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大肠杆菌对体外培养的奶牛乳腺成纤维细胞TGF-β1和NF-κB及TLR4表达的影响

中国兽医科学 2015年第7期45卷 764-770页

作者：王一吴建美毕艳楠丁玉林王凤龙内蒙古农业大学兽医学院农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

为研究大肠杆菌对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)TGF-β1表达的影响以及对其信号转导通路Toll样受体4(TLR4)的表达和核转录因子κB(NF-κB)活化的影响,采用热灭活的不同浓度大肠杆菌菌液(0、1×105、1×106、1×108 CFU/mL)作用... 详细信息

为研究大肠杆菌对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)TGF-β1表达的影响以及对其信号转导通路Toll样受体4(TLR4)的表达和核转录因子κB(NF-κB)活化的影响,采用热灭活的不同浓度大肠杆菌菌液(0、1×105、1×106、1×108 CFU/mL)作用于奶牛乳腺成纤维细胞,分别于不同时间点(作用后第6、12、24、48小时)运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TGF-β1和TLR4mRNA的表达,运用Western-blot检测TGF-β1、TLR4和p-NF-κB-p65蛋白的相对表达量。结果显示,大肠杆菌作用BMFB后,TGF-β1mRNA和蛋白的表达量显著的升高,并且TGF-β1mRNA的表达呈明显的时效及量效关系,于第24小时达到高峰后降低(P<0.05);TGF-β1蛋白的表达量呈量效性(P<0.05)。TLR4mRNA和蛋白表达水平显著升高,并且TLR4mRNA和蛋白的表达呈时效性和量效性,分别于作用后第24和12小时达到最高后逐渐下降(P<0.05)。p-NF-κB-p65的表达与大肠杆菌作用浓度呈正量效关系,表达量随作用时间延长先升高后逐渐降低(P<0.05)。上述研究结果表明,热灭活的大肠杆菌能够促进BMFB的TLR4表达,并激活BMFB p-NF-κB-p65蛋白的表达,从而促进TGF-β1的表达。

关键词：大肠杆菌奶牛乳腺成纤维细胞 TGF-β1 TLR4 NF-κB

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绵羊肺炎支原体P71蛋白分段表达及其间接ELISA方法的建立

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中国预防兽医学报 2015年第8期37卷 623-627页

作者：黄海碧郑佳琪王仁超王晓晖陈德浩王灵芮郭逸贤郝永清内蒙古农业大学兽医学院/农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

为研究绵羊肺炎支原体(MO)P71蛋白免疫学相关功能及建立MO的快速检测方法,本研究采用PCR扩增MO P71基因片段,测序后利用生物学软件分析P71蛋白的抗原表位,选取抗原表位富集的3个基因片段P71-1(1 bp^516 bp)、P71-2(505 bp^1 338 bp)和P7... 详细信息

为研究绵羊肺炎支原体(MO)P71蛋白免疫学相关功能及建立MO的快速检测方法,本研究采用PCR扩增MO P71基因片段,测序后利用生物学软件分析P71蛋白的抗原表位,选取抗原表位富集的3个基因片段P71-1(1 bp^516 bp)、P71-2(505 bp^1 338 bp)和P71-3(1 327 bp^1 905 bp)分别克隆至原核表达载体p ET-32a中进行表达。分别利用western blot和间接ELISA方法对表达产物的免疫原性、反应原性进行鉴定,以筛选的优势抗原蛋白为诊断抗原,通过对反应条件的优化,建立检测MO抗体的间接ELISA方法。结果表明:重组蛋白P71-3产生的抗体效价最高,与MO阳性血清的结合能力最强,阴阳性临界值为:OD450nm值=0.292。该方法与口蹄疫、小反刍兽疫、副结核、羊布鲁菌病、结核阳性血清均无交叉反应,具有极强的特异性。组内组间变异系数均小于10%,重复性较好。利用该方法与间接血凝试验对150份临床血清样品进行检测,结果显示,两者符合率为96.67%。本研究为进一步研制MO ELISA检测试剂盒奠定了基础。

关键词：绵羊肺炎支原体黏附基因表达抗原性分析 ELISA

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绵羊子宫内膜上皮细胞的培养鉴定及enJSRV囊膜蛋白及其受体Hyal2的瞬时表达

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中国兽医科学 2015年第11期45卷 1189-1195页

作者：张宇飞石晶刘淑英内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010018 农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

为了分离培养绵羊子宫内膜上皮细胞并瞬时表达内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)囊膜蛋白及其受体(Hyal2),采用酶消化法分离培养绵羊子宫内膜上皮细胞,差速消化法纯化细胞。应用角蛋白抗体对细胞进行免疫细胞化学鉴定。扩增enJSRVenv基因及... 详细信息

为了分离培养绵羊子宫内膜上皮细胞并瞬时表达内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)囊膜蛋白及其受体(Hyal2),采用酶消化法分离培养绵羊子宫内膜上皮细胞,差速消化法纯化细胞。应用角蛋白抗体对细胞进行免疫细胞化学鉴定。扩增enJSRVenv基因及其受体Hyal2基因,并构建真核表达质粒,同时在Hela细胞中瞬时表达。结果显示,细胞在相差显微镜下呈明显的上皮样细胞形态,同时细胞角蛋白染色阳性细胞占90%以上。成功构建了真核表达质粒pcDNA4-enJSRVenv及pcDNA4-Hyal2。Western-blot结果显示,真核表达质粒在HeLa细胞中被成功表达。本研究建立了一套高效、简便的子宫内膜上皮细胞培养方法,同时为进一步探究enJSRV囊膜蛋白的结构和功能奠定了试验基础。

关键词：内源性绵羊肺腺瘤病毒内源性反转录病毒囊膜蛋白子宫内膜上皮细胞细胞培养

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枯草芽孢杆菌对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

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畜牧兽医学报 2015年第5期46卷 760-767页

作者：王佩范燕茹金鑫杨银凤内蒙古农业大学兽医学院呼和浩特010018 农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室呼和浩特010018

选用益生枯草芽孢杆菌研究其对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素表达的调节作用。首先,在体外成功培养绵羊瘤胃上皮细胞,然后用枯草芽孢杆菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞进行不同浓度、不同时间的刺激,利用荧光定量PCR技术(Real-ti... 详细信息

选用益生枯草芽孢杆菌研究其对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素表达的调节作用。首先,在体外成功培养绵羊瘤胃上皮细胞,然后用枯草芽孢杆菌对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞进行不同浓度、不同时间的刺激,利用荧光定量PCR技术(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-PCR)从mRNA水平检测刺激后上皮细胞中绵羊β-防御素-1(Sheep beta-defensin-1,SBD-1)基因表达水平的差异。结果表明:当菌液浓度为1010 cfu·mL-1刺激上皮细胞8h后,SBD-1的表达量达到最高;不同的菌液浓度诱导下SBD-1的表达量均有显著增加,109、1010、1011 cfu·mL-1菌液浓度刺激下,SBD-1的表达量与空白相比差异极显著(P<0.01)。结果表明,枯草芽孢杆菌能够诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1基因的表达。

关键词： β-防御素-1 瘤胃上皮细胞枯草芽孢杆菌荧光定量PCR

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2010年-2014年猪流行性腹泻病毒S基因遗传进化分析

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动物医学进展 2015年第8期36卷 28-34页

作者：刘艳成芦婷刘丹丹李静张文超邓侨张伟杜雅楠内蒙古农业大学兽医学院农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

自2010年以来,随着猪流行性腹泻病毒(PEDV)新毒株的出现,猪流行性腹泻(PED)开始在免疫猪群中流行,并迅速蔓延至国内多个省份,其发病率和病死率至今仍无法得到有效控制。为明确当前PEDV流行毒株的遗传变异情况,利用DNA Star、MEGA6等软件... 详细信息

自2010年以来,随着猪流行性腹泻病毒(PEDV)新毒株的出现,猪流行性腹泻(PED)开始在免疫猪群中流行,并迅速蔓延至国内多个省份,其发病率和病死率至今仍无法得到有效控制。为明确当前PEDV流行毒株的遗传变异情况,利用DNA Star、MEGA6等软件对2010年-2014年NCBI上已收录的319株PEDV S基因进行多序列比对,筛选出6个国家和地区的代表性毒株,并对各代表毒株、疫苗株、经典毒株的遗传进化关系、序列变化进行分析。遗传进化分析显示,进化树可分为G1、G2两大分支,其中多数流行毒株位于G1分支上,与较早的疫苗株及经典毒株遗传距离差异较大。除Chinju99和JS/HZ/2012两株经典毒株位于G1分支上外,其余所有的疫苗株和经典毒株均位于G2分支上。氨基酸序列比对结果显示,各流行毒株与经典毒株及疫苗株相比存在明显的变异位点,且主要集中于S1区的氨基端。结果表明,目前全球范围内广泛流行的PEDV毒株与经典毒株及疫苗株相比,其基因序列呈现出快速变异和进化的趋势,尽快从当前流行毒株中筛选出新的疫苗候选株将成为防控该病继续蔓延的关键措施之一。

关键词：猪流行性腹泻病毒 S基因遗传进化分析变异

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HPLC法测定兔血浆中吡喹酮的不同前处理方法比较

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畜牧与兽医 2015年第2期47卷 81-84页

作者：谭伟于晶峰杨晓野王瑞杨莲茹内蒙古农业大学兽医学院农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

为了筛选一种合理的吡喹酮(Praziquantel)高效液相色谱分析前处理方法,分别用甲醇、乙酸乙酯、乙醚3种有机溶剂,对相同浓度的吡喹酮血浆样品进行了萃取,并用高效液相色谱法测定其萃取回收率。结果显示:乙酸乙酯和乙醚对吡喹酮的萃取回... 详细信息

为了筛选一种合理的吡喹酮(Praziquantel)高效液相色谱分析前处理方法,分别用甲醇、乙酸乙酯、乙醚3种有机溶剂,对相同浓度的吡喹酮血浆样品进行了萃取,并用高效液相色谱法测定其萃取回收率。结果显示:乙酸乙酯和乙醚对吡喹酮的萃取回收率分别在80%和70%左右,甲醇仅为30%左右。结果表明:乙醚和乙酸乙酯可以更好地用于血浆中吡喹酮的萃取。

关键词：高效液相色谱萃取回收率吡喹酮兔血浆

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双峰驼CYP基因家族的比较研究

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畜牧兽医学报 2015年第7期46卷 1150-1156页

作者：哈斯苏荣李擎玉斯日古楞吉日木图内蒙古农业大学兽医学院农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室呼和浩特010018 内蒙古农业大学食品工程学院呼和浩特010018

为探讨双峰驼(Camelus bactrianus)物质代谢途径的特殊性和独特的解毒能力是否与其CYP基因家族的特殊性有关,本试验在对双峰驼全基因组测序数据进行系统分析的基础上,采用基因注释及比较基因组学研究方法,对双峰驼CYP基因家族进行了分... 详细信息

为探讨双峰驼(Camelus bactrianus)物质代谢途径的特殊性和独特的解毒能力是否与其CYP基因家族的特殊性有关,本试验在对双峰驼全基因组测序数据进行系统分析的基础上,采用基因注释及比较基因组学研究方法,对双峰驼CYP基因家族进行了分析。结果显示,在双峰驼基因组中首次发现63个CYP基因拷贝,分别属于17个CYP家族和38个亚家族;其中,有9个为多基因家族,且CYP2、CYP3和CYP4分别有27、6和7个成员,分别占双峰驼全部CYP基因的43%、10%和11%。与牛、马、鸡和人的CYP基因相比,双峰驼CYP基因亚家族的分布明显不同,在拷贝数上拥有较多的CYP2J和CYP3A。因此,双峰驼特有的某些生物学特性和代谢途径与其高拷贝数的CYP2J和CYP3A基因有一定关系,分析结果为进一步揭示双峰驼耐高盐和独特的解毒能力奠定了基础。

关键词：双峰驼 CYP基因家族物质代谢

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绵羊气管上皮细胞的分离培养及绵羊肺炎支原体对其的吸附

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中国兽医学报 2015年第8期35卷 1239-1243页

作者：黄海碧郑佳琪王晓晖陈德浩张超刘利郝永清内蒙古农业大学兽医学院农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

为建立简便、高效、稳定的绵羊气管上皮细胞的体外培养及鉴定的方法,并在所培养的细胞上研究绵羊肺炎支原体侵染模型,本研究利用链蛋白酶冷消化法对绵羊气管上皮细胞进行体外分离,通过差速贴壁法纯化气管上皮细胞并进行传代后用液氮保存... 详细信息

为建立简便、高效、稳定的绵羊气管上皮细胞的体外培养及鉴定的方法,并在所培养的细胞上研究绵羊肺炎支原体侵染模型,本研究利用链蛋白酶冷消化法对绵羊气管上皮细胞进行体外分离,通过差速贴壁法纯化气管上皮细胞并进行传代后用液氮保存,细胞复苏后通过测定生长曲线、上皮细胞骨架蛋白角蛋白8和18以及对染色体与微生物的检测等对所培养细胞进行鉴定,并将鉴定纯化的气管上皮细胞用绵羊肺炎支原体进行侵染。结果显示,成功培养出绵羊气管上皮细胞,纯化的细胞在显微镜下排列紧密,形态均一,呈鹅卵石铺路样。细胞生长曲线呈"S"型,分子生物学手段和增菌试验未检测到气管上皮细胞中含有微生物污染,通过细胞免疫组化检测到了细胞角蛋白8、18,染色体核型数目为2n=54。绵羊肺炎支原体能黏附于分离纯化的绵羊支气管上皮细胞,为进一步研究支原体侵染细胞的机制等奠定了基础。

关键词：绵羊气管上皮细胞绵羊肺炎支原体

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西方角蝇和截脉角蝇18S rDNA的克隆及其分子系统学研究

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中国兽医杂志 2015年第12期51卷 36-38页

作者：史红蕾邓侨杨莲茹杨晓野王瑞郑文青杨波内蒙古农业大学兽医学院农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

为了弄清双翅目昆虫西方角蝇(***)和截脉角蝇(***)18S rDNA基因序列及其分子进化。本研究测定了两种角蝇的18S rDNA基因序列,将其在NCBI中Blast,并将序列与GenBank中已知9种双翅目昆虫的18S rDNA基因序列进行比较分析,找出它们的同源区... 详细信息

为了弄清双翅目昆虫西方角蝇(***)和截脉角蝇(***)18S rDNA基因序列及其分子进化。本研究测定了两种角蝇的18S rDNA基因序列,将其在NCBI中Blast,并将序列与GenBank中已知9种双翅目昆虫的18S rDNA基因序列进行比较分析,找出它们的同源区和多变区,利用全序列和最保守同源区分别构建系统发育树。结果表明,西方角蝇和截脉角蝇18S rDNA基因序列长度均为1 984 bp,二者同源性为96.4%,存在73个识别位点。两种角蝇与GenBank中已登陆西方角蝇的同源性分别为99.1%和95.7%。11种双翅目昆虫18S rDNA基因序列中均有三段保守程度较高的同源区,分别相当于西方角蝇18S rDNA基因序列中320 bp^693 bp,848 bp^1 181 bp和1 606 bp^1 849 bp,其中第一段同源区最为保守。本文在国内外首次报道截脉角蝇18S rDNA基因序列,并证明了西方角蝇18S rDNA基因序列高度保守。利用18S rDNA基因序列中最保守同源区构建的系统发育树,对11种双翅目昆虫分类更符合传统形态学分类结果。

关键词：西方角蝇截脉角蝇 18S rDNA 序列分析

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布鲁菌S2疫苗株的核酸探针检测方法的建立

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动物医学进展 2015年第8期36卷 51-54页

作者：张岩李建宫利娜高航飞李旭东安维雪申之义内蒙古农业大学兽医学院农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室内蒙古呼和浩特010018

为了鉴别布鲁菌疫苗免疫和自然感染,建立鉴别布鲁菌S2疫苗株与其他菌株的斑点杂交法。针对布鲁菌基因序列保守区S2疫苗株与其他菌株的差异设计探针,同时根据差异部分设计引物进行PCR扩增;PCR产物经过回收、纯化、变性后固定在NC膜上,与... 详细信息

为了鉴别布鲁菌疫苗免疫和自然感染,建立鉴别布鲁菌S2疫苗株与其他菌株的斑点杂交法。针对布鲁菌基因序列保守区S2疫苗株与其他菌株的差异设计探针,同时根据差异部分设计引物进行PCR扩增;PCR产物经过回收、纯化、变性后固定在NC膜上,与探针杂交、显色。结果显示,PCR引物能够对S2疫苗株扩增出约330bp的核酸片段,对其他布鲁菌扩增出约360bp的核酸片段;探针只能和S2疫苗株的PCR产物杂交,最低检测到10pg DNA,能够在10h内鉴别出布鲁菌S2疫苗株。

关键词：布鲁菌检测技术斑点杂交

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