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中国畜牧兽医 2011年第12期38卷 45-49页

作者：高林廖德芳姚俊肖雷李华春张念祖李志华云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室农业部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室云南昆明650224

为重建受猪鼻支原体人为污染的BHK-21细胞,本研究采用含10mg/L乙基环丙沙星的培养液,对受污染的BHK-21细胞进行物理、化学相结合的循环处理,并用DNA荧光染色法和PCR法对处理进行全程监测。结果发现,4次循环处理并再传3代后,猪鼻支原体... 详细信息

为重建受猪鼻支原体人为污染的BHK-21细胞,本研究采用含10mg/L乙基环丙沙星的培养液,对受污染的BHK-21细胞进行物理、化学相结合的循环处理,并用DNA荧光染色法和PCR法对处理进行全程监测。结果发现,4次循环处理并再传3代后,猪鼻支原体污染已被彻底清除,细胞恢复了健康。此方法为抢救受支原体污染的细胞提供了参考。

关键词：乙基环丙沙星猪鼻支原体 BHK-21细胞清除污染

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云南省边境地区哨兵牛芒市病毒的分离与鉴定

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华南农业大学学报 2021年第4期42卷 7-16页

作者：李占鸿谢佳芮杨振兴寇美玲李华春高翔胡忠燕李卓然廖德芳杨恒云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224 景洪市动物疫病预防控制中心云南景洪666100

【目的】掌握云南省边境地区动物虫媒病毒的多样性分布和传播风险。【方法】在云南省景洪市设立哨兵牛3头,每周1次采血进行虫媒病毒的监测与分离。通过电镜观察、基因组琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR与克隆测序对分离病毒进行鉴定,采用实时荧... 详细信息

【目的】掌握云南省边境地区动物虫媒病毒的多样性分布和传播风险。【方法】在云南省景洪市设立哨兵牛3头,每周1次采血进行虫媒病毒的监测与分离。通过电镜观察、基因组琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR与克隆测序对分离病毒进行鉴定,采用实时荧光定量RT-PCR与血清中和试验对病毒在动物上的感染进行回溯分析。【结果】2019年,在监测期第13周,从1头哨兵牛的血液中分离出1株致C6/36细胞病变的病毒(V301/YNJH/2019),电镜观察可见直径约70 nm、呈二十面体对称结构的病毒粒子,琼脂糖凝胶电泳显示病毒基因组为双链RNA,RT-PCR鉴定分离毒株为芒市病毒(MSV)。测序显示,分离毒株的基因节段Seg-4和Seg-7长度为2055和1122 bp,编码病毒的外层衣壳蛋白VP4(628 aa)和VP7(298 aa),基因节段Seg-2和Seg-9长度为3055和1076 bp,编码病毒的内层衣壳蛋白VP2(956 aa)和VP9(283 aa);分离毒株与云南省芒市分离的MSV/DH13M041毒株具有最近的亲缘关系,核酸序列相似度在97.4%(Seg-9)~98.5%(Seg-2)之间,氨基酸序列相似度在96.4%(VP9)~98.4%(VP2)之间。病毒感染的回溯分析显示,监测期的第11周,牛血液中病毒核酸检测呈阳性,病毒核酸含量在第13周达到高峰,随后快速降低,在第18周转为阴性;感染哨兵牛在监测期的第13周已产生特异性中和抗体(1∶14),在第16~18周处于高峰(1∶226),至监测结束的第24周降低为1∶57。【结论】本文从牛体中分离到了MSV,表明牛是MSV的易感动物之一,病毒在感染牛上呈“一过性感染”的特征。研究结果为进一步开展MSV的检测诊断、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。

关键词：牛芒市病毒虫媒病毒系统发生分析哨兵动物感染特性回溯分析

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云南省PALV的分离鉴定及序列特征分析

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中国兽医科学 2022年第9期52卷 1165-1171页

作者：朱沛李卓然肖雷高林朱建波宋建领云南省畜牧兽医科学院热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明月650224

为掌握云南地区帕利亚姆血清群病毒(PALV)的分布情况和遗传特性,本研究分别在云南省师宗、江城及芒市设立监控点,通过定期采集哨兵动物抗凝血以“C6/36细胞-BHK细胞”的接种方式分离病毒,通过提取病毒RNA进行RT-PCR以鉴定病毒血清型,通... 详细信息

为掌握云南地区帕利亚姆血清群病毒(PALV)的分布情况和遗传特性,本研究分别在云南省师宗、江城及芒市设立监控点,通过定期采集哨兵动物抗凝血以“C6/36细胞-BHK细胞”的接种方式分离病毒,通过提取病毒RNA进行RT-PCR以鉴定病毒血清型,通过设计特异性引物对分离株Seg-2、Seg-3、Seg-7进行克隆及测序比对以分析其遗传特性。结果显示,从2017年云南省师宗县样品中获得5株阳性分离物,其中Chuzan virus(CHUV)2株,D’Aguilar virus(DAV)1株,Bluetongue virus(BTV)2株,经病毒序列结果比对和进化分析,2株CHUV的Seg-2和Seg-3与中国分离株独立成一簇,体现出明显的地域性,而2株CHUV的Seg-7相似度>99%,与云南、广西、台湾PALV具有相近的亲缘关系。分离株DAV的Seg-2独立成为一支,与非洲毒株亲缘关系最近,其Seg-3和Seg-7则相对保守,3株PALV分离株的Seg-3在系统发生树上划分为“东方型”地域型。研究结果为进一步开展PALV的感染特性、流行病学与疫苗研究奠定基础。

关键词：帕利亚姆血清群病毒分离鉴定虫媒病毒序列分析

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一株新型云南牛环状病毒的分离鉴定

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微生物学报 2021年第7期61卷 1957-1970页

作者：杨振兴李占鸿廖德芳高翔胡忠燕谢佳芮李华春杨恒云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224 景洪市动物疫病预防控制中心云南景洪666100

【目的】为加深云南省动物虫媒病毒多样性的认知。【方法】在云南省景洪市设立哨兵牛,定期采血接种细胞进行虫媒病毒的分离;通过RT-PCR、电镜观察与基因组琼脂糖凝胶电泳对分离病毒进行初步鉴定;扩增分离病毒的基因节段2(Seg-2)与基因节... 详细信息

【目的】为加深云南省动物虫媒病毒多样性的认知。【方法】在云南省景洪市设立哨兵牛,定期采血接种细胞进行虫媒病毒的分离;通过RT-PCR、电镜观察与基因组琼脂糖凝胶电泳对分离病毒进行初步鉴定;扩增分离病毒的基因节段2(Seg-2)与基因节段3(Seg-3)全长序列进行分析与系统发生树的构建,明确病毒的分类地位;通过qRT-PCR与血清中和试验对病毒在动物上的感染进行回溯分析。【结果】2019年7月,从哨兵牛上采集的血液中分离到1株可在BHK-21细胞上引起细胞病变的病毒;电镜下观察,病毒粒子呈球形,直径约70 nm;琼脂糖凝胶电泳显示病毒基因组由双链RNA组成,呈现“3-3-3”的带型特征。分离毒株的Seg-2编码环状病毒属病毒保守的T2蛋白,与Mobuck virus具有最近的亲缘关系,核酸与氨基酸序列相似度分别为72.8%与84.0%;分离毒株的Seg-3编码决定环状病毒属病毒血清型的OC1蛋白,与Mobuck virus的核酸与氨基酸序列相似度仅为60.2%与56.5%;在T2与OC1蛋白构建的系统发生树上,分离毒株形成独立于Mobuck virus的进化分支。对哨兵牛血液中的病毒核酸与血清中和抗体回溯分析结果显示,从病毒感染哨兵动物至监测期结束的17周内,动物血液中均可检测到病毒核酸;动物感染病毒1周后,开始产生特异性中和抗体,随后上升至最高水平(抗体效价1:226),至监测期结束,中和抗体仍维持在较高水平(抗体效价1:113)。【结论】本研究首次报道了1种新型Mobuck virus在云南省哨兵牛上的分离与感染特性。研究结果丰富了对我国环状病毒属病毒的认知,为开展病毒的诊断、流行病学与致病性研究奠定了基础。

关键词：环状病毒属病毒 Mobuck 病毒病毒分离与鉴定进化分析感染动态分析

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用乙基环丙沙星重建受大肠杆菌污染的BHK-21细胞

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中国畜牧兽医 2011年第11期38卷 214-217页

作者：高林廖德芳姚俊张念祖李华春李志华云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室农业部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室云南昆明650224

为重建受大肠杆菌污染的BHK-21细胞,本研究采用药物乙基环丙沙星,先测出该药对大肠杆菌的最低抑制浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),再测出该药对BHK-21细胞的MIC,从而确定10mg/L为乙基环丙沙星不影响细胞生长,又能抑制大肠... 详细信息

为重建受大肠杆菌污染的BHK-21细胞,本研究采用药物乙基环丙沙星,先测出该药对大肠杆菌的最低抑制浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),再测出该药对BHK-21细胞的MIC,从而确定10mg/L为乙基环丙沙星不影响细胞生长,又能抑制大肠杆菌的安全浓度。然后用含该浓度乙基环丙沙星的MEM生长液,对受污染的BHK-21细胞进行物理、化学相结合的循环处理。经过3次循环处理,再传3代后,确认大肠杆菌污染已经被彻底清除,细胞恢复了健康。此方法为抢救受细菌污染的细胞提供了参考。

关键词：乙基环丙沙星大肠杆菌 BHK-21细胞清除污染

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牛源流行性出血病病毒(EHDV)血清10型毒株在我国的分离鉴定

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病毒学报 2019年第1期35卷 112-120页

作者：李占鸿肖雷杨振兴孟锦昕廖德芳高林李华春杨恒云南省畜牧兽医科学院热带亚热带动物病毒重点实验室昆明650224

我国存在多种血清型流行性出血热病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)的流行,但尚未有关于EHDV-10型毒株的分离报道。为了解云南省EHDV的流行情况,2012～2015年,本研究在云南省设立江城、师宗、芒市三个监控点,定期采集监... 详细信息

我国存在多种血清型流行性出血热病毒(Epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)的流行,但尚未有关于EHDV-10型毒株的分离报道。为了解云南省EHDV的流行情况,2012～2015年,本研究在云南省设立江城、师宗、芒市三个监控点,定期采集监控动物血液,接种幼仓鼠肾细胞(Baby hamster kidney cell,BHK-21)进行病毒分离;通过PCR检测、血清中和试验、琼脂糖凝胶电泳和电镜观察等方法对分离病毒进行鉴定;对分离毒株的Seg-2/VP2与Seg-3/VP3基因节段进行克隆、测序与序列分析。2013年在云南省师宗县的哨兵牛上分离出一株EHDV毒株(YNSZ-V277-2013),病毒可引起BHK-21细胞出现圆缩、裂解的细胞病变(Cytopathic effect,CPE);电镜下病毒粒子呈球形,无囊膜,表面有大量纤维突,直径在70～80nm之间;病毒基因组dsRNA的琼脂糖凝胶电泳显示分离毒株与其他血清型EHDV一致,呈现"3-3-3"的电泳带型;序列分析显示YNSZ-V277-2013毒株的Seg-2/VP2与Seg-3/VP3序列与日本EHDV-10型毒株(ON-4/N/98)相似度最高,分别为97.5%/98.5%与98.1%/99.8%,证实分离毒株为EHDV-10型;系统发育分析显示YNSZ-V277-2013毒株的Seg-2与日本EHDV-10型毒株(ON-4/N/98)的亲缘关系最近,Seg-3与分离至日本和澳大利亚的EHDV毒株同属Eastern型。本研究首次报道了EHDV-10型毒株在我国的分离以及分离毒株的Seg-2与Seg-3基因序列特征,为进一步开展中国EHDV-10型的流行病学调查与致病性研究提供了基础。

关键词：流行性出血热病毒(EHDV) 分离鉴定序列分析

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蓝舌病病毒血清9型毒株在我国的首次分离

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畜牧兽医学报 2019年第2期50卷 354-363页

作者：李占鸿王金萍杨恒廖德芳宋建领高林何于雯李华春云南省畜牧兽医科学院热带亚热带动物病毒重点实验室昆明650224

旨在分离流行于我国云南省的蓝舌病病毒(BTV),掌握分离BTV的遗传特征与感染特性。采用"鸡胚—C6/36细胞—BHK-21细胞"接种的方式,采集哨兵牛的BTV阳性血液进行病毒分离;采用血清中和试验以及Segment 2与Segment 6ORF区的克隆... 详细信息

旨在分离流行于我国云南省的蓝舌病病毒(BTV),掌握分离BTV的遗传特征与感染特性。采用"鸡胚—C6/36细胞—BHK-21细胞"接种的方式,采集哨兵牛的BTV阳性血液进行病毒分离;采用血清中和试验以及Segment 2与Segment 6ORF区的克隆测序确定分离病毒的血清型;通过病毒噬斑形成和增殖曲线的测定,分析病毒在BHK-21细胞的增殖特性;通过qRT-PCR与血清中和试验分析BTV感染动物血液中病毒含量与中和抗体动态变化情况。结果显示:2013年8月,在云南芒市设定的哨兵牛中分离出一株BTV(毒株号V013/YN/2013),血清中和试验显示V013/YN/2013为BTV-9型病毒,Segment 2与Segment 6序列分析表明分离的病毒属BTV-9Eastern型,与日本毒株和澳大利亚BTV-9型毒株具有最近的亲缘关系。病毒噬斑与增殖曲线测定结果显示V013/YN/2013在BHK-21细胞上增殖能力明显强于BTV-9型参考毒株。自然感染V013/YN/2013的牛在连续5个月的监控期内未出现临床症状,感染动物虽产生了特异性中和抗体,但血液中始终能持续检测到病毒核酸。本研究首次报道了BTV-9Eastern型毒株V013/YN/2013在我国的分离,为进一步开展中国BTV-9型病毒的全基因组测序、诊断方法的建立、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。

关键词：蓝舌病病毒病毒分离血清型序列分析感染特性

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一步法qRT-PCR检测蓝舌病病毒25、26和27血清型的建立

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农业生物技术学报 2020年第6期28卷 1132-1140页

作者：李卓然宋子昂李占鸿杨振兴杨恒廖德芳云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南农业大学动物医学院

蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒,自2008年以来世界范围相继发现了BTV-25、-26和-27型3种新血清型BTV,我国也面临新血清型BTV侵入的威胁。本研究根据BTV-25、-26和-27型毒株的基因组节段2 (genomic ... 详细信息

蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)是一种严重危害反刍动物的虫媒病毒,自2008年以来世界范围相继发现了BTV-25、-26和-27型3种新血清型BTV,我国也面临新血清型BTV侵入的威胁。本研究根据BTV-25、-26和-27型毒株的基因组节段2 (genomic segment 2, Seg-2)序列,合成长度约500bp的待检靶基因DNA序列,体外转录为单链RNA (single strand RNA, ssRNA)作为参考核酸,设计血清型特异性扩增引物与TaqMan探针,建立BTV-25、-26和-27血清型特异性一步法qRT-PCR。结果表明:成功获取了BTV-25、-26和-27型参考核酸,建立的BTV-25、-26和-27型一步法qRT-PCR检测方法灵敏度高,对BTV-25、-26和-27型ssRNA检测灵敏度分别为4.43×101、5.61×101和4.88×101拷贝/μL;重复性好,组内和组间变异系数在0.48%至1.79%之间;特异性强,与BTV其他血清型毒株、流行性出血病病毒、阿卡斑病毒和非洲马瘟灭活疫苗毒株之间无交叉反应。采集自南方地区的120份BTV核酸阳性血液样本中,未检测到BTV-25、-26和-27型病毒核酸。本研究为我国开展BTV-25、-26和-27型的监测提供了有效的技术手段。

关键词：蓝舌病病毒(BTV) BTV-25、-26和-27型基因组节段2 (Seg-2) 血清型特异性一步法q RT-PCR

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云南师宗和江苏盱眙中华按蚊的分子鉴定及COII基因序列分析

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中国兽医杂志 2016年第11期52卷 20-22,25页

作者：胡骑王静林何于雯孙强吴晶云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南省畜牧兽医科学院云南昆明650224

为了了解云南省师宗县和江苏省盱眙县中华按蚊的分子鉴定及COII基因序列特征,2014年7月在云南省师宗县和江苏省盱眙县采集蚊虫标本,通过形态学鉴定出中华按蚊,再提取蚊虫基因组DNA,用COII基因特异引物和序列测定,然后采用生物信息学软... 详细信息

为了了解云南省师宗县和江苏省盱眙县中华按蚊的分子鉴定及COII基因序列特征,2014年7月在云南省师宗县和江苏省盱眙县采集蚊虫标本,通过形态学鉴定出中华按蚊,再提取蚊虫基因组DNA,用COII基因特异引物和序列测定,然后采用生物信息学软件进行核苷酸序列同源性和遗传进化分析。结果在云南省师宗县县城周围采集蚊虫标本314只,其中按蚊234只(74.52%);在江苏省盱眙县桂五镇采集蚊虫标本212只,其中按蚊143只(67.45%)。经形态学鉴定,每个地方挑选了8只疑似中华按蚊进行序列分析,结果显示,16只蚊虫COII核苷酸序列同源性在98%-100%之间,遗传进化分析显示,16只蚊虫全部与中华按蚊位于同一进化分支内。表明了采用分子鉴定的方法可有效地进行蚊虫种类鉴定。

关键词：中华按蚊 COII基因分子鉴定

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西藏环状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2020年第11期50卷 1360-1364页

作者：李楠何于雯孟锦昕王静林云南省畜牧兽医科学院/云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224

为了建立检测西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)的快速核酸检测方法,根据新分离的西藏环状病毒(DH13C120)Seg-10基因序列,设计了特异性引物及探针。通过优化反应条件,建立了检测西藏环状病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的... 详细信息

为了建立检测西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)的快速核酸检测方法,根据新分离的西藏环状病毒(DH13C120)Seg-10基因序列,设计了特异性引物及探针。通过优化反应条件,建立了检测西藏环状病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了检测。结果显示,该方法在2.31×10^8~2.31×10^2copies/μL质粒标准品浓度之间具有良好的线性关系,相关系数为0.999;组内与组间的变异系数均小于2%;最低检测下限为2.31×10^1copies/μL;对蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、盖塔病毒和流行性乙型脑炎病毒检测结果均为阴性,无交叉反应;对云南新分离的9株西藏环状病毒进行检测,拷贝数在3.23×10^5~1.54×10^6copies/μL之间,准确率为100%;对2013年采集自云南江城县的48份牛血液样品进行检测,检出西藏环状病毒阳性3份。结果表明,本研究建立的西藏环状病毒荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,适用于西藏环状病毒的快速检测,对西藏环状病毒的检测和流行病学调查提供了技术手段。

关键词：西藏环状病毒荧光定量RT-PCR 检测方法

来源：评论

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