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中国动物传染病学报 2020年

作者：谢佳芮寇美玲苗海生云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室农业农村部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室

为实现对口蹄疫病毒（FMDV）感染的现场快速检测，本研究于GenBank下载全球具有代表性的107条血清O型、A型和Asia-1型FMDV基因组序列，截取并比对FMDV高度保守的3D（RNA聚合酶）基因序列，设计17套环介导等温扩增引物，并对反应体系和... 详细信息

为实现对口蹄疫病毒（FMDV）感染的现场快速检测，本研究于GenBank下载全球具有代表性的107条血清O型、A型和Asia-1型FMDV基因组序列，截取并比对FMDV高度保守的3D（RNA聚合酶）基因序列，设计17套环介导等温扩增引物，并对反应体系和反应条件进行优化，建立FMDV群特异性RT-LAMP技术。该技术在反应前用石蜡密封PicoGreen染料，实现了免开盖可视化判定检测结果；该技术对PRV、PRRSV、AKAV、BTV-1、BTV-16、EHDV、CHUV等偶蹄动物病毒未见非特异性扩增；最低可检测3.4×10-6 ng/μL的病毒RNA，灵敏度是RT-qPCR技术的10倍，是一步法RT-PCR的100倍；尝试应用RT-LAMP对94份RNA临床样品进行检测比对，该检测方法与RT-PCR方法和RT-qPCR 方法对临床样品检测的符合率均为82.8%。本研究建立的FMDV群特异性RT-LAMP快速核酸检测技术，具有准确性高、快速简便的优点，可用作家畜FMDV早期感染的现场诊断技术。

关键词：口蹄疫病毒环介导等温核酸扩增群特异性引物

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口蹄疫病毒群特异性RT-LAMP检测技术的建立及试用

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中国动物传染病学报 2020年

作者：谢佳芮寇美玲苗海生云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室农业农村部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室

为实现对口蹄疫病毒（FMDV）感染的现场快速检测，本研究于GenBank下载全球具有代表性的107条血清O型、A型和Asia-1型FMDV基因组序列，截取并比对FMDV高度保守的3D（RNA聚合酶）基因序列，设计17套环介导等温扩增引物，并对反应体系和反应条件进行优化，建立FMDV群特异性RT-LAMP技术。该技术在反应前用石蜡密封PicoGreen染料，实现了免开盖可视化判定检测结果；该技术对PRV、PRRSV、AKAV、BTV-1、BTV-16、EHDV、CHUV等偶蹄动物病毒未见非特异性扩增；最低可检测3.4×10-6ng/μL的病毒RNA，灵敏度是RT-qPCR技术的10倍，是一步法RT-PCR的100倍；尝试应用RT-LAMP对94份RNA临床样品进行检测比对，该检测方法与RT-PCR方法和RT-qPCR 方法对临床样品检测的符合率均为82.8%。本研究建立的FMDV群特异性RT-LAMP快速核酸检测技术，具有准确性高、快速简便的优点，可用作家畜FMDV早期感染的现场诊断技术。

关键词：口蹄疫病毒环介导等温核酸扩增群特异性引物

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口蹄疫病毒群特异性RT-LAMP检测技术的建立及试用

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中国动物传染病学报 2022年第3期30卷 119-126页

作者：谢佳芮寇美玲苗海生云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室农业农村部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室昆明650224

为实现对口蹄疫病毒(FMDV)感染的现场快速检测,本研究于GenBank下载全球具有代表性的107条血清O型、A型和Asia-1型FMDV基因组序列,截取并比对FMDV高度保守的3D(RNA聚合酶)基因序列,设计17套环介导等温扩增引物,并对反应体系和反应条件... 详细信息

为实现对口蹄疫病毒(FMDV)感染的现场快速检测,本研究于GenBank下载全球具有代表性的107条血清O型、A型和Asia-1型FMDV基因组序列,截取并比对FMDV高度保守的3D(RNA聚合酶)基因序列,设计17套环介导等温扩增引物,并对反应体系和反应条件进行优化,建立FMDV群特异性RT-LAMP技术。该技术在反应前用石蜡密封PicoGreen染料,实现了免开盖可视化判定检测结果;该技术对PRV、PRRSV、AKAV、BTV-1、BTV-16、EHDV、CHUV等偶蹄动物病毒未见非特异性扩增;最低可检测3.4×10;ng/μL的病毒RNA,灵敏度是RT-qPCR技术的10倍,是一步法RT-PCR的100倍;尝试应用RT-LAMP对94份RNA临床样品进行检测比对,该检测方法与RT-PCR方法和RT-qPCR方法对临床样品检测的符合率均为82.8%。本研究建立的FMDV群特异性RT-LAMP快速核酸检测技术,具有准确性高、快速简便的优点,可用作家畜FMDV早期感染的现场诊断技术。

关键词：口蹄疫病毒环介导等温核酸扩增群特异性引物

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环介导等温扩增技术的最新研究进展

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畜牧与兽医 2021年第2期53卷 119-125页

作者：谢佳芮寇美玲苗海生云南省畜牧兽医科学院/云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室/农业部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室云南昆明650224

环介导等温核酸扩增技术是一种新型的核酸扩增技术,其核心原理是对靶基因片段的6个区域设计3对引物,实现对靶基因片段地快速、高效扩增。该技术目前已广泛的运用于一些领域。通过简述该技术的原理方法,在一些领域的运用,总结该技术国内... 详细信息

环介导等温核酸扩增技术是一种新型的核酸扩增技术,其核心原理是对靶基因片段的6个区域设计3对引物,实现对靶基因片段地快速、高效扩增。该技术目前已广泛的运用于一些领域。通过简述该技术的原理方法,在一些领域的运用,总结该技术国内外目前的研究进展以及改进措施,分析该技术未来的发展趋势,对环介导等温核酸扩增技术有一个全面的了解,以期为今后该技术的发展运用提供一定的参考依据。

关键词：环介导等温扩增技术应用及改进研究进展未来趋势

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用乙基环丙沙星重建受猪鼻支原体污染的BHK-21细胞的研究

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中国畜牧兽医 2011年第12期38卷 45-49页

作者：高林廖德芳姚俊肖雷李华春张念祖李志华云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室农业部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室云南昆明650224

为重建受猪鼻支原体人为污染的BHK-21细胞,本研究采用含10mg/L乙基环丙沙星的培养液,对受污染的BHK-21细胞进行物理、化学相结合的循环处理,并用DNA荧光染色法和PCR法对处理进行全程监测。结果发现,4次循环处理并再传3代后,猪鼻支原体... 详细信息

为重建受猪鼻支原体人为污染的BHK-21细胞,本研究采用含10mg/L乙基环丙沙星的培养液,对受污染的BHK-21细胞进行物理、化学相结合的循环处理,并用DNA荧光染色法和PCR法对处理进行全程监测。结果发现,4次循环处理并再传3代后,猪鼻支原体污染已被彻底清除,细胞恢复了健康。此方法为抢救受支原体污染的细胞提供了参考。

关键词：乙基环丙沙星猪鼻支原体 BHK-21细胞清除污染

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用乙基环丙沙星重建受大肠杆菌污染的BHK-21细胞

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中国畜牧兽医 2011年第11期38卷 214-217页

作者：高林廖德芳姚俊张念祖李华春李志华云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室农业部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室云南昆明650224

为重建受大肠杆菌污染的BHK-21细胞,本研究采用药物乙基环丙沙星,先测出该药对大肠杆菌的最低抑制浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),再测出该药对BHK-21细胞的MIC,从而确定10mg/L为乙基环丙沙星不影响细胞生长,又能抑制大肠... 详细信息

为重建受大肠杆菌污染的BHK-21细胞,本研究采用药物乙基环丙沙星,先测出该药对大肠杆菌的最低抑制浓度(minimum inhibitory concentration,MIC),再测出该药对BHK-21细胞的MIC,从而确定10mg/L为乙基环丙沙星不影响细胞生长,又能抑制大肠杆菌的安全浓度。然后用含该浓度乙基环丙沙星的MEM生长液,对受污染的BHK-21细胞进行物理、化学相结合的循环处理。经过3次循环处理,再传3代后,确认大肠杆菌污染已经被彻底清除,细胞恢复了健康。此方法为抢救受细菌污染的细胞提供了参考。

关键词：乙基环丙沙星大肠杆菌 BHK-21细胞清除污染

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链特异性RT-PCR方法检测口蹄疫病毒负链RNA

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生物技术通报 2012年第1期28卷 130-133,144页

作者：王继华信爱国朱明旺苗海生胡骑廖德芳李乐李华春云南省保山疫苗厂保山678000 云南省畜牧兽医科学院农业部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室云南省热带亚热带动物病毒重点实验室昆明650224

旨在建立一种快速、灵敏、特异的检测口蹄疫病毒在复制过程中产生的负链RNA的方法。根据口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)病毒5'-非编码区(5'-UTR)基因序列,设计了5条引物链特异性RT-PCR引物,建立检测口蹄疫病毒... 详细信息

旨在建立一种快速、灵敏、特异的检测口蹄疫病毒在复制过程中产生的负链RNA的方法。根据口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)病毒5'-非编码区(5'-UTR)基因序列,设计了5条引物链特异性RT-PCR引物,建立检测口蹄疫病毒负链RNA的链特异性RT-PCR方法。提取FMD病毒RNA,应用设计的正向引物T1-H1做反转录引物,经反转录和RNA酶A消化后,再经两轮链特异性PCR扩增,可特异性地检测FMDV在复制过程中产生的负链RNA。所建立的检测口蹄疫病毒负链RNA的链特异性RT-PCR方法是一种可靠的方法,在确定细胞培养物和动物感染FMDV的病毒复制和了解病毒的致病性研究中具有应用前景。

关键词：口蹄疫病毒链特异性RT-PCR 复制中间体负链RNA 感染

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单细胞克隆技术提纯分化的IBRS-2细胞研究

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中国畜牧兽医 2011年第6期38卷 87-90页

作者：高林李乐廖德芳朱明旺李华春云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室农业部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室云南昆明650224 云南省保山疫苗厂云南保山678000

IBRS-2细胞出现分化变异影响使用,为不影响正常的科学研究,本研究采用单细胞克隆的方法重新提纯,用96孔板经过3周的独立培养后,将具有代表性的4株进行扩增,然后用已知毒价的口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FM-DV)弱毒分别对... 详细信息

IBRS-2细胞出现分化变异影响使用,为不影响正常的科学研究,本研究采用单细胞克隆的方法重新提纯,用96孔板经过3周的独立培养后,将具有代表性的4株进行扩增,然后用已知毒价的口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FM-DV)弱毒分别对其进行接毒试验和TCID50测定。结果表明,B1株克隆细胞的病变最为理想,其TCID50为7.60,比提纯前的4.52更接近实际毒价7.85,且和实际毒价无显著差异。

关键词：单细胞克隆 IBRS-2细胞分化提纯

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对猪繁殖与呼吸综合征病毒易感的Marc-145细胞克隆株的筛选

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畜牧与兽医 2020年第11期52卷 67-71页

作者：谢佳芮寇美玲陈培富苗海生云南农业大学动物医学院云南昆明650201 云南省畜牧兽医科学院/云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室/农业部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室云南昆明650224

为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)在Marc-145细胞中的增殖效价,本研究旨在筛选出一株对该病毒易感度高的Marc-145细胞株。采用有限稀释法从母代细胞中分离单细胞克隆株,通过... 详细信息

为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)在Marc-145细胞中的增殖效价,本研究旨在筛选出一株对该病毒易感度高的Marc-145细胞株。采用有限稀释法从母代细胞中分离单细胞克隆株,通过RT-PCR的方法测定毒株在克隆细胞上的核酸量,通过TCID50检测毒株对克隆细胞株的易感性,同时进行细胞生长曲线绘制。结果表明,获得2-D4、2-E6、2-C8、2-G9、2-H11株共5株Marc-145克隆细胞。接毒72 h后,2-D4、2-E6、2-C8和2-H11株细胞出现明显细胞病变,2-G9株和母代细胞培养上清液核酸检测呈阳性,但未出现细胞病变。同时,2-D4株对PRRSV毒株高度易感,该克隆细胞的分裂增殖能力要强于其他克隆株。综合上述试验结果,2-D4株更适宜于PRRSV培养,因此采用有限稀释法筛选对PRRSV易感的Marc-145细胞是一种可行的科学研究方法。

关键词：单细胞克隆 Marc-145细胞有限稀释法 PRRSV 易感株

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非洲马瘟病毒群特异性RT-PCR检测方法的研究

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生物技术通报 2011年第4期27卷 204-207页

作者：赵文华杨仕标王金萍李富祥云南省畜牧兽医科学院农业部热带亚热带动物病毒学重点开放实验室国家外来动物疫病诊断实验室昆明650224

非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)为双股RNA病毒,感染所有马科动物。设计2对位于AHSV基因组S7片段的引物,经RT-PCR扩增,证实2对引物对6种血清型的AHSV RNA均有特异性扩增,且能对同属的蓝舌病病毒(BTV)、鹿出血热病毒(EH... 详细信息

非洲马瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)为双股RNA病毒,感染所有马科动物。设计2对位于AHSV基因组S7片段的引物,经RT-PCR扩增,证实2对引物对6种血清型的AHSV RNA均有特异性扩增,且能对同属的蓝舌病病毒(BTV)、鹿出血热病毒(EHDV)进行区别诊断。经序列测定及Blast,证实所扩增的条带确为AHSV S7相应位置核苷酸序列,表明已初步建立AHSV群特异性RT-PCR检测方法。

关键词：非洲马瘟病毒 S7基因片段 RT-PCR 序列测定

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