步探索石斑鱼卵成熟的分子机制.对性成熟的斜带石斑鱼进行性腺解剖,根据直径大小可初步将其未成熟的卵泡(follicle)分为5个发育时期：原始生长期(Primary growth stage,PG,～0.08 mm);卵黄发生前的时期(Previtellogenic stage,PV,～0.18 mm);卵黄积累早期(Early vitellogenic stage,EV, ～).25 mm);卵黄积累中期(Midvitell-ogenicstage,MV,～0.35 mm);卵黄积累完全时期(Full-grown immature stage,FG,～0.45 mm).用FG期的卵泡进行体外诱导成熟试验,发现L15培养基对于细胞的形态的维持效果最好.进一步对L15培养基进行了浓度梯度的试验,发现浓度(60％-100％)对细胞培养过程中的形态影响并无明显差异,使用100％的L15培养基进行体外诱导成熟试验.在大部分淡水鱼类和少数海水鱼类中,已有研究鉴定得出了两种主要的鱼类卵母细胞成熟诱导激素(MIH)：DHP (17α,20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one)和20βS (17,20,21-trihydroxy-4-Pregnen-3-one),本研究使用HCG,DHP和20βs作为刺激剂进行成熟诱导试验.(1)直接单独加入HCG(10IU,100IU),DHP(100nM,300nM),20βS(100nM,300nM)不能诱导FG期卵泡成熟;(2)同时加入两种刺激剂：100IU HCG+100nM DHE 100IU HCG+100nM 20βS,100nMDHP+100nM20βS也无法诱导FG期卵泡成熟;(3)加入100IU HCG诱导1,3,6小时后再加入DHP(100nM,300nM)或20βS(100nM,300nM)也不能诱导FG期卵泡成熟.以上结果表明,斜带石斑鱼的卵母细胞成熟机制较为复杂,暂时仍无法确定其MIH是哪一种性类固醇激素,其体外诱导卵母细胞成熟技术仍须继续探索.

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斜带石斑鱼基因组数据可视化系统构建

斜带石斑鱼基因组数据可视化系统构建

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第七届全国石斑鱼类繁育与养殖产业化论坛

作者：王登东唐驻景王庆刘云刘晓春李水生张勇林浩然中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广东广州 510275

人类基因组图谱绘制完成后，尤其近几年来测序技术快速的进步和生物信息学的迅猛发展，人们越来越多地从基因和基因组层面去对生命现象和机理进行研究。随着生物序列的爆炸式增长，对海量数据的分析和可视化已成为生命科学领域的一项重...

人类基因组图谱绘制完成后，尤其近几年来测序技术快速的进步和生物信息学的迅猛发展，人们越来越多地从基因和基因组层面去对生命现象和机理进行研究。随着生物序列的爆炸式增长，对海量数据的分析和可视化已成为生命科学领域的一项重要课题，基因组数据可视化在基因结构分析，功能研究等方面具有重要意义。由于基因组数据十分庞大，相较于桌面式基因组浏览器，基于web的基因组浏览器有着便利性和数据传播等优势而成为主要发展方向。目前功能强大、应用广泛的主要有UCSCGenomeBrowser、Ensembl GenomeBrowser、NCBI Map Viewer、GBrowse、JBrows等;其中UCSC、NCBI和Ensembl应用最为广泛，而GBrowse等新一代基因组浏览器采用了最新的网络技术，且具有开源和可定制的特点从而被多个机构和项目采用。随着斜带石斑鱼(Epinephineus Coioides)基因组的测序、组装和基因注释完成，我们着手构建了石斑鱼基因组数据可视化系统，以方便科研人员对石斑鱼基因的结构和功能展开科学研究。本系统采用了JBrowse基因组浏览器作为核心组件之一，并利用网页技术展示基因序列、结构和功能注释等详细信息。此外，为了更好地辅助分析，本系统整合了Blast等信息学工具，实现了斜带石斑鱼基因组序列、基因结构和注释信息的可视化和分析功能。

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探索miRNA21介导的斜带石斑鱼干扰素γ对TRAF6的精细调控

探索miRNA21介导的斜带石斑鱼干扰素γ对TRAF6的精细调控

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第七届全国石斑鱼类繁育与养殖产业化论坛

作者：彭弯李高飞姚谧张勇林浩然卢丹琪中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广东广州 510275

针对病害频发这一我国渔业健康持续发展所面临的最大问题,本文以斜带石斑鱼为研究对象,进一步探究miRNA介导干扰素γ(IFNγ)在病原识别和递呈过程中的关键作用.IFNγ是具有广谱抗病毒功能和调节免疫系统的Ⅱ型干扰素.相比于哺乳动物中...

针对病害频发这一我国渔业健康持续发展所面临的最大问题,本文以斜带石斑鱼为研究对象,进一步探究miRNA介导干扰素γ(IFNγ)在病原识别和递呈过程中的关键作用.IFNγ是具有广谱抗病毒功能和调节免疫系统的Ⅱ型干扰素.相比于哺乳动物中只发现的一种IFNγ,斜带石斑鱼中存在两种IFNγ (IFNγ1和IFNγ2).先前的离体实验结果表明斜带石斑鱼的IFNγ1和IFNγ2重组蛋白不仅可上调病原识别通路上重要的接头分子TRAF6蛋白的表达,同时也调节miRNA-21-5p表达.通过靶点预测软件发现TRAF6的3'UTR上存在两个miRNA21的结合位点(分别命名为b1和b2),因此我们进一步探究TRAF6和miRNA21之间的关系.我们克隆得到TRAF6 3'UTR区,分别构建了pmiR-TRAF6 wt,pmiR-TRAF6 bl mut,pmiR-TRAF6 b2 mut和pmiR-TRAF6 b1 and b2 mut荧光素酶表达载体.双荧光素酶报告基因检测实验表明,与Negtive Control+pmiR-TRAF6 3UTR wt组相比,miRNA21 mimic+pmiR-TRAF6 3UTR wt组的荧光值是上升的.miRNA21 inhibitor刺激石斑鱼头肾单核细胞后,miR21的表达水平是显著下降的,TRAF6蛋白的表达却是显著上升的;以上结果表明,miRNA21和TRAF6之间存在一定的联系,但可能不是直接的靶点关系.

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激素诱导卵巢分化期斜带石斑鱼性逆转机制研究

激素诱导卵巢分化期斜带石斑鱼性逆转机制研究

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第七届全国石斑鱼类繁育与养殖产业化论坛

作者：王庆肖玲李琳丽刘云刘晓春李水生张勇林浩然中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广东广州 510275

外源激素能够诱导鱼类性别转变,外源雄激素17α-甲基睾丸酮(17-methyltestosterone,MT)广泛应用于诱导性成熟石斑鱼性逆转,但是停止MT处理诱导出的雄鱼又转变回雌鱼,能否通过MT诱导卵巢分化期的幼鱼产生永久性的雄鱼尚不清楚。本研究通...

外源激素能够诱导鱼类性别转变,外源雄激素17α-甲基睾丸酮(17-methyltestosterone,MT)广泛应用于诱导性成熟石斑鱼性逆转,但是停止MT处理诱导出的雄鱼又转变回雌鱼,能否通过MT诱导卵巢分化期的幼鱼产生永久性的雄鱼尚不清楚。本研究通过MT诱导孵化后90天左右处于卵巢分化期的幼鱼性逆转,并从性腺组织学、基因袁达水平和激素水平方面研究了MT诱导卵巢分化期幼鱼性逆转过程。通过连续性腺组织切片发现,MT投喂会抑制卵巢腔的形成,停止MT投喂后性腺组织出现雌性生殖细胞但是没有卵巢腔生成;进一步通过细胞增殖和细胞凋亡,追踪DMRT1蛋白表达的细胞发现,在诱导雄性性腺生成过程是先形成输出小管,之后在输出小管周围开始出现雄性生殖细胞,之后才开始精子发生过程。检测性别相关基因表达水平发现,雄性性别相关基因dmrt1表达水平随着投喂时间的进行表达量增加,但是cyp11b和sox9的表达水平没有变化;雌性性别相关基因cyp19a1a和foxl2随着投喂的进行表达量降低;进一步我们检测激素水平发现随着MT投喂的进行11-KT水平维持不变但是E2的水平下降,当停止MT处理时E2又回到雌鱼水平,表明MT投喂只是抑制了雌激素的生成并没有产生出内生的雄激素。综上所述,我们的研究发现MT诱导卵巢分化期的斜带石斑鱼性逆转过程是先抑制卵巢腔的形成并生成输出小管,然后在输出小管周围开始出现雄性生殖细胞,之后开始精子发生,在整个过程中雌激素受到抑制但是并不会产生内生的雄激素,因此当停止MT投喂后,诱导出的雄性性腺转变成没有卵巢腔的雌性性腺。

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基于赤点石斑鱼转录组的SSR标记开发

基于赤点石斑鱼转录组的SSR标记开发

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第七届全国石斑鱼类繁育与养殖产业化论坛

作者：陈枭李玉谢桢桢蒙子宁夏军红张勇林浩然中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广东广州 510275

赤点石斑鱼是我国沿海常见的经济鱼类,近年来由于人类的过度捕捞、环境污染以及气候变化等因素,种质资源出现了极度退化。微卫星分子标记(SSR,simple sequence repeat)的开发对赤点石斑鱼的遗传背景信息、制定相应的保护措施具有积极的...

赤点石斑鱼是我国沿海常见的经济鱼类,近年来由于人类的过度捕捞、环境污染以及气候变化等因素,种质资源出现了极度退化。微卫星分子标记(SSR,simple sequence repeat)的开发对赤点石斑鱼的遗传背景信息、制定相应的保护措施具有积极的作用。转录组可以提供基因表达、基因调控和蛋白质氨基酸组成等信息。随着高通量测序的发展和成熟,EST数据不断增加,从转录组中筛选SSR标记已经得到广泛的应用。本研究基于课题组未发表的赤点石斑鱼转录组数据,使用misa软件检测SSR位点,并用primer3进行引物设计,从中选取119条重复数较多的SSR序列进行扩增特异性和多态性检测。合成的引物首先在一个斜带石斑鱼个体中检验扩增特异性,然后再选择扩增特异性高,条带清晰的引物进行群体扩增。初步实验结果显示有5对赤点石斑鱼微卫星分子标记含有多态性。本研究为将来赤点石斑鱼物种的保护和繁育及相关遗传学研究提供了基础。

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石斑鱼在体基因敲降技术的建立

石斑鱼在体基因敲降技术的建立

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第七届全国石斑鱼类繁育与养殖产业化论坛

作者：黄敏伟赵密陈慧敏刘晓春李水生张勇林浩然中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广东广州 510275

石斑鱼是名贵海产鱼类之一，具有显著的经济效益和社会效益。石斑鱼性发育存在性反转的过程，而其性别调控机制尚不明确。本研究旨在建立石斑鱼在体基因敲降技术，以研究候选基因在其性反转过程中的作用。本研究采用利用逆转录病毒载体...

石斑鱼是名贵海产鱼类之一，具有显著的经济效益和社会效益。石斑鱼性发育存在性反转的过程，而其性别调控机制尚不明确。本研究旨在建立石斑鱼在体基因敲降技术，以研究候选基因在其性反转过程中的作用。本研究采用利用逆转录病毒载体，将带有目的基因的干扰片段载体包被成假型病毒(具有侵染活力，但不能自我复制)，随后以病毒在体注射的方法将目的干扰片段直接转导进石斑鱼性腺，在体干扰目的基因表达，以研究其在性转变过程中的作用。结果表明，对斑马鱼进行腹腔包装好的假型病毒，能够侵染其内脏。

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社会因素对斜带石斑鱼(Epinephenus Coioides)性别反转调控作用的研究

社会因素对斜带石斑鱼(Epinephenus Coioides)性别反转调控作用的...

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第七届全国石斑鱼类繁育与养殖产业化论坛

作者：陈嘉兴叶智峰彭诚刘云李水生张勇林浩然中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广东广州 510275

为了维系自身的繁衍，物种在适应生存环境过程中产生了各自独特的繁殖策略，以最大限度地保持它们的生殖能力。其中，种类繁多、地域分布广泛的鱼类有着复杂而多样的繁殖策略，研究其不同的发生机制于生命现象的理解和渔业发展有着重要...

为了维系自身的繁衍，物种在适应生存环境过程中产生了各自独特的繁殖策略，以最大限度地保持它们的生殖能力。其中，种类繁多、地域分布广泛的鱼类有着复杂而多样的繁殖策略，研究其不同的发生机制于生命现象的理解和渔业发展有着重要意义。在一些雌雄同体的鱼类中，若占支配地位的雄性个体消失，群体中地位较高的雌性就会发生性反转，变成雄性，我们观察到斜带石斑鱼可能也存在类似的现象。本研究以4龄斜带石斑鱼成鱼为实验对象，按3∶1、6∶1的雌雄比例构建新的石斑鱼群体，一周后移去群体中的雄鱼，仅留下每组3条或者6条雌鱼，另外将18条雄鱼单独组成一个群体，实验开始后，观察各组石斑鱼的行为变化，每半个月抽取一次性腺组织，切片观察组织和生殖细胞变化。结果显示，在社会因子的诱导下，石斑鱼会通过相互打斗来确立新的社会关系，雌鱼/雄鱼群体分别发生性别反转。雌鱼发生性反转变为雄鱼最快只需要半个月的时间，而雄鱼性反转为雌鱼则需要三个月。研究表明，社会因子对石斑鱼的性反转起着关键性的作用，通过该方法，可以在短时间内诱导石斑鱼发生性反转，获得所需要的雄鱼或雌鱼。这对研究石斑鱼性反转的机制有着重要的意义，也验证了石斑鱼雄转雌的可能性。

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斜带石斑鱼(Epinephelus coioides) AMH基因的重组蛋白表达条件选择和多克隆抗体的制备

斜带石斑鱼(Epinephelus coioides) AMH基因的重组蛋白表达条件选...

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第七届全国石斑鱼类繁育与养殖产业化论坛

作者：韩玉龙彭诚王庆王翔李水生张勇林浩然中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广东广州 510275

抗缪勒氏管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)为糖蛋白,属于TGF-β细胞因子家族。哺乳动物中,AMH因具有引起缪勒氏管退化和阻止雌性生殖器官的发育而得名。而硬骨鱼中,虽然都没有缪勒氏管,但是AMH及其受体基因已经在许多鱼类中被克隆出...

抗缪勒氏管激素(anti-Mullerian hormone,AMH)为糖蛋白,属于TGF-β细胞因子家族。哺乳动物中,AMH因具有引起缪勒氏管退化和阻止雌性生殖器官的发育而得名。而硬骨鱼中,虽然都没有缪勒氏管,但是AMH及其受体基因已经在许多鱼类中被克隆出来,而且在已经克隆得到的鱼中被证实在性腺中表达,这表明了AMH基因在鱼类性别分化和性逆转方面可能起着某种作用。在得到AMH基因全长的情况下;我们利用原核表达技术对AMH基因构建了原核表达系统,优化得到了重组蛋白最佳的表达条件并成功制备重组蛋白,采用免疫学方法制备重组AMH蛋白的多克隆抗体。为进一步研究和探讨AMH及其受体AMHRII基因在性别分化和性逆转方面的潜在作用打下了基础并为后续的免疫组化实验提供抗体。结果如下：(1)利用原核表达系统构建了斜带石斑鱼AMH的重组蛋白表达体系,同时得到了AMH重组蛋白的最佳诱导条件,利用变复性的纯化方式得到了纯度较高的重组蛋白。(2)通过重组蛋白免疫新西兰兔,获得了AMH-pET32a兔抗血清。经过ELISA和Western blot分析表明,经过实验封闭后,得到的抗原可以特异性的识别对应的抗原,并确定了抗体浓度。

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抚仙金线鲃kisspeptin基因的克隆及组织表达特性

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四川动物 2016年第4期35卷 496-502页

作者：廖宗甄孙彩云王晓爱杨国坤潘晓赋杨君兴李文笙有害生物控制与资源利用国家重点实验室广东省水生经济动物良种繁育重点实验室中山大学深圳研究院中山大学生命科学学院广州510275 遗传资源与进化国家重点实验室中国科学院昆明动物研究所昆明650223

抚仙金线鲃Sinocyclocheilus tingi是云南抚仙湖的特有种,虽已突破其人工繁殖技术,但在塘养环境下不能自然繁衍。kiss1基因编码的神经多肽kisspeptin被认为是下丘脑-垂体-性腺轴的重要调节因子,通过调控促性腺激素释放激素、促性腺激素... 详细信息

抚仙金线鲃Sinocyclocheilus tingi是云南抚仙湖的特有种,虽已突破其人工繁殖技术,但在塘养环境下不能自然繁衍。kiss1基因编码的神经多肽kisspeptin被认为是下丘脑-垂体-性腺轴的重要调节因子,通过调控促性腺激素释放激素、促性腺激素等激素的分泌参与到生殖调控中。本研究采用反转录PCR和c DNA末端快速扩增(RACE)技术在抚仙金线鲃中克隆出编码kisspeptin的2个基因kiss1和kiss2的c DNA,其中kiss1的开放阅读框长度为351 bp,编码116个氨基酸;kiss2的开放阅读框长度为369 bp,编码122个氨基酸。反转录PCR结果显示,kiss1在抚仙金线鲃雌雄个体中均是肠道的表达量最高;kiss2表达量最高的组织在雄性和雌性中不同,雄性为肠道,雌性则是下丘脑和全脑。为进一步探究kiss1和kiss2在中枢神经系统及垂体中的分布,本研究中将抚仙金线鲃的脑部分为8个部分进行反转录PCR,结果显示,雄性脊髓和垂体中的kiss1表达量较高,雌性垂体中的kiss1表达量最高,其次是视顶盖;kiss2在雌性和雄性中均在下丘脑的表达量最高。本研究的结果为抚仙金线鲃人工繁殖提供了更多探索的方向。

关键词：抚仙金线鲃 kisspeptin kiss1 kiss2 克隆组织表达特性

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