检索结果-内蒙古大学图书馆

西北农林科技大学学报(自然科学版) 2025年第2期53卷 1-9,31页

作者：祁钊余相宇陈魏圆宋祥军安徽农业大学兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室安徽省动物性食品质量与生物安全工程重点实验室安徽合肥230036

【目的】利用PfAgo蛋白结合环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种新的PCV3检测方法LAMP-PfAgo法,用于PCV3的快速鉴别诊断。【方法】PCR扩增PCV3 Rep基因,构建重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep,对其进行PCR和测序鉴定。根据PCV3 Rep基因的保守... 详细信息

【目的】利用PfAgo蛋白结合环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种新的PCV3检测方法LAMP-PfAgo法,用于PCV3的快速鉴别诊断。【方法】PCR扩增PCV3 Rep基因,构建重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep,对其进行PCR和测序鉴定。根据PCV3 Rep基因的保守区域设计PCV3-T1~PCV3-T4等4组引物(每组包括1对内引物和1对外引物),以pMD19-T-PCV3-Rep为模板进行LAMP,筛选最佳引物组,并对LAMP反应的Mg ^(2+)浓度、内外引物浓度、反应温度、反应时间进行优化。根据PCV3 Rep基因的保守序列,设计PCV3-gs1~PCV3-gs5等5组gDNAs和一条特异性探针,进行LAMP-PfAgo反应,筛选最佳的gDNAs,并对LAMP-PfAgo反应体系中PfAgo蛋白浓度、gDNAs浓度、Mn 2+浓度和反应时间进行优化。对该LAMP-PfAgo方法的特异性、敏感性进行评价;并用该方法和实时荧光定量PCR方法对疑似感染PCV3的46份临床样品进行检测,比较结果的一致性。【结果】重组阳性质粒pMD19-T-PCV3-Rep PCR和测序均获得了891 bp的序列,表明重组阳性质粒构建成功。LAMP最佳引物为PCV3-T1,最佳Mg ^(2+)终浓度为6 mmol/L,最佳内外引物终浓度分别为1.6和1.2μmol/L,最适的反应温度65℃,最佳反应时间60 min。使用优化后的LAMP反应条件对PCV3 Rep基因保守序列进行扩增,并将其用于后续试验。LAMP-PfAgo反应最佳的gDNAs为PCV3-gs1;优化后的PfAgo蛋白终浓度为40 U/μL,gDNAs终浓度为1.50μmol/L,Mn 2+终浓度为1.50 mmol/L,反应时间为30 min。LAMP-PfAgo法的灵敏度为10拷贝/μL,且与猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒及猪伪狂犬病毒等常见猪源病原核酸无交叉反应。临床样本检测结果显示,LAMP-PfAgo法与实时荧光定量PCR方法检测结果的符合率为100%。【结论】基于PfAgo蛋白结合LAMP技术建立了对PCV3的核酸检测方法,该方法灵敏度高和特异性强,具有潜在的临床应用价值。

关键词：猪圆环病毒3型 PfAgo 环介导等温扩增即时检验猪

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鸡cGAS基因的克隆、表达特性分析及FAdV-4感染前后亚细胞定位变化

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江苏农业学报 2023年第2期39卷 453-460页

作者：曹影丽刘琪柴震震杨侃侃梁月巧宋祥军邵颖涂健祁克宗兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室/安徽省动物性食品质量与生物安全工程实验室安徽合肥230036

cGAS作为一种新型的胞质DNA受体,在宿主抵抗DNA病毒而触发的天然免疫中起着至关重要的作用。血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)是无囊膜的一种双链DNA病毒,可引起鸡肝炎-心包积液综合征。为明确鸡cGAS(chcGAS)基因功... 详细信息

cGAS作为一种新型的胞质DNA受体,在宿主抵抗DNA病毒而触发的天然免疫中起着至关重要的作用。血清4型禽腺病毒(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)是无囊膜的一种双链DNA病毒,可引起鸡肝炎-心包积液综合征。为明确鸡cGAS(chcGAS)基因功能,探究在鸡肝癌(LMH)细胞中过表达chcGAS以及FAdV-4感染前后细胞定位的变化情况。本研究针对chcGAS序列设计引物进行PCR扩增,并分析该基因序列与其他物种之间的同源性以及预测该基因的结构域,构建重组质粒pET-32a-chcGAS进行原核表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定,利用激光共聚焦观察FAdV-4感染LMH细胞前后chcGAS细胞定位变化。结果表明,本试验克隆得到大小为1317 bp的chcGAS基因,与其他物种同源性为50.5%~84.4%,SDS-PAGE分析结果显示,chcGAS蛋白主要以可溶性蛋白质的形式在上清液处表达,目的蛋白质相对分子质量为75000,与预期大小相符。亚细胞定位结果显示,FAdV-4感染可导致定位于细胞核膜上的chcGAS蛋白转移到细胞质中。本研究结果为进一步研究FAdV-4与cGAS-STING信号通路的关联调控机制提供了科学依据。

关键词： cGAS 血清4型禽腺病毒(FAdV-4) 序列分析原核表达亚细胞定位

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鸡DDX 41基因克隆表达、细胞定位及其在禽腺病毒4型感染调控天然免疫中的作用

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浙江农业学报 2023年第5期35卷 1028-1036页

作者：刘琪曹影丽魏宁波杨侃侃梁月巧宋祥军邵颖涂健祁克宗兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室安徽省动物性食品质量与生物安全工程实验室安徽合肥230036

为获得鸡DDX41(chDDX41)的原核表达蛋白,探讨chDDX41的细胞定位及其在禽腺病毒4型(FAdV-4)感染引起的天然免疫中的作用。根据GenBank中chDDX41基因序列,设计特异性引物,以LMH细胞cDNA为模板扩增,将扩增序列连接至pET-32a、pCAGGS-HA、pC... 详细信息

为获得鸡DDX41(chDDX41)的原核表达蛋白,探讨chDDX41的细胞定位及其在禽腺病毒4型(FAdV-4)感染引起的天然免疫中的作用。根据GenBank中chDDX41基因序列,设计特异性引物,以LMH细胞cDNA为模板扩增,将扩增序列连接至pET-32a、pCAGGS-HA、pCMV-3×Flag和pmCherry-C1空载体,构建重组质粒。将pET-32a-chDDX 41转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达。利用激光共聚焦显微镜观察chDDX41在鸡肝癌细胞(LMH)和鸡巨噬细胞(HD11)中的亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测在LMH细胞中过表达chDDX 41对IFN-β等细胞因子表达量的影响。结果表明,克隆得到1854 bp的chDDX 41基因,共编码617个氨基酸。SDS-PAGE结果显示,重组蛋白pET-32a-chDDX41主要以可溶性蛋白的方式在上清液中表达,经Western Blot鉴定,在90 ku左右有特异性条带,与预期结果一致;chDDX41在LMH和HD11细胞中主要定位在细胞核;FAdV-4感染过表达chDDX 41基因后的LMH细胞,发现IFN-β、IL-6、IL-1β和IL-8等细胞因子在mRNA水平上的表达量上调,表明chDDX41参与了FAdV-4引起的天然免疫应答。研究结果可为进一步研究DDX 41基因功能及其在天然免疫中的分子机制提供参考。

关键词： chDDX41 原核表达细胞定位禽腺病毒4型天然免疫

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hipA对禽致病性大肠杆菌生物学特性和致病性的影响

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2023年第8期51卷 11-18,28页

作者：吴晓妍吴剑梅傅丹丹涂健宋祥军邵颖祁克宗安徽农业大学动物科技学院兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室安徽省动物性食品质量与生物安全工程实验室安徽合肥230036

【目的】探究毒素-抗毒素(TA)系统中毒素基因hipA对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性和致病性的影响,为深入研究TA系统和APEC的致病机制提供理论依据。【方法】利用Red同源重组方法,构建禽致病性大肠杆菌野生株AE81的hipA基因缺失株AE8... 详细信息

【目的】探究毒素-抗毒素(TA)系统中毒素基因hipA对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性和致病性的影响,为深入研究TA系统和APEC的致病机制提供理论依据。【方法】利用Red同源重组方法,构建禽致病性大肠杆菌野生株AE81的hipA基因缺失株AE81ΔhipA及回复株C-AE81ΔhipA,测定其生长曲线、运动性、环境耐受能力、细胞黏附能力,并采用实时荧光定量PCR检测环境耐受相关基因(hdeA、hdeB)、黏附相关基因(fimF、fimH)、毒力相关基因(hcp、ompR、ompC)的转录水平,探究毒素蛋白hipA对APEC的生物学功能及致病性的影响。【结果】成功构建hipA基因的缺失株和回复株。野生株AE81、缺失株AE81ΔhipA和回复株C-AE81ΔhipA的生长情况无明显差异。与野生株AE81相比,hipA基因缺失株AE81ΔhipA的运动能力降低,对酸性、碱性、高渗和氧化应激环境的耐受能力减弱,鞭毛和菌毛的数量和长度明显减小,对鸡胚成纤维细胞(DF-1)的黏附能力极显著减弱(P<0.01),回复株C-AE81ΔhipA各指标基本恢复到野生株水平。实时荧光定量PCR结果显示,与野生株AE81相比,AE81ΔhipA菌株的hdeA、hdeB、fimF、ompR、ompC基因转录水平显著降低(P<0.05),hcp基因转录水平差异不显著,但fimH转录水平显著升高(P<0.05)。【结论】TA系统毒素蛋白hipA影响APEC的运动性、环境耐受能力和对细胞的黏附能力,参与APEC的致病过程。

关键词：禽致病性大肠杆菌毒素-抗毒素系统 hipA基因

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禽致病性大肠杆菌Hcp2b对雏鸡脾脏mRNA表达谱的影响

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华北农学报 2022年第1期37卷 232-238页

作者：宋祥军宋自超沈啸陈哲蒋胡艳侯曼曼邵颖涂健祁克宗安徽农业大学兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室安徽省动物性食品质量与生物安全工程实验室安徽合肥230036

为研究效应蛋白Hcp2b在禽致病性大肠杆菌(APEC)感染雏鸡过程中对脾脏的转录组学影响,利用兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室构建保存的hcp2b基因缺失株Δhcp2b及回复株Chcp2b肌肉注射7日龄雏鸡(以AE17菌株为阳性对照),感染24 h... 详细信息

为研究效应蛋白Hcp2b在禽致病性大肠杆菌(APEC)感染雏鸡过程中对脾脏的转录组学影响,利用兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室构建保存的hcp2b基因缺失株Δhcp2b及回复株Chcp2b肌肉注射7日龄雏鸡(以AE17菌株为阳性对照),感染24 h后采集精神沉郁的雏鸡脾脏检测组织载菌量并制作病理切片。选取缺失株Δhcp2b及野生株AE17感染脾脏组织进行转录组学测序,采用Real-time PCR进行测序结果鉴定;而后对差异表达基因进行GO分析、KEGG通路富集分析。结果显示,野生株AE17、缺失株Δhcp2b及回复株Chcp2b在脾脏组织载菌量差异不明显。组织切片观察发现,野生株AE17和缺失株Δhcp2b脾脏均出现组织间隙扩大,有充血现象出现。转录组学分析发现,缺失株Δhcp2b感染雏鸡脾脏后,诱导了脾脏基因mRNA的差异表达,筛选到515个差异表达基因(330个基因下调表达,185个基因上调表达)。Real-time PCR结果发现,Δhcp2b感染雏鸡后,脾脏中IL22、TNFRSF6B、TNFRSF8基因mRNA表达量下调,与测序结果变化趋势一致。GO分析发现,感染24 h雏鸡脾脏差异基因富集在膜、膜的组成、细胞外间隙部分等条目。KEGG分析发现,脾脏差异基因显著富集在内质网蛋白质加工过程的信号通路中。hcp2b基因对APEC在定植脾脏无影响,hcp2b通过影响机体免疫器官中脾脏的内质网蛋白质加工过程的信号通路来参与致病过程。

关键词：雏鸡禽致病性大肠杆菌 Hcp 脾脏内质网蛋白质加工通路

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血清4型禽腺病毒POCT荧光微球免疫层析检测方法的建立

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江苏农业学报 2022年第5期38卷 1298-1305页

作者：邵颖肖福泉王丽丽龚柳菲宋祥军涂健祁克宗兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室安徽合肥230036 安徽省动物性食品质量与生物安全工程实验室安徽合肥230036

为了迅速且便利地判定血清4型禽腺病毒(FAdV-4),设计引物进行扩增,构建重组载体,原核表达的融合蛋白乳化后动物免疫得到多克隆抗体,用Western Blot检测,最后建立即时检验(POCT)荧光微球免疫层析试纸条,并进行初步应用。用POCT荧光微球... 详细信息

为了迅速且便利地判定血清4型禽腺病毒(FAdV-4),设计引物进行扩增,构建重组载体,原核表达的融合蛋白乳化后动物免疫得到多克隆抗体,用Western Blot检测,最后建立即时检验(POCT)荧光微球免疫层析试纸条,并进行初步应用。用POCT荧光微球免疫层析试纸条检测不同浓度的FAdV-4病毒液及临床阳性样本,结果表明,用POCT荧光微球免疫层析试纸条15 min可以检测出结果,且检测出阳性,与临床诊断结果相符。建立的POCT荧光微球免疫层析检测FAdV-4的方法,特异性良好,操作简单且便于携带,检测效率高,有利于基层兽医临床检测。

关键词： FAdV-4 hexon基因原核表达多克隆抗体荧光微球免疫层析

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ETT2转录因子EivF调控禽致病性大肠杆菌运动性和环境胁迫耐受性

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江苏农业学报 2022年第2期38卷 438-445页

作者：吴剑梅傅丹丹李佳璇邵颖宋祥军涂健祁克宗安徽农业大学兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室安徽省动物性食品质量与生物安全工程实验室安徽合肥230036

为探究禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)中大肠杆菌Ⅲ型分泌系统(Escherichia coli TypeⅢsecretion system^(2),ETT2)转录因子EivF的功能,通过透射电镜观察检测野生株(AE81)、缺失株(AE81△eivF)和回复株(AE81△eivF-comp)Curli菌毛的合成能力,并探究3种菌株在不良环境中的存活情况,通过RT-qPCR检测鞭毛和环境耐受相关基因的转录水平。结果表明,与野生株相比,缺失株的curli菌毛合成能力无明显变化,在透射电镜下缺失株鞭毛数量明显减少,缺失株在强酸、强碱、氧化应激、高温、高渗环境中的存活率均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)降低,回复株上述表型基本恢复。转录组数据显示,缺失株的flgB、flgC、flgE等鞭毛相关基因和proV、cadA等环境耐受相关基因的转录水平下调。RT-qPCR结果显示,flgB、flgC、flgE、proV等基因的转录水平下调。综上所述,ETT2转录因子EivF参与调控禽致病性大肠杆菌运动能力和在不良环境中的存活能力。

关键词：禽致病性大肠杆菌 ETT2转录因子EivF 鞭毛环境胁迫

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禽4型腺病毒单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用

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畜牧兽医学报 2025年第5期56卷 2364-2371页

作者：张宇程凡玉俞赵荣邵颖魏宁波陈芳芳王振宇宋祥军涂健祁克宗安徽农业大学动物医学院兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室安徽省动物性食品质量与生物安全工程实验室

本研究旨在制备禽4型腺病毒(fowl adenovirus type 4,FAdV-4)的单克隆抗体，鉴定其特异性结合位点，并评估其在免疫组化(immunohistochemistry, IHC)和免疫沉淀反应中的应用价值。使用纯化的FAdV-4-AH-F41株全病毒免疫小鼠，通过间接酶... 详细信息

本研究旨在制备禽4型腺病毒(fowl adenovirus type 4,FAdV-4)的单克隆抗体，鉴定其特异性结合位点，并评估其在免疫组化(immunohistochemistry, IHC)和免疫沉淀反应中的应用价值。使用纯化的FAdV-4-AH-F41株全病毒免疫小鼠，通过间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)方法筛选出一株阳性杂交瘤细胞并进行亚克隆，并对所制备的单克隆抗体进行效价检测。利用间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)与蛋白免疫印迹(Western blot)方法鉴定单克隆抗体生物学特性，构建了pCold TF-Hexon、pET-32a(+)-Fiber1、pCold TF-Penton、pCold TF-Fiber2的原核表达载体，并通过Western blot初步鉴定所得单克隆抗体的特异性结合位点，在检测出抗体的亚型后，将其初步应用于IHC和免疫沉淀试验。结果表明本试验获得1株稳定分泌抗Fiber1蛋白的单克隆抗体，并将其命名为5C7。该抗体效价为1∶102 400,亚型为IgG-2b,表现出良好的生物学特性。在IHC中，能够观察到明显的病变特征；在免疫沉淀试验中，5C7可作为捕获抗体，与病毒感染细胞中的Fiber1蛋白特异性结合。结果提示，本试验通过全病毒粒子免疫小鼠所制备的单克隆抗体能够特异性识别Fiber1蛋白，并在IHC和免疫沉淀反应中显示出良好的应用前景，为FAdV-4实验室病理诊断方法的建立和Fiber1蛋白的功能研究奠定了基础。

关键词：血清4型禽腺病毒单克隆抗体抗体鉴定 Fiber1蛋白 IHC 免疫共沉淀

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犬肺表面活性蛋白A的克隆及其在昆虫杆状病毒系统的表达

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安徽农业大学学报 2022年第3期49卷 449-453页

作者：熊海凤吴汉文黄学婷李明周倩崔雅倩祁克宗刘红梅兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室安徽省动物性食品质量与生物安全工程实验室安徽农业大学动物科技学院合肥230036

利用RT-PCR方法扩增犬肺表面活性蛋白A(canine lung surfactant protein A,cSP-A)基因,将其连接至p MD18-T载体,经测序正确后,使用DNAMAN软件比对不同种属SP-A基因序列;将cSP-A基因片段经双酶切后连接至pFastbac1载体得到pFastbac1-cSP-A;再将其转化至DH10Bac感受态细胞,获得重组Bacmid质粒,然后转染sf9细胞得到P1代重组杆状病毒P1 rBv-cSP-A,P1代病毒连续扩增3代后,取P4 rBv-cSP-A感染sf9细胞表达cSP-A重组蛋白,利用蛋白免疫印迹和间接免疫荧光试验鉴定表达产物。结果显示cSP-A基因大小为699 bp;不同种属间SP-A的C末端碳水化合物识别结构域的同源性为49.1%~95.5%;经Western Blot和IFA鉴定,重组cSP-A蛋白在细胞内表达未分泌到胞外,分子量大小约为31.84 kDa。

关键词：犬肺表面活性蛋白A 克隆昆虫杆状病毒表达系统表达

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鸡粪堆肥中优势菌及复合固化菌剂载体的筛选

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安徽农业大学学报 2021年第4期48卷 584-589页

作者：邵颖郑倩倩赵鑫铭宋祥军涂健祁克宗安徽农业大学动物科技学院兽医病理生物学与疫病防控安徽省重点实验室安徽省动物性食品质量与生物安全工程实验室合肥230036

为了提高畜禽粪便堆肥降解效率和堆肥质量,比较不同堆肥时期微生物菌群结构和多样性。基于高通量测序分析堆肥前、中和腐熟时期样品的优势细菌,通过检测油脂、淀粉、纤维素、明胶分解性能和生理生化特性,筛选堆肥中的优势菌株,并优化优... 详细信息

为了提高畜禽粪便堆肥降解效率和堆肥质量,比较不同堆肥时期微生物菌群结构和多样性。基于高通量测序分析堆肥前、中和腐熟时期样品的优势细菌,通过检测油脂、淀粉、纤维素、明胶分解性能和生理生化特性,筛选堆肥中的优势菌株,并优化优势菌株的培养条件和筛选最佳的菌剂载体。结果表明:芽孢杆菌是堆肥过程中的优势菌,成功筛选出具有堆肥微生态菌剂优势的3株芽孢杆菌,分别是D1解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、D5苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和D7地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis);3株菌在环境温度为41℃时,pH为6.5~7.5,以酵母提取物为3株菌氮源时,酶活性最高,各菌同组产酶差异显著(P<0.05);以玉米芯粉为载体更能有效保护菌株活性。筛选优质高效的微生物和制备固体堆肥复合菌剂,有利于揭示堆肥过程中微生物作用的本质规律,为加速畜禽排泄物资源化提供有效途径。

关键词：养殖污染芽孢杆菌鸡粪复合堆肥菌剂菌剂固化技术

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