检索结果-内蒙古大学图书馆

中国生物制品学杂志 2018年第2期31卷 181-187页

作者：毕研伟李智华龙琼张辉陈晨李亚东李育中寸韡中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的建立一种简单、快速检测丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染的荧光细胞系检测系统,并用其检测HCV滴度。方法通过RT-PCR法获得干扰素β启动刺激因子-1(interferon beta promoter stimulator-1,IPS-1)蛋白C-端第462-540位氨基酸... 详细信息

目的建立一种简单、快速检测丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染的荧光细胞系检测系统,并用其检测HCV滴度。方法通过RT-PCR法获得干扰素β启动刺激因子-1(interferon beta promoter stimulator-1,IPS-1)蛋白C-端第462-540位氨基酸(C462-540)的基因序列及含有SV40核定位信号的IPS-1(C462-540)基因序列,插入经同样酶切的慢病毒表达载体LV-CAG--EGFP-WPRE、LV-CAG—mCherry(RFP)-WPRE,构建表达EGFP-IPS-1(C462-540)、RFP-NLS-IPS-1(C462-540)的慢病毒重组表达质粒;在此基础上构建含有IPS-1(C462-540)-2A-EGFP-puro、IPS-1(C462-540)-IRES-EGFP-puro的慢病毒重组表达质粒;利用293T细胞包装含有IPS-1(C462-540)蛋白的重组慢病毒;感染Huh7.5细胞,流式细胞仪筛选稳定表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)、红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的Huh7.5细胞,或用puromycin筛选稳定表达EGFP的Huh7.5细胞;利用10倍系列稀释的HCV感染上述细胞,检测HCV的滴度。结果测序表明4种慢病毒表达质粒构建正确;收获的慢病毒感染Huh7.5细胞48 h后,可见EGFP或RFP表达,经流式细胞仪分选获得了稳定表达EGFP-IPS-1(C462-540)、RFP-IPS-1(C462-540)的细胞系,经puromycin筛选获得了稳定表达EGFP-IPS-1(C462-540)的细胞系;经10倍系列稀释的HCV感染后,弥散在细胞质中的点状EGFP、RFP会扩散到整个细胞或定位到细胞核中,在甲基纤维素的限制下形成明显的荧光噬斑点,通过计算荧光噬斑点数得到用Huh7.5-EGFP-IPS-1(462-540)-IRES-PURO、Huh7.5两种细胞检测的HCV滴度分别为(5.6±0.2)×10~5和(5.5±0.2)×10~5 PFU/mL,二者无显著差异。结论成功构建了含有绿色荧光或红色荧光报告系统的细胞系,建立了一种简单、快速检测HCV滴度的新方法。

关键词：干扰素β启动刺激因子-l 丙型肝炎病毒病毒滴度慢病毒荧光蛋白 Huh7.5细胞

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GⅡ.4型人诺如病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

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中国生物制品学杂志 2020年第10期33卷 1146-1151页

作者：李慧徐靖雯张雪梅吴忠香朱文兵蒋曦李卫宇宋杰董少忠中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心云南昆明650118

目的制备抗GⅡ.4型人诺如病毒(human norovirus,HuNoV)衣壳蛋白VP1单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法PCR扩增GⅡ.4型HuNoV VP1基因序列,将其插入至原核表达载体pGEX-5X-1中,构建重组质粒p GEX-5X-1-VP1,转化至*** BL21,经IPTG诱导表... 详细信息

目的制备抗GⅡ.4型人诺如病毒(human norovirus,HuNoV)衣壳蛋白VP1单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法PCR扩增GⅡ.4型HuNoV VP1基因序列,将其插入至原核表达载体pGEX-5X-1中,构建重组质粒p GEX-5X-1-VP1,转化至*** BL21,经IPTG诱导表达,并通过亲和层析纯化获得重组蛋白GST-VP1。利用杂交瘤技术将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与经GST-VP1抗原免疫的BALB/c小鼠的脾细胞进行融合,通过间接ELISA法筛选出阳性杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,并进行纯化。采用间接ELISA法、Biacore法和Western blot法分别检测单克隆抗体的效价、亲和力及特异性。结果经菌落PCR及测序鉴定,重组质粒pGEX-5X-1-VP1构建正确。重组蛋白GST-VP1相对分子质量约85000,大部分以可溶形式存在,纯化后浓度为1.100 mg/mL。筛选获得3株能分泌GⅡ.4型HuNoV VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为NoV C1、NoV D9和NoV H6,效价均可达1∶10^7以上,亲和力常数KD(M)分别为4.422×10^-7、4.303×10^-8、7.540×10^-7 mol/L,均可与HuNoV VP1天然蛋白及GST-VP1重组蛋白发生特异性结合。结论利用原核表达系统成功表达了GST-VP1蛋白,并通过杂交瘤技术制备了高效价的GⅡ.4型HuNoV VP1特异性单克隆抗体,为GⅡ.4型HuNoV免疫诊断和疫苗的研发奠定了基础。

关键词：诺如病毒衣壳蛋白基因重组原核表达单克隆抗体

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呈现人白细胞介素-13抗原表位的病毒样颗粒疫苗的构建

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中国生物制品学杂志 2013年第11期26卷 1533-1539页

作者：唐增华龙琼姚宇峰黄惟巍杨旭孙文佳刘存宝马雁冰魏云林中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南昆明650118 昆明理工大学生命科学与技术学院云南昆明650500 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118 云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心云南昆明650118

目的构建呈现人白细胞介素-13(interleukin-13,IL-13)抗原表位的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗,为开展IL-13主动免疫干预慢性哮喘进程的研究奠定基础。方法通过抗原性及亲水性预测并结合三维结构分析,获得处于人IL-13分子... 详细信息

目的构建呈现人白细胞介素-13(interleukin-13,IL-13)抗原表位的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)疫苗,为开展IL-13主动免疫干预慢性哮喘进程的研究奠定基础。方法通过抗原性及亲水性预测并结合三维结构分析,获得处于人IL-13分子与其受体结合部位潜在的B细胞表位;根据预测的人IL-13抗原肽,合成寡核苷酸序列,并经变性、退火形成双链DNA片段,插入表达乙肝核心抗原(HBcAg)的pThioHisA-HBcAg(NP)载体中,构建重组表达质粒,转化感受态大肠埃希菌(***)DH5α,IPTG诱导表达;表达的重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析后,经硫酸铵沉淀、洗涤初步纯化,并经凝胶过滤层析、密度梯度离心、电镜观察检测其VLPs的存在;将纯化后的重组蛋白在不使用任何常规佐剂的情况下免疫昆明小鼠,ELISA法检测小鼠血清中IL-13特异性抗体的滴度。结果预测分析获得了3个潜在的B细胞表位;3个重组表达质粒pThioHisA(NP)-A、B、C经双酶切和测序证实构建正确;表达的重组蛋白HBcAg+A、B、C相对分子质量分别约为20 000、19 000、18 500,可被兔抗人IL-13多克隆抗体特异性识别,并以VLPs形式存在;HBcAg+A和HBcAg+B重组蛋白诱导小鼠产生了较强的抗体应答,血清中IL-13抗体滴度最高可达1∶64 000,而HBcAg+C重组蛋白未见特异抗体应答。结论成功构建了呈现人IL-13抗原表位的VLPs疫苗,该疫苗可有效打破B细胞免疫耐受,免疫小鼠后产生了高滴度的特异性抗体,为进一步在猴体哮喘模型和人类临床试验中开展IL-13疫苗主动免疫干预哮喘疾病进程的研究奠定了基础。

关键词：白细胞介素-13 病毒样颗粒疫苗

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人埃可病毒20型KM／EV20／2010分离株的全基因组序列分析

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中华流行病学杂志 2015年第5期36卷 501-505页

作者：潘玥邵聪文王晓辉朱艳菊陈俊英陈伟马绍辉刘建生中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的对人埃可病毒20型（EcH020）KM／EV20／2010分离株全基因组进行序列测定，并分析其分子变异和进化特点。方法设计针对KM／EV20／2010引物，提取病毒RNA，RT-PCR扩增和序列测定获得全基因序列。利用Mega4．1、RDP3和SimPlot3．5．1... 详细信息

目的对人埃可病毒20型（EcH020）KM／EV20／2010分离株全基因组进行序列测定，并分析其分子变异和进化特点。方法设计针对KM／EV20／2010引物，提取病毒RNA，RT-PCR扩增和序列测定获得全基因序列。利用Mega4．1、RDP3和SimPlot3．5．1软件分析全基因序列。结果KM／EV20／2010病毒株基因组全长7395bp个核苷酸（nt），5’端和3’端分别为744nt和96nt的非编码区，5’和3’非编码区间为一个6549rlt长的开放阅读框，编码一个含2183个氨基酸的多聚蛋白，编码区内未见核苷酸的插入或缺失。与GenBank中现有唯-1株ECH020JVl-1原型株全基因组序列相比对，核苷酸同源性为80．1％，氨基酸同源性为96．7％；构建基于全长VP1基因序列的进化树图并进行基因分型分析，ECH020可分为6个基因型，中国分离株分属Ⅲ和Ⅳ基因型，其中KM／EV20／2010属于基因型Ⅳ，且6个基因型之间核苷酸的差异为9．4％-21．7％。基于全基因组序列的种系进化分析提示KM／EV20／2010分离株与ECH020原型株JV-1遗传距离很远，未与原型株JV-1聚簇分布，而与ECH030病毒株遗传距离较近。分析发现KM／EV20／2010序列在非结构区可能存在重组。结论中国ECH020可分为6个基因型，KM／EV20／2010分离株属于Ⅳ基因型。

关键词：埃可病毒全基因组序列分析

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2009年云南省柯萨奇病毒B3型分离株A103／KM／09全基因序列分析

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中华流行病学杂志 2013年第12期34卷 1208-1212页

作者：杨卉娟刘建生张云昆马忠飞赵卫中潘玥陈俊英邵聪文马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的分析2009年云南省脑炎患儿粪便标本分离的柯萨奇病毒B3型分离株A103／KM／09全基因序列，了解其遗传特性。方法设计针对柯萨奇病毒B3型引物，提取病毒RNA、RT-PCR扩增和产物直接测序获得全基因组序列，利用Geneious和Mega5．05软件... 详细信息

目的分析2009年云南省脑炎患儿粪便标本分离的柯萨奇病毒B3型分离株A103／KM／09全基因序列，了解其遗传特性。方法设计针对柯萨奇病毒B3型引物，提取病毒RNA、RT-PCR扩增和产物直接测序获得全基因组序列，利用Geneious和Mega5．05软件进行核苷酸、氨基酸序列比对及其系统进化分析，应用RDP3和SimPlot3．5．1重组软件对序列进行重组分析。结果该分离株全基因组核苷酸序列长度为7389bp。其核苷酸和氨基酸序列与其原型株Nancy的同源性分别为81．0％和95．7％；与其他柯萨奇病毒B3型毒株的各区段核苷酸和氨基酸同源性分别为81．0％～88．0％和95．7％～98．0％；进化分析发现CVB3可分为5个分支（I～V），核苷酸之间的差异为16．2％-24．3％；中国分离株属V分支，又可分为A～D亚分支，核苷酸之间的差异为4．3％～11．4％。并发现A103／KM／09株基因序列在非结构区可能存在重组事件。结论柯萨奇病毒B3型分为5个基因型，云南分离株A103／KM／09属于V—D亚型，而中国分离株已经发生一定进化。

关键词：柯萨奇病毒B3型全基因序列序列分析

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2009年云南省柯萨奇病毒B5：分离株A210／KM／09全基因序列分析

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中华流行病学杂志 2014年第3期35卷 307-311页

作者：刘建生邵聪文赵卫中张云昆吉玛朱艳菊马忠飞马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所昆明650118 云南省重大传染病疫苗研发重点实验室

目的分析柯萨奇病毒B5（CVB5）云南分离株A210／K2~I／09全基因序列及其遗传特性。方法设计针对CVB5引物，提取病毒RNA，RT-PCR扩增和产物直接测序获得序列，利用Mega4．1、RDP3和SimPlot3．5．1软件分析全基因序列。结果CVB5A210／KM... 详细信息

目的分析柯萨奇病毒B5（CVB5）云南分离株A210／K2~I／09全基因序列及其遗传特性。方法设计针对CVB5引物，提取病毒RNA，RT-PCR扩增和产物直接测序获得序列，利用Mega4．1、RDP3和SimPlot3．5．1软件分析全基因序列。结果CVB5A210／KM／09全基因组核苷酸序列长度为7372bp，编码含2185个氨基酸残基的多聚蛋白；A210／KM／09全基因组核苷酸及所推导的氨基酸与CVB5／CCl0／10同源性最高，其同源性分别为92．5％和97.3％；而与其他CVB5毒株如17Y、19CSF、20CSF、1954／85／US、2000／CSF／KOR、03001N、CoxB5／Henard2010、CVB5／SD／09和Faulkner核苷酸和氨基酸同源性分别为80．1％～92．5％和95．0％～97.3％；A210／KM／09与其他CVB5毒株的各区段核苷酸和氨基酸同源性分别为75.3％～96.3％和85．3％～100．O％，其中与VP3、3D区段核苷酸的同源性最低。基于CVB5全长VPl基因序：列进行种系进化分析，可将CVB5分为A、B、C和D4个基因型，其中C基因型可再分为C1～C4基因亚型，D基因型可再分为D1～D4基因亚型。中国CVB5流行株主要聚集在C4基因亚型，国外流行株主要聚集在D1、C2亚型。结论A210／KM／09分离株为C4基因型。

关键词：柯萨奇B组5型病毒全基因组序列分析进化树图

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2009年云南省 Echo30分离株 KM／A363／09全基因组序列分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2014年第5期34卷 388-392页

作者：白巍陈俊英潘玥朱艳菊邵聪文刘建生马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

目的：对2009年从中国云南省1名脑炎患儿粪便标本中分离到的Echo30云南分离株KM／A363／09进行全基因组测序和分析，了解该株病毒的遗传特性。方法设计针对Echo30引物，提取病毒RNA、RT-PCR扩增和产物直接测序获得全基因组序列，利用Gen... 详细信息

目的：对2009年从中国云南省1名脑炎患儿粪便标本中分离到的Echo30云南分离株KM／A363／09进行全基因组测序和分析，了解该株病毒的遗传特性。方法设计针对Echo30引物，提取病毒RNA、RT-PCR扩增和产物直接测序获得全基因组序列，利用Geneious和Mega5．1软件进行核苷酸、氨基酸序列比对及其系统进化分析，应用RDP3和SimPlot3．5．1重组软件对序列进行重组分析。结果该分离株全基因组核苷酸序列长度为7425 bp，编码2194个氨基酸。其核苷酸和氨基酸序列与其原型株Bastianni的同源性分别为81．2％和95．8％；与其他Echo30型毒株的各区段核苷酸和氨基酸同源性分别为81．2％～88．6％和95．8％～97．8％；进化分析发现KM／A363／09毒株属于中国Echo30分支中的一支。而且发现KM／A363／09株基因序列在非结构区可能存在重组事件。结论云南分离株KM／A363／09属于中国Echo30分支中的一支，而中国分离株已经发生一定的进化。

关键词： Echo30 全基因序列序列分析 Echovirus 30

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单纯疱疹病毒1型与阿尔茨海默病的研究进展

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中华微生物学和免疫学杂志 2021年第2期41卷 149-153页

作者：高杨李雪琦李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)感染常引起口唇疱疹,但近年来其引发的生殖器疱疹越来越多,且与阿尔茨海默病等神经系统疾病的发生密切相关。阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种慢性进行性的中枢神经系统变... 详细信息

单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)感染常引起口唇疱疹,但近年来其引发的生殖器疱疹越来越多,且与阿尔茨海默病等神经系统疾病的发生密切相关。阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种慢性进行性的中枢神经系统变性病,其发病机制尚未完全阐明,目前也缺乏能够明确改善该疾病的药物。关于AD的HSV-1致病假说由来已久,但一直没有确切的证据证明两者之间的联系,本文将对HSV-1导致AD发病机制的研究进展进行简单综述。

关键词：单纯疱疹病毒1型阿尔茨海默病 β淀粉样蛋白 tau蛋白

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基因组编辑技术在1型单纯疱疹病毒研究中的作用和意义

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中华微生物学和免疫学杂志 2016年第6期36卷 472-476页

作者：徐兴丽李琦涵中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室昆明650118

病毒基因组编辑技术对研究病毒基因的功能及病毒感染性疾病的治疗有着不可或缺的作用。随着基因工程技术的发展，多种病毒基因组突变技术应运而生。传统的同源重组技术一直用于编辑病毒基因组，然而，该技术的重组频率极低。此后，基因... 详细信息

病毒基因组编辑技术对研究病毒基因的功能及病毒感染性疾病的治疗有着不可或缺的作用。随着基因工程技术的发展，多种病毒基因组突变技术应运而生。传统的同源重组技术一直用于编辑病毒基因组，然而，该技术的重组频率极低。此后，基因组较大的病毒如单纯疱疹病毒1型（HSV-1）可以通过细菌人工染色体质粒系统进行编辑，但是将较大的病毒基因组克隆到细菌人工染色体质粒费力费时，并且质粒的部分基因或药物选择标记物可能残留在病毒基因组内而影响病毒基因的功能。2013年发现的CRISPR-cas9系统可以完成对各类DNA病毒高效准确的定点基因编辑，而且该系统在对病毒基因组进行编辑过程中不会遗留系统自身的遗传物质。本文就同源重组技术、细菌人工染色体和CRISPR-cas9系统这三类基因组编辑技术在 HSV-1相关研究中的应用进行简要综述。

关键词：基因组编辑技术单纯疱疹病毒1型

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柯萨奇病毒A组4型分离株全基因序列分析

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中国病原生物学杂志 2021年第5期16卷 540-545页

作者：冯昌增张名许丹菡丛山日张铭润乔燕侯丁琳杨昭庆马绍辉中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗研发重点实验室云南昆明650118

目的分析1株柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4,CV-A4)毒株的全基因组序列和系统进化特征。方法使用细胞培养法对肠道病毒阳性标本中的病毒进行分离。提取病毒RNA,通过RT-PCR法分段扩增全基因组,经测序、比对和组装后获得CV-A4分离株... 详细信息

目的分析1株柯萨奇病毒A组4型(coxsackievirus A4,CV-A4)毒株的全基因组序列和系统进化特征。方法使用细胞培养法对肠道病毒阳性标本中的病毒进行分离。提取病毒RNA,通过RT-PCR法分段扩增全基因组,经测序、比对和组装后获得CV-A4分离株的全基因组序列。利用MEGA7.0软件分别基于全长VP1序列和全基因组序列构建系统发育树;使用Geneious Prime 2020.1.2软件对全基因组及编码区各区段的核苷酸和氨基酸序列同源性进行分析,并对编码区氨基酸变异情况进行比较分析。结果从人类横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞上分离到1株CV-A4分离株,命名为R09220/YN/CHN/2009。基于全长VP1序列的系统进化分析显示,该分离株属于C2基因亚型。在全基因组核苷酸序列上与其同源性最高的是CV-A4毒株CVA4/SZ/CHN/09(核苷酸为95.4%,氨基酸为98.7%)。与C2基因亚型内16株CV-A4代表株的全序列核苷酸相似性为88.4%~95.4%,氨基酸序列相似性为97.5%~98.7%。通过比较C2基因亚型内的23株CV-A4分离株的全基因组氨基酸序列,R09220/YN/CHN/2009共存在23个氨基酸变异位点,其中10个为其独有的变异位点。结论R09220/YN/CHN/2009为肠道病毒CV-A4,属于C2基因亚型,该亚型在中国大陆流行的CV-A4病毒中占据优势地位。

关键词：柯萨奇病毒A组4型全基因组系统进化分析

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