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中国动物传染病学报 2020年

作者：谢佳芮寇美玲苗海生云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室农业农村部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室

为实现对口蹄疫病毒（FMDV）感染的现场快速检测，本研究于GenBank下载全球具有代表性的107条血清O型、A型和Asia-1型FMDV基因组序列，截取并比对FMDV高度保守的3D（RNA聚合酶）基因序列，设计17套环介导等温扩增引物，并对反应体系和... 详细信息

为实现对口蹄疫病毒（FMDV）感染的现场快速检测，本研究于GenBank下载全球具有代表性的107条血清O型、A型和Asia-1型FMDV基因组序列，截取并比对FMDV高度保守的3D（RNA聚合酶）基因序列，设计17套环介导等温扩增引物，并对反应体系和反应条件进行优化，建立FMDV群特异性RT-LAMP技术。该技术在反应前用石蜡密封PicoGreen染料，实现了免开盖可视化判定检测结果；该技术对PRV、PRRSV、AKAV、BTV-1、BTV-16、EHDV、CHUV等偶蹄动物病毒未见非特异性扩增；最低可检测3.4×10-6 ng/μL的病毒RNA，灵敏度是RT-qPCR技术的10倍，是一步法RT-PCR的100倍；尝试应用RT-LAMP对94份RNA临床样品进行检测比对，该检测方法与RT-PCR方法和RT-qPCR 方法对临床样品检测的符合率均为82.8%。本研究建立的FMDV群特异性RT-LAMP快速核酸检测技术，具有准确性高、快速简便的优点，可用作家畜FMDV早期感染的现场诊断技术。

关键词：口蹄疫病毒环介导等温核酸扩增群特异性引物

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口蹄疫病毒群特异性RT-LAMP检测技术的建立及试用

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中国动物传染病学报 2020年

作者：谢佳芮寇美玲苗海生云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室农业农村部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室

为实现对口蹄疫病毒（FMDV）感染的现场快速检测，本研究于GenBank下载全球具有代表性的107条血清O型、A型和Asia-1型FMDV基因组序列，截取并比对FMDV高度保守的3D（RNA聚合酶）基因序列，设计17套环介导等温扩增引物，并对反应体系和反应条件进行优化，建立FMDV群特异性RT-LAMP技术。该技术在反应前用石蜡密封PicoGreen染料，实现了免开盖可视化判定检测结果；该技术对PRV、PRRSV、AKAV、BTV-1、BTV-16、EHDV、CHUV等偶蹄动物病毒未见非特异性扩增；最低可检测3.4×10-6ng/μL的病毒RNA，灵敏度是RT-qPCR技术的10倍，是一步法RT-PCR的100倍；尝试应用RT-LAMP对94份RNA临床样品进行检测比对，该检测方法与RT-PCR方法和RT-qPCR 方法对临床样品检测的符合率均为82.8%。本研究建立的FMDV群特异性RT-LAMP快速核酸检测技术，具有准确性高、快速简便的优点，可用作家畜FMDV早期感染的现场诊断技术。

关键词：口蹄疫病毒环介导等温核酸扩增群特异性引物

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云南省PALV的分离鉴定及序列特征分析

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中国兽医科学 2022年第9期52卷 1165-1171页

作者：朱沛李卓然肖雷高林朱建波宋建领云南省畜牧兽医科学院热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明月650224

为掌握云南地区帕利亚姆血清群病毒(PALV)的分布情况和遗传特性,本研究分别在云南省师宗、江城及芒市设立监控点,通过定期采集哨兵动物抗凝血以“C6/36细胞-BHK细胞”的接种方式分离病毒,通过提取病毒RNA进行RT-PCR以鉴定病毒血清型,通... 详细信息

为掌握云南地区帕利亚姆血清群病毒(PALV)的分布情况和遗传特性,本研究分别在云南省师宗、江城及芒市设立监控点,通过定期采集哨兵动物抗凝血以“C6/36细胞-BHK细胞”的接种方式分离病毒,通过提取病毒RNA进行RT-PCR以鉴定病毒血清型,通过设计特异性引物对分离株Seg-2、Seg-3、Seg-7进行克隆及测序比对以分析其遗传特性。结果显示,从2017年云南省师宗县样品中获得5株阳性分离物,其中Chuzan virus(CHUV)2株,D’Aguilar virus(DAV)1株,Bluetongue virus(BTV)2株,经病毒序列结果比对和进化分析,2株CHUV的Seg-2和Seg-3与中国分离株独立成一簇,体现出明显的地域性,而2株CHUV的Seg-7相似度>99%,与云南、广西、台湾PALV具有相近的亲缘关系。分离株DAV的Seg-2独立成为一支,与非洲毒株亲缘关系最近,其Seg-3和Seg-7则相对保守,3株PALV分离株的Seg-3在系统发生树上划分为“东方型”地域型。研究结果为进一步开展PALV的感染特性、流行病学与疫苗研究奠定基础。

关键词：帕利亚姆血清群病毒分离鉴定虫媒病毒序列分析

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西藏环状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2020年第11期50卷 1360-1364页

作者：李楠何于雯孟锦昕王静林云南省畜牧兽医科学院/云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224

为了建立检测西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)的快速核酸检测方法,根据新分离的西藏环状病毒(DH13C120)Seg-10基因序列,设计了特异性引物及探针。通过优化反应条件,建立了检测西藏环状病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的... 详细信息

为了建立检测西藏环状病毒(Tibet orbivirus,TIBOV)的快速核酸检测方法,根据新分离的西藏环状病毒(DH13C120)Seg-10基因序列,设计了特异性引物及探针。通过优化反应条件,建立了检测西藏环状病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行了检测。结果显示,该方法在2.31×10^8~2.31×10^2copies/μL质粒标准品浓度之间具有良好的线性关系,相关系数为0.999;组内与组间的变异系数均小于2%;最低检测下限为2.31×10^1copies/μL;对蓝舌病病毒、鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、盖塔病毒和流行性乙型脑炎病毒检测结果均为阴性,无交叉反应;对云南新分离的9株西藏环状病毒进行检测,拷贝数在3.23×10^5~1.54×10^6copies/μL之间,准确率为100%;对2013年采集自云南江城县的48份牛血液样品进行检测,检出西藏环状病毒阳性3份。结果表明,本研究建立的西藏环状病毒荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,适用于西藏环状病毒的快速检测,对西藏环状病毒的检测和流行病学调查提供了技术手段。

关键词：西藏环状病毒荧光定量RT-PCR 检测方法

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云南师宗和江苏盱眙中华按蚊的分子鉴定及COII基因序列分析

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中国兽医杂志 2016年第11期52卷 20-22,25页

作者：胡骑王静林何于雯孙强吴晶云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南省畜牧兽医科学院云南昆明650224

为了了解云南省师宗县和江苏省盱眙县中华按蚊的分子鉴定及COII基因序列特征,2014年7月在云南省师宗县和江苏省盱眙县采集蚊虫标本,通过形态学鉴定出中华按蚊,再提取蚊虫基因组DNA,用COII基因特异引物和序列测定,然后采用生物信息学软... 详细信息

为了了解云南省师宗县和江苏省盱眙县中华按蚊的分子鉴定及COII基因序列特征,2014年7月在云南省师宗县和江苏省盱眙县采集蚊虫标本,通过形态学鉴定出中华按蚊,再提取蚊虫基因组DNA,用COII基因特异引物和序列测定,然后采用生物信息学软件进行核苷酸序列同源性和遗传进化分析。结果在云南省师宗县县城周围采集蚊虫标本314只,其中按蚊234只(74.52%);在江苏省盱眙县桂五镇采集蚊虫标本212只,其中按蚊143只(67.45%)。经形态学鉴定,每个地方挑选了8只疑似中华按蚊进行序列分析,结果显示,16只蚊虫COII核苷酸序列同源性在98%-100%之间,遗传进化分析显示,16只蚊虫全部与中华按蚊位于同一进化分支内。表明了采用分子鉴定的方法可有效地进行蚊虫种类鉴定。

关键词：中华按蚊 COII基因分子鉴定

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我国牛羊蓝舌病血清学调查

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中国兽医杂志 2020年第7期56卷 10-14页

作者：朱沛肖雷苗海生杨振兴谢佳芮朱建波李华春云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224

为了解蓝舌病(BT)在我国的流行和分布情况,本试验采用竞争酶联免疫吸附法(C-ELISA)对我国重庆、新疆、西藏、湖北、河北、广西、贵州、内蒙古、吉林、辽宁、四川、云南共12个省区的19237份血清进行检测。结果显示,被调查地区均存在蓝舌... 详细信息

为了解蓝舌病(BT)在我国的流行和分布情况,本试验采用竞争酶联免疫吸附法(C-ELISA)对我国重庆、新疆、西藏、湖北、河北、广西、贵州、内蒙古、吉林、辽宁、四川、云南共12个省区的19237份血清进行检测。结果显示,被调查地区均存在蓝舌病病毒(BTV)的流行,平均阳性率为4.33%~38.14%,且血清阳性率具有明显的地域性和季节性,低纬度地区的血清阳性率普遍高于高纬度地区(4.33%~38.14%),以第3季度(7~9月)阳性率最高(23.3%~46.7%),第1季度(1~3月)阳性率最低(0~13.3%),说明BTV的流行与虫媒的活动密切相关。本试验开展的BTV血清学调查,明确了蓝舌病在被调查地区的流行情况,也为蓝舌病的监测和预防提供了可靠参考。

关键词：蓝舌病竞争ELISA 血清学调查与分析

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云南师宗和江苏盱眙中华按蚊的分子鉴定及COⅡ基因序列分析

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中国兽医杂志 2016年第11期52卷 20-22页

作者：胡骑王静林何于雯孙强吴晶云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南省畜牧兽医科学院云南昆明650224

为了了解云南省师宗县和江苏省盱眙县中华按蚊的分子鉴定及COⅡ基因序列特征,2014年7月在云南省师宗县和江苏省盱眙县采集蚊虫标本,通过形态学鉴定出中华按蚊,再提取蚊虫基因组DNA,用COⅡ基因特异引物和序列测定,然后采用生物信息学软... 详细信息

为了了解云南省师宗县和江苏省盱眙县中华按蚊的分子鉴定及COⅡ基因序列特征,2014年7月在云南省师宗县和江苏省盱眙县采集蚊虫标本,通过形态学鉴定出中华按蚊,再提取蚊虫基因组DNA,用COⅡ基因特异引物和序列测定,然后采用生物信息学软件进行核苷酸序列同源性和遗传进化分析.结果在云南省师宗县县城周围采集蚊虫标本314只,其中按蚊234只(74.52％);在江苏省盱眙县桂五镇采集蚊虫标本212只,其中按蚊143只(67.45％).经形态学鉴定,每个地方挑选了8只疑似中华按蚊进行序列分析,结果显示,16只蚊虫COⅡ核苷酸序列同源性在98％-100％之间,遗传进化分析显示,16只蚊虫全部与中华按蚊位于同一进化分支内.表明了采用分子鉴定的方法可有效地进行蚊虫种类鉴定.

关键词：中华按蚊 COⅡ基因分子鉴定

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鹿流行性出血病病毒可视化RT-LAMP现场检测方法的建立

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中国兽医科学 2020年第12期50卷 1481-1485页

作者：李富祥赵文华杨仕标云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224

为建立鹿流行性出血病病毒(EHDV)可视化RT-LAMP检测方法。本研究根据EHDV内衣壳蛋白(VP7)基因保守序列设计2对特异性引物,通过反应条件优化,建立了EHDV可视化RT-LAMP检测方法。本研究建立的RT-LAMP方法的最佳反应条件为62℃1 h;利用该... 详细信息

为建立鹿流行性出血病病毒(EHDV)可视化RT-LAMP检测方法。本研究根据EHDV内衣壳蛋白(VP7)基因保守序列设计2对特异性引物,通过反应条件优化,建立了EHDV可视化RT-LAMP检测方法。本研究建立的RT-LAMP方法的最佳反应条件为62℃1 h;利用该方法检测口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、蓝舌病病毒、非洲马瘟病毒和4个血清型EHDV的RNA样品,结果显示该方法能检测4个血清型EHDV RNA,与其他病毒RNA无交叉反应,特异性较强;该方法最低可检测到4.7×10^-8ng/μL的RNA,敏感性是普通RT-PCR方法的1000倍。应用建立的RT-LAMP和普通RT-PCR方法分别对85份牛血液样品进行检测,结果显示,二者阳性和阴性符合率分别为100%和98.8%。本研究建立的EHDV可视化RT-LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高、快速和高通量检测的优点,为牛EHDV感染提供了快速可视化现场检测方法。

关键词：鹿流行性出血病病毒反转录环介等温扩增可视化现场检测

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O型口蹄疫病毒Real-time PCR检测方法的建立

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动物医学进展 2014年第1期35卷 50-53页

作者：胡骑信爱国李华春云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224

为建立一种可以快速、准确检测O型口蹄疫病毒的TaqMan荧光定量PCR方法,根据O型口蹄疫病毒VP1基因保守区序列设计特异性引物和TaqMan探针,使用MagMax Express核酸自动提取系统提取O型口蹄疫病毒FMD/O/YM/YN/2000株病毒核酸,建立了检测O... 详细信息

为建立一种可以快速、准确检测O型口蹄疫病毒的TaqMan荧光定量PCR方法,根据O型口蹄疫病毒VP1基因保守区序列设计特异性引物和TaqMan探针,使用MagMax Express核酸自动提取系统提取O型口蹄疫病毒FMD/O/YM/YN/2000株病毒核酸,建立了检测O型口蹄疫病毒的实时荧光定量PCR方法。该方法标准曲线相关系数达0.999 3,最低检测量达到1.79个拷贝,比传统荧光定量PCR方法灵敏10倍以上,特异性强。该方法可以在2.5h内检测96份临床样品,相对于传统荧光定量PCR方法,效率提高2倍以上。采用MagMax Express核酸自动提取系统配合7500Fast real-time PCR system建立的方法可以实现快速、准确检测O型口蹄疫病毒。

关键词：口蹄疫病毒实时荧光定量PCR 大通量检测

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云南省芒市采集蠓中辛德毕斯病毒的分离与鉴定

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中国媒介生物学及控制杂志 2021年第4期32卷 498-502页

作者：何于雯李楠孟锦昕王静林云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224

目的了解云南省德宏傣族景颇族自治州(德宏州)芒市蠓携带虫媒病毒情况,为虫媒病毒的研究和防控提供科学依据。方法2013年7月在德宏州芒市郊区牛和羊的养殖场中采用灯诱方法收集蠓标本。对采集到的蠓进行研磨离心,上清分别接种金黄地鼠... 详细信息

目的了解云南省德宏傣族景颇族自治州(德宏州)芒市蠓携带虫媒病毒情况,为虫媒病毒的研究和防控提供科学依据。方法2013年7月在德宏州芒市郊区牛和羊的养殖场中采用灯诱方法收集蠓标本。对采集到的蠓进行研磨离心,上清分别接种金黄地鼠肾细胞(BHK-21)和白纹伊蚊细胞(C6/36)进行病毒分离。阳性分离物分别采用甲病毒属、黄病毒属和布尼亚病毒属特异引物进行初步鉴定;采用辛德毕斯病毒(SINV)NS1基因特异性引物对阳性分离物进行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增并进行测序及序列分析。结果共采集到4500余只蠓,分44批进行病毒分离,获得1株阳性分离物(编号:YN222)接种在BHK-21细胞24 h后迅速产生明显细胞病变,接种在C6/36细胞72 h后产生明显的细胞病变。甲病毒属引物RT-PCR扩增阳性,而黄病毒属和布尼亚病毒属引物扩增均为阴性。甲病毒属引物扩增阳性产物测序后BLAST结果显示YN222株分离物与MRE16株SINV核苷酸同源性最高为93.7%。采用MRE16株NS1基因特异性引物进行RT-PCR扩增结果为阳性,测序获得1605 nt序列。系统进化分析结果显示,蠓新分离病毒YN222与澳大利亚东方型SINV位于同一进化分支内,核苷酸和氨基酸同源性较高,核苷酸在93.7%~99.6%,氨基酸为99.4%。结论在云南省德宏州采集蠓中分离的病毒YN222为澳大利亚东方型SINV,这是首次在蠓中分离到SINV。

关键词：辛德毕斯病毒蠓分离鉴定系统进化分析

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