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第五届“全国石斑鱼类繁育与养殖产业化”论坛

作者：丁旭卢丹琪梁瑶思林浩然中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物繁殖重点实验室广州510275

NLR受体家族(NOD-like receptors,NLRs)是一类能够识别细胞内的病原相关危险信号(MAMP和DAMP)的模式识别受体,是固有免疫模式识别受体中的一个重要家族.NLR家族都含有NACHT结构域(是神经元凋亡抑制蛋白(NAIP)、CIITA、HET-E和TP分子的缩... 详细信息

NLR受体家族(NOD-like receptors,NLRs)是一类能够识别细胞内的病原相关危险信号(MAMP和DAMP)的模式识别受体,是固有免疫模式识别受体中的一个重要家族.NLR家族都含有NACHT结构域(是神经元凋亡抑制蛋白(NAIP)、CIITA、HET-E和TP分子的缩写)和LRR结构域(富含亮氨酸重复序列leucine-rich repeats).NLR通常在胞浆以非活化状态存在——通过LRR折叠使其靠近NACHT结构域,抑制了自发的多聚体化.当MAMP和DAMP直接或间接结合到LRR后,NLR分子通过构象上的变化,暴露出NACHT结构域,从而触发寡聚体化从而暴露出效应结构域.从而加强机体免疫系统探测微生物感染的能力,产生促炎细胞因子,调节免疫应答和炎症反应.目前NLR家族在鱼类中的免疫功能及其作用机制的研究报道还很少.本实验以斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)为研究对象,研究了NLR成员NLRX1基因.通过对己报道鱼类NLRX1基因cDNA序列进行比对,根据保守区设计引物,利用反转录PCR和RACE技术首次克隆得到了斜带石斑鱼NLRX1基因cDNA全长.NLRX1的基因序列全长cDNA序列为3,164bp,其开放阅读框(open reading frame,ORF)为2,886bp.根据ORF序列推导该基因编码962个氨基酸组成的前体蛋白,包含107个氨基酸的N端结构域,177个氨基酸的NACHT结构域和668个氨基酸的5个LRR结构域,具有典型的NLRX1结构域.对不同物种NLRX1家族的氨基酸序列进行系统进化分析,结果显示,鱼类NLRX1单独形成一个分支,切与深裂眶锯雀鲷(Stegastes partitus)、秀美花鳉(Poecilia formosa)以及圆尾型孔雀鱼(Poecilia reticulata)的NLRX1亲缘关系较近.用Real time-qPCR检测NLRX1基因在斜带石斑鱼不同组织中表达分布,结果表NLRX1基因在外周组织中广泛表达,其中在胸腺中的表达量最高,在肠、头肾、脑中也有高水平的表达,在中肾、心、脾中表达量次之,在肝、眼中表达量较低.为进一步探索NLRX1在斜带石斑鱼固有免疫中的功能提供理论基础.

关键词：斜带石斑鱼 NLRX1 基因克隆

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斜带石斑鱼IFNγ的活性验证和功能研究

斜带石斑鱼IFNγ的活性验证和功能研究

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第五届“全国石斑鱼类繁育与养殖产业化”论坛

作者：彭弯卢丹琪孙艳汪婷梁瑶思丁旭张勇林浩然中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物繁殖重点实验室广州510275

针对病害频发这一我国渔业健康持续发展所面临的最大问题,本文以斜带石斑鱼为研究对象,进一步探究干扰素γ(IFNγ)在病原识别和递呈过程中的关键作用.IFNγ是主要由NK细胞、CD4+ Thl和CD8+T细胞合成和分泌的具有广谱抗病毒功能和调节免... 详细信息

针对病害频发这一我国渔业健康持续发展所面临的最大问题,本文以斜带石斑鱼为研究对象,进一步探究干扰素γ(IFNγ)在病原识别和递呈过程中的关键作用.IFNγ是主要由NK细胞、CD4+ Thl和CD8+T细胞合成和分泌的具有广谱抗病毒功能和调节免疫系统的Ⅱ型干扰素.相比于哺乳动物中只发现的一种IFNγ基因,斜带石斑鱼中存在两种IFNγ(IFNγ1和IFNγ2).我们对斜带石斑鱼的IFNγ1和IFNγ2进行原核表达和纯化,得到两种IFNγ重组蛋白.为了验证重组蛋白IFNγ的活性,我们进行了呼吸爆发和NO检测实验.呼吸爆发离体实验表明,IFNγ1和IFNγ2均可以促进斜带石斑鱼脾脏细胞系和血淋巴细胞的呼吸爆发.离体实验还表明,IFNγ1和IFNγ2可提高斜带石斑鱼血淋巴细胞NO释放量.为了进一步的功能研究,我们检测了IFNγ在JAK/STAT1通路和TLR通路上相关因子的变化.离体实验表明,在lng/mL和10ng/mL的IFNγ1和IFNγ2分别孵育斜带石斑鱼脾脏细胞系3h后,STAT1及pSTAT1的表达量均出现不同程度的上调.用一定浓度的IFNγ和IFNγ2分别孵育斜带石斑鱼头肾的单核细胞不同时间后,lh,2h和4h的IL-1β均出现不同程度的上调,0.5h,lh和2h的TRAF6也出现了不同程度的上调,同时miR-21-5p,miR-146a-5p和miR-155-3p的表达也出现了不同程度的上调和下调.本研究结果表明,斜带石斑鱼IFNγ与哺乳类IFNγ相似,在免疫系统中起着重要的作用,能够激活相似的下游信号通路诱导免疫相关基因的表达.

关键词：斜带石斑鱼 IFNγ 活性验证 JAK/STAT1 TLR

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急性操作胁迫对刀鲚应激反应相关神经内分泌因子的影响

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水产学报 2014年第6期38卷 803-812页

作者：王宇卢丹琪李伟萍徐跑顾若波姚谧梁瑶思张勇林浩然海南大学海洋学院中国水产科学研究院淡水渔业研究中心农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室中山大学生命科学学院水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室

为深入了解刀鲚应激反应中相关神经内分泌因子作用的分子机理,采用手工捕捉的方式对刀鲚进行了急性操作胁迫。通过放射免疫法和化学发光法测定刀鲚应激反应后头肾和血浆皮质醇含量的变化,结果显示,刀鲚胁迫刺激后血浆皮质醇含量极显著... 详细信息

为深入了解刀鲚应激反应中相关神经内分泌因子作用的分子机理,采用手工捕捉的方式对刀鲚进行了急性操作胁迫。通过放射免疫法和化学发光法测定刀鲚应激反应后头肾和血浆皮质醇含量的变化,结果显示,刀鲚胁迫刺激后血浆皮质醇含量极显著性升高,血浆皮质醇浓度平均升高56.48%,头肾皮质醇含量显著性升高,头肾皮质醇浓度平均升高49.68%,表明急性操作胁迫确实引起刀鲚的应激反应。通过同源克隆的方法获得刀鲚促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、硬骨鱼紧张肽(UI)、阿黑皮素原(POMC)基因的部分序列,并应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测上述神经内分泌因子mRNA的表达变化,结果显示,CRH基因的表达水平极显著性下降,POMC基因的表达水平显著性下降,UI基因的表达水平有下降趋势但不显著。上述结果显示,皮质醇、CRH、UI和POMC等神经内分泌因子通过鱼类下丘脑—脑垂体—肾间腺轴参与刀鲚应激反应的调节,为进一步了解刀鲚胁迫应答的作用机理,实现对其有效调控打下基础。

关键词：刀鲚应激反应促肾上腺皮质激素释放激素(CRH) 硬骨鱼紧张肽(UI) 阿黑皮素原(POMC) 皮质醇

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斜带石斑鱼神经分泌素(Secretoneurin)的cDNA克隆、组织表达及功能研究

斜带石斑鱼神经分泌素(Secretoneurin)的cDNA克隆、组织表达及功...

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2014年中国水产学会学术年会

作者：杨丽冬李水生张勇舒琥李小梅侯丽萍李强广州大学生命科学学院中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物繁殖重点实验室

神经分泌素(Secretoneurin,SN)来源于前体分泌粒蛋白Ⅱ(Secretogranin,Sg Ⅱ)最保守的序列,由33-34个氨基酸组成。在硬骨鱼类中,由于发生特定的基因组复制事件产生SN的两个旁系同源基因:SNa和SNb。本研究采用RT-PCR方法从斜带石斑鱼(Epi... 详细信息

神经分泌素(Secretoneurin,SN)来源于前体分泌粒蛋白Ⅱ(Secretogranin,Sg Ⅱ)最保守的序列,由33-34个氨基酸组成。在硬骨鱼类中,由于发生特定的基因组复制事件产生SN的两个旁系同源基因:SNa和SNb。本研究采用RT-PCR方法从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)全脑中成功克隆得到两种SN前体SgⅡ基因的c DNA序列,序列分析表明:SgⅡa开放阅读框为1911bp,共编码636个氨基酸,其中SNa为34个氨基酸;Sg Ⅱb开放阅读框为1809bp,共编码602个氨基酸,而SNb为33个氨基酸,SNa和SNb的氨基酸序列同源性为38.2%。采用Real-time PCR方法研究了SNa和SNb在15种组织中的表达情况,结果表明:两种SN前体SgⅡa和Sg Ⅱb均在垂体中的表达量最高,在各脑区(嗅球、端脑、小脑、下丘脑、中脑、延脑)中也均有大量表达,而在其他外周组织几乎不表达。此外,100n M SNa和SNb离体孵育斜带石斑鱼垂体原代细胞6h,能够显著上调LHβ和FSHβm RNA水平。100n M SNa孵育下丘6h能够显著升高s Gn RH和sb Gn RH的m RNA水平,而100n M SNb刺激下丘6h对s Gn RH和sb Gn RH的释放无明显效果。这些结果为揭示斜带石斑鱼SN参与生殖调控的分子机制提供了基础。

关键词：斜带石斑鱼神经分泌素分泌粒蛋白Ⅱ

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利用社会学习性防治石斑鱼幼苗黑身病爆发

利用社会学习性防治石斑鱼幼苗黑身病爆发

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第五届“全国石斑鱼类繁育与养殖产业化”论坛

作者：黄文徐新彭诚张勇李水生刘晓春林浩然中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物繁殖重点实验室广州 510275

石斑鱼是名贵的海水养殖鱼类,经济价值巨大.石斑鱼黑身病是由病毒或者细菌感染引发的病毒性或者细菌性综合疾病,石斑鱼幼苗感染后死亡率非常高.石斑鱼具有集群的社会学习性,在应激或者进食时会集聚成一团;相反,当个体数少到一定量之后,... 详细信息

石斑鱼是名贵的海水养殖鱼类,经济价值巨大.石斑鱼黑身病是由病毒或者细菌感染引发的病毒性或者细菌性综合疾病,石斑鱼幼苗感染后死亡率非常高.石斑鱼具有集群的社会学习性,在应激或者进食时会集聚成一团;相反,当个体数少到一定量之后,会散落分布,不发生集群.为了研究石斑鱼黑身病的防治方法及石斑鱼聚群习性对石斑鱼黑身病的防治效果,在长、宽、高分别为3m、6m、1m的4个相同的水泥池中分别饲养800条体长2.5 cm左右石斑鱼幼鱼,这些水泥池分别设置成为100条、200条、400条、800条组;100条组中每个网箱100条,共8个网箱,200条组中每个网箱200条,共4个网箱,400条组中每个网箱400条,共2个网箱,在800条组中1个网箱800条;所用网箱为40目网箱,不影响水流交换,网箱长、宽、高分别为1m、1.5 m、0.5 m,网箱漂浮于水面,流动海水、充气;每天投喂冰鲜鱼肉,一天三次,喂饱为止.连续投喂7天后：100条组中共发现有25条黑身石斑鱼幼鱼,黑身幼鱼趴伏在网箱底部,远离正常体色幼鱼活动区,不进食,正常幼鱼进食或应激条件下未发生聚集现象;200条组中共发现有24条黑身石斑鱼幼鱼,黑身幼鱼与100条组相同,不进食,正常石斑鱼幼鱼未发生聚集现象;400条组中共发现有35条黑身石斑鱼幼鱼,大部分黑身幼鱼不进食,远离正常幼鱼活动区,小部分黑身幼鱼正常进食,混杂于正常体色幼鱼中,一定数量健壮的幼鱼在进食或应激条件下发生聚集;800条组中共发现70条左右的黑身石斑鱼幼鱼,小部分黑身幼鱼不进食,远离正常幼鱼活动区,大部分黑身幼鱼正常进食,混杂于正常体色幼鱼中,绝大部分石斑鱼幼鱼在进食或应激条件下发生聚集现象;连续投喂15天后：100条组中共发现21条黑身石斑鱼幼鱼,其中大部分开始正常进食,黑身病死亡的石斑鱼幼鱼共9条,其他死亡共30条,幼鱼成活率为95.1％;200条组中共发现28条黑身石斑鱼幼鱼,其中大部分正常进食,因黑身病死亡的石斑鱼幼鱼共13条,其他死亡共65条,幼鱼成活率为90.3％;400条组中共发现52条黑身石斑鱼幼鱼,小部分正常进食,因黑身病死亡的幼鱼共126条,其他死亡共72条,幼鱼成活率为75.3％;800条组中共发现162条黑身病石斑鱼幼鱼,小部分正常进食,因黑身病死亡的幼鱼共548条,其他死亡共32条,幼鱼存活率为27.5％.结果表明：石斑鱼幼鱼的群体密度对黑身病的防治具有明显的作用,在特定的环境中,石斑鱼幼鱼的群体密度控制在400条以下时,对石斑鱼黑身病具有很好的防治效果.

关键词：石斑鱼社会学集群黑身病幼鱼

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甲基睾酮诱导斜带石斑鱼性逆转过程性腺全基因组甲基化研究

甲基睾酮诱导斜带石斑鱼性逆转过程性腺全基因组甲基化研究

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第五届“全国石斑鱼类繁育与养殖产业化”论坛

作者：刘鲸肖玲李水生刘晓春张勇林浩然中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物繁殖重点实验室广州 510275

性逆转是脊椎动物一种独特的生殖方式,其调控机理一直是生殖学研究的热点,至今仍未清楚.近年来研究显示：表观遗传调控,尤其是甲基化的调控可能是调控动物性逆转的重要机制.斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)属于雌雄同体,雌性先熟鱼类... 详细信息

性逆转是脊椎动物一种独特的生殖方式,其调控机理一直是生殖学研究的热点,至今仍未清楚.近年来研究显示：表观遗传调控,尤其是甲基化的调控可能是调控动物性逆转的重要机制.斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)属于雌雄同体,雌性先熟鱼类,在其生活史中存在雌转雄的性逆转过程.本研究通过对甲基睾酮诱导斜带石斑鱼性逆转过程中的雌性、兼性、雄性三个时期的性腺组织展开了甲基化测序及数据分析工作,并利用第二代测序技术对生殖相关基因在性逆转过程中的表达量进行检测.共得到1136,035,002条高质量的序列信息,共102.2G的数据量.在允许两碱基错配基础上有,每个样本有88％以上的数据可以比对到斜带石斑鱼参照基因组上,全基因组平均测序覆盖深度接近30×.发现：在斜带石斑鱼中,C碱基甲基化平均水平为8.393％,存CG、CHH和CHG三种甲基化类型C碱基,其中甲基化CG所占比例最大,高达95％.在斜带石斑鱼性逆转过程中,CG、CHG与CHH甲基化水平都呈上升趋势.比较了不同功能元件区域甲基化分布情况以及非CG(CHH和CHG)核苷酸偏好性.发现CG甲基化水平在编码区域比在上游区域高出两倍多,而非CG(CHH和CHG)甲基化水平在不同区域分布比较平均.在斜带石斑鱼性逆转过程中,CG甲基化水平呈上升趋势,且编码区域上升的趋势要比上游区域上升的趋势明显.非CG甲基化水平在不同功能元件区域都呈上升趋势,且由兼性转变为雄性阶段,非CG甲基化水平显著上升.并且比较了非CG核苷酸上游3碱基和下游4碱基附近的偏好性,发现其上下游无偏好性.初步分析了在甲基睾酮诱导斜带石斑鱼性逆转过程中9个生殖相关基因(DMRT1、EMX2、GATA4、GATA6、SF1、SOX9b、CBX2、MP3K4、DMRT2)甲基化变化与基因表达量的关系,结果表明：在甲基睾酮诱导斜带石斑鱼性逆转过程中DMRT1、SF1、GATA6、SOX9b、EMX2基因表达量上升了,前四个基因表达量变化与上游区域甲基化水平下降有一定联系,EMX2基因表达量变化与基因大部分编码区域甲基化水平下降有一定联系.MAP3K4、DMRT2基因表达量下降了,前者表达量变化与基因整体水平甲基化上调有关,后者与基因大部分编码区域甲基化水平上升有一定联系.GATA4基因表达量的变化与甲基化水平变化无关.CBX2基因表达量先下降后上升,与上游区域甲基化变化有一定联系.由以上的研究成果推测DNA甲基化在甲基睾酮诱导的斜带石斑鱼性逆转过程中通过控制基因的表达量来发挥重要作用.但是DNA甲基化在性别分化、性别决定和性逆转中的精确作用还有待进一步研究.

关键词：甲基化斜带石斑鱼性逆转上游区域

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杂交青龙斑性腺发育和生殖内分泌调控研究

杂交青龙斑性腺发育和生殖内分泌调控研究

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第五届“全国石斑鱼类繁育与养殖产业化”论坛

作者：刘琼瑜肖玲李水生刘晓春张勇林浩然中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物繁殖重点实验室广州510275

三倍体的不育性,使得三倍体可以将更多的能量用于生长,并可避免产后免疫力低下易死亡和肉质改变的问题,从而获得优势物种,因此三倍体育种在鱼类遗传育种和生产应用方面发挥了重要的作用.本研究以杂交青龙斑三倍体和二倍体为研究对象,对... 详细信息

三倍体的不育性,使得三倍体可以将更多的能量用于生长,并可避免产后免疫力低下易死亡和肉质改变的问题,从而获得优势物种,因此三倍体育种在鱼类遗传育种和生产应用方面发挥了重要的作用.本研究以杂交青龙斑三倍体和二倍体为研究对象,对它们的性腺发育和HPG轴相关重要基因的表达差异进行了研究,并与母本斜带石斑鱼进行了比较,结果如下：1.青龙斑二倍体雌性的卵巢发育良好,发育过程与斜带石斑鱼相似：10月龄时闭合卵巢腔形成,卵巢中以Ⅰ时相卵原细胞为主;18月龄时卵巢处于Ⅱ期,以处于小生长期的Ⅱ时相初级卵母细胞为主;30月龄时,卵巢发育到Ⅲ期,卵巢中Ⅲ时相卵母细胞占大多数,也有Ⅰ时相卵原细胞和Ⅱ时相卵母细胞,Ⅲ时相卵母细胞体积显著增大,细胞核居中,皮质滤泡开始出现;48月龄时,卵巢进入Ⅳ期,Ⅳ时相卵母细胞发育到Ⅳ时相晚期,细胞呈圆形,卵黄颗粒直径增大并充满细胞质,卵黄颗粒和油球清晰可见,双层滤泡膜和放射带存在.至此,青龙斑二倍体完成了卵黄积累的过程,达到了生长的成熟.2.跟踪了30月龄之前青龙斑三倍体的性腺发育过程,性腺从外观观察均属于性腺,三倍体卵巢的发育严重削弱,30月龄时卵原细胞发育到Ⅱ时相卵母细胞,其体积比18月龄青龙斑二倍体卵巢中的Ⅱ时相卵母细胞要小;相反,在另外一些个体中,卵巢中持续存在体积较小、呈囊状排列的细胞,类精子发生区域逐渐出现,30月龄时性腺中存在大量雄性生殖细胞,雄性生殖细胞发育水平处于精原细胞、初级精母细胞和次级精母细胞阶段,卵巢呈现类雄性化.3.用实时荧光定量PCR的方法对10月龄、18月龄、30月龄、48月龄杂交青龙斑及其母本HPG重要相关基因(GnRH、GtH、GtHR和Cyp19a1a)的表达差异进行了研究分析,从分子内分泌学机制上去探讨青龙斑三倍体的不育性：青龙斑二倍体GnRH基因的mRNA表达水平最高,青龙斑三倍体与斜带石斑鱼相近;相反,青龙斑三倍体FSHp、LHp、FHSR,LHR以及CYP19a1a基因的mRNA水平显著高于青龙斑二倍体和斜带石斑鱼,青龙斑二倍体GnRH、GtH、GtHR和Cyp19a1a基因表达水平与斜带石斑鱼相近,这与两者具有相似的性腺发育过程相一致.

关键词：石斑鱼二倍体和三倍体性腺发育 HPG轴相关重要基因

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鞍带石斑鱼雌雄的辨别方法

鞍带石斑鱼雌雄的辨别方法

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第五届“全国石斑鱼类繁育与养殖产业化”论坛

作者：张勇王庆王翔彭诚张海发李水生刘晓春林浩然中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物繁殖重点实验室广州510275

鞍带石斑鱼亲鱼很难由外部形态分辨其雌雄性别,本研究开发了根据鞍带石斑鱼血清中卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)和11-酮基睾酮(11-ketotestosterone,11-KT)这两种激素含量,进行雌雄性别鉴别的方法.我们通过ELISA方法测定了鞍带石斑鱼血... 详细信息

鞍带石斑鱼亲鱼很难由外部形态分辨其雌雄性别,本研究开发了根据鞍带石斑鱼血清中卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)和11-酮基睾酮(11-ketotestosterone,11-KT)这两种激素含量,进行雌雄性别鉴别的方法.我们通过ELISA方法测定了鞍带石斑鱼血清中VTG和11-KT的含量.结果显示雌雄鱼两种激素的含量存在显著差异性.雌鱼VTG含量在1.810-0.965(mg/ml)之间,而11-KT含量在0.032-0.472(ng/ml)之间.雄鱼VTG含量在0.775-0.237(mg/ml)之间,而11-KT含量在2.477-1.423(ng/ml)之间.雌鱼VTG含量远高于雄鱼,同时11-KT含量远低于雄鱼,而雄鱼11-KT含量高于雌鱼,同时VTG含量远低于雌鱼.单个激素的测量还不能很肯定的测量鞍带石斑鱼的雌雄性别,但是两个激素交叉比较准确度相当高.从测量的30个样本来看准确率达到了100％.

关键词： VTG 11-KT ELISA 鞍带石斑鱼

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雌激素对斜带石斑鱼GnIH基因转录调节的分子机制研究

雌激素对斜带石斑鱼GnIH基因转录调节的分子机制研究

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第五届“全国石斑鱼类繁育与养殖产业化”论坛

作者：王晴晴郭银刘晓春林浩然中山大学生命科学大学院水生经济动物研究所广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广州510275

目前,在鱼类生殖轴(下丘脑-垂体-性腺)上检测到高表达的雌激素受体信号,表明了雌激素受体介导的雌激素效应调控着整个生殖活动的上下游.但是对于调控GnIH神经元的潜在机制知道的很少.在本研究中,克隆得到斜带石斑鱼(Epinephelus coioide... 详细信息

目前,在鱼类生殖轴(下丘脑-垂体-性腺)上检测到高表达的雌激素受体信号,表明了雌激素受体介导的雌激素效应调控着整个生殖活动的上下游.但是对于调控GnIH神经元的潜在机制知道的很少.在本研究中,克隆得到斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)GnIH基因的5'侧翼序列,其中包括转录起始位点上游片段1573bp及第一外显子片段25bp.并通过在线软件分析GnIH基因启动子上的转录因子结合位点.斜带石斑鱼的GnIH启动子序列拥有2个1/2雌激素反应元件(estrogen responsive element (ERE) half-sites,1/2ERE),2个cAMP反应元件(cAMP-responsive element,CRE),1个雌激素受体特异蛋白-1结合位点(ER/specificity protein-1 binding site,Spl),1个与ERE元件共同序列(5'GGTCAnnnTCACC3')相差仅两个碱基的ERE-like元件(ERE-like sequence),序列为5'CGTCAGGTGACG3'.用构建好的斜带石斑鱼GnIH基因启动子的重组质粒GnIH-1573,本文研究了斜带石斑鱼GnIH的启动子在HEK 293T细胞系中的活性.将GnIH启动子重组载体和斜带石斑鱼pcDNA-ERαt或pcDNA-ERβ2共转染至HEK 293T细胞系中,结果表明,10-7M的雌激素处理共转染pcDNA-ERβ2能够使得GnIH启动子活性显著降低,而10-7M的雌激素处理共转染pcDNA-ERα的细胞不能影响GnIH启动子的活性.表明,当ERα存在与否时,E2均不能够激活GnIH启动子的活性.当ERβ2存在时,E2能够激活GnIH启动子的活性,而当缺失ERβ2时,则刺激作用消失.进一步了解雌激素对于GnIH基因启动子活性的调节作用,我们用不同浓度的雌激素(10-10 M-10-7M)进行处理.结果表明,不同浓度雌激素处理共转染pcDNA-ERα的细胞不能影响GnIH启动子的活性.不同浓度雌激素处理共转染pcDNA-ERβ2的细胞均能够使得GnIH启动子活性显著降低,且浓度越大,GnIH启动子活性降低的幅度越大.表明,雌激素可以通过ERβ2介导抑制斜带石斑鱼GnIH基因启动子活性.鉴定启动子上哪些区域参与了由ERβ2介导的雌激素对斜带石斑鱼GnIH基因的转录调节,我们构建了GnIH基因5'端长度逐渐缺失的启动子报告基因重组载体,对GnIH基因启动子的结构进行分析.研究结果显示,随着启动子片段的不断删除,GnIH基因启动子的基本活性并无显著性变化.当GnIH基因启动子片段递减至起始位点5'上游-235bp时雌激素对启动子的活性仍有显著性降低趋势,但是当GnIH基因启动子片段递减至起始位点5'上游-93bp时,雌激素对启动子活性没有抑制作用.在5'上游235bp到-93bp间,必定存在与之相关的雌激素应答元件.在5'上游-235bp到-93bp间,存在着一个CRE元件和一个ERE-like元件.进一步验证ERE-like元件是否为雌激素作用于GnIH的位点,我们对-ll2bp到-101bp的ERE-like元件运用融合PCR技术进行突变,并且构建了突变载体.共转染结果发现,突变使由E2对GnIH启动子活性抑制作用消失.结果表明,E2是通过与ERE-like元件结合实现对GnIH启动子活性的调节.

关键词：雌激素 GnIH 斜带石斑鱼

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孕激素对斜带石斑鱼kiss基因启动子的调控研究

孕激素对斜带石斑鱼kiss基因启动子的调控研究

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第五届“全国石斑鱼类繁育与养殖产业化”论坛

作者：国晨雨董世丽郭银刘晓春林浩然中山大学生命科学大学院水生经济动物研究所广东省水生经济动物良种繁育重点实验室广州510275

孕激素的功能受孕激素核受体(progesterone nucleareceptor nPR)的调控,即孕激素以自由扩散形式通过质膜,并与nPR紧密结合,通过结合靶基因上的激素应答元件(hormone response element HRE),调节基因表达或与其他核蛋白相互作用改变基因... 详细信息

孕激素的功能受孕激素核受体(progesterone nucleareceptor nPR)的调控,即孕激素以自由扩散形式通过质膜,并与nPR紧密结合,通过结合靶基因上的激素应答元件(hormone response element HRE),调节基因表达或与其他核蛋白相互作用改变基因的转录活性,此种功能被称为孕激素的基因组效应(genomic action of progesterone)。根据已知的斜带石斑鱼nPR,mPRp和mPRγ的cDNA序列, 组织分布结果显示：nPR在嗅球及垂体中表达量最高,可能参与孕激素的反馈调节,mPRβ和mPRγ则在鳃中表现出极高的表达量,推测这两个膜受体对斜带石斑鱼的离子和渗透压调节起着重要的作用。通过用两种孕激素17α,20β-双羟孕酮(DHP)和17α,20β,21-三羟孕酮(20β-S)对斜带石斑鱼的卵巢进行离体孵育实验,当用浓度为1-1000nM的20β-S体外处理6小时,1nM的20β-S就能显著性的降低mPRα的表达,而处理时间增至9小时时,100nM或1000nM的20β-S能显著性的上调mPRα的表达。这一结果的产生可能是因为处理6h时消耗了受体,使得mPRα表达量下降,而当处理时间延长至9小时时,高浓度的20β-S使得受体开始重新合成导致mPRα表达量显著上升。在线软件Transcription Element Search Software(TESS)分析发现斜带石斑鱼kissl和kiss2基因上游启动子上分别有2个和7个孕激素受体结合原件。利用已构建好的kissl启动子,kiss2启动子以及PR表达载体,检测kiss1,kiss2启动子在HEK293cell中的转录活性,进而研究三种孕激素(DHP,20β-S和P4)对两种kiss基因启动子转录活性的影响。对卵巢发育处于EV期的斜带石斑鱼鱼腹腔注射DHP(2ug/g bodyweight),24小时后检测下丘脑两种kiss基因的表达变化。结果显示与对照组相比,无论是kissl还是kiss2基因,mRNA表达水平均有显著的上升。而对于切除卵巢的斜带石斑鱼来说,腹腔注射DHP后血清中E2,T和DHP的水平都有明显的下降。通过研究孕激素对斜带石斑鱼两种kiss基因转录调节的分子机制,为阐明鱼类的生殖内分泌调控机制提供重要的参考资料。

关键词：孕激素斜带石斑鱼孕激素受体 kiss基因启动子

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