检索结果-内蒙古大学图书馆

免疫学杂志 2024年第1期40卷 96-103页

作者：谭凌云王慧杨晓岚汪芳洲李燕罗德炎谷宏婧安徽医科大学基础医学院合肥230032 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全全国重点实验室北京100071

目的本研究旨在制备自组装纳米颗粒猴痘候选疫苗并研究其免疫应答特征,为其疫苗设计提供可参考的试验数据。方法利用原核系统表达纯化抗原蛋白A29L-SpyTag和骨架蛋白Mi3-SpyCatcher,化学组装制备纳米颗粒A29L-Mi3,皮下免疫小鼠,通过EL... 详细信息

目的本研究旨在制备自组装纳米颗粒猴痘候选疫苗并研究其免疫应答特征,为其疫苗设计提供可参考的试验数据。方法利用原核系统表达纯化抗原蛋白A29L-SpyTag和骨架蛋白Mi3-SpyCatcher,化学组装制备纳米颗粒A29L-Mi3,皮下免疫小鼠,通过ELISA测定抗体效价、空斑试验测定抗体中和、流式细胞术测定淋巴细胞分泌细胞因子情况,并描述其免疫应答特征。结果成功制备A29L-Mi3纳米颗粒,颗粒呈中空笼状均匀分布,其粒径平均为(29±0.19) nm。A29L-Mi3纳米颗粒候选疫苗联合SP01佐剂后,中和抗体效价强于A29L蛋白候选疫苗,且A29L-Mi3纳米颗粒候选疫苗免疫2次即能够获得免疫3次相近滴度的中和抗体。A29L-Mi3纳米颗粒候选疫苗激活的小鼠T淋巴细胞免疫应答水平高于A29L蛋白候选疫苗。结论成功体外组装制备出结构均一的A29L-Mi3蛋白纳米颗粒,具有较强的免疫原性,联合SP01佐剂后中和能力提高,为免疫程序的优化提供参考数据。细胞免疫应答水平均高于单独的A29L蛋白,为猴痘疫苗的设计与研发提供借鉴。

关键词：猴痘抗原A29L 自组装纳米颗粒疫苗体液免疫细胞免疫

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B型肉毒毒素轻链荧光表达细胞模型的构建及应用

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军事医学 2023年第12期47卷 907-912页

作者：谭玲朱晨思王保刚李涛王慧军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的构建B型肉毒毒素轻链(BoNT/B,BLC)荧光表达细胞模型,并用于小分子化合物效应评价。方法将BLC基因导入荧光表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒,并将其转染至神经细胞系Neuro-2a细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察细胞内BLC-EGFP蛋白... 详细信息

目的构建B型肉毒毒素轻链(BoNT/B,BLC)荧光表达细胞模型,并用于小分子化合物效应评价。方法将BLC基因导入荧光表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒,并将其转染至神经细胞系Neuro-2a细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察细胞内BLC-EGFP蛋白荧光表达水平,利用Western印迹法检测细胞中BLC-EGFP的酶切活性和稳定性,进一步利用该模型评价SRC激酶抑制剂KX2-391对BLC-EGFP蛋白胞内稳定性的影响。结果成功构建重组表达质粒pEGFP-N1-BLC。质粒转染后,BCL-EGFP蛋白在Neuro-2a细胞中的表达水平随时间逐渐增加并具有酶切胞内底物囊泡相关蛋白-2(VAMP-2)的活性;质粒转染12 h后加入CHX终止蛋白合成,BLC-EGFP的胞内水平在72 h内无显著变化;加入KX2-391作用24 h后,可显著促进BLC-EGFP蛋白的胞内降解。结论成功建立B型肉毒毒素轻链荧光表达细胞模型,为后续B型肉毒毒素轻链胞内持留机制研究和胞内解毒剂筛选提供了技术储备。

关键词： B型肉毒毒素轻链基因重组重组荧光质粒 Neuro-2a细胞

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肠致病性大肠杆菌效应因子E2348C-1040泛素连接酶活性及泛素链连接方式的鉴定

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军事医学 2023年第3期47卷 182-187页

作者：黄炎玉李崭陈芳红李涛王慧军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的鉴定肠致病性大肠杆菌(EPEC)效应因子E2348C-1040泛素连接酶活性,检测其催化形成的泛素链的连接方式。方法构建原核表达质粒,转化感受态细胞,表达纯化E2348C-1040蛋白质。通过体外泛素化实验鉴定其泛素连接酶活性,利用泛素赖氨酸位... 详细信息

目的鉴定肠致病性大肠杆菌(EPEC)效应因子E2348C-1040泛素连接酶活性,检测其催化形成的泛素链的连接方式。方法构建原核表达质粒,转化感受态细胞,表达纯化E2348C-1040蛋白质。通过体外泛素化实验鉴定其泛素连接酶活性,利用泛素赖氨酸位点突变蛋白结合Western印迹实验检测该分子催化形成的泛素链的连接位点。结果成功构建原核表达质粒,获得纯度大于85%、浓度约为0.5 mg/ml的E2348C-1040蛋白质。分子水平的酶活实验结果表明E2348C-1040分子具有泛素连接酶活性,能催化形成不依赖于赖氨酸的泛素链。通过构建真核表达质粒转染HEK-293T细胞,发现E2348C-1040分子可在宿主细胞中催化形成甲硫氨酸(methionine 1,M1)连接的线性泛素链。结论EPEC效应因子E2348C-1040具有泛素连接酶活性,能催化泛素形成M1连接的线性泛素链。这一发现将为揭示效应因子E2348C-1040在宿主细胞内的作用机制提供研究线索。

关键词：肠致病性大肠杆菌效应因子泛素化泛素连接酶

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高毒力肺炎克雷伯菌两种金黄地鼠呼吸道感染模型比较研究

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军事医学 2024年第1期48卷 30-35页

作者：张之珺张丽丽吕蒙周冬生杨文慧高波军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 军事科学院军事医学研究院军事认知与脑科学研究所北京100850

目的建立高毒力肺炎克雷伯菌经气溶胶肺递送和滴鼻感染金黄地鼠动物模型,并对比两种模型的构建效果。方法选取4~5周龄雄性金黄地鼠,经气溶胶肺递送和滴鼻两种途径攻毒高毒力肺炎克雷伯菌NTUHK2044,记录金黄地鼠攻毒后14 d的生存状况,计... 详细信息

目的建立高毒力肺炎克雷伯菌经气溶胶肺递送和滴鼻感染金黄地鼠动物模型,并对比两种模型的构建效果。方法选取4~5周龄雄性金黄地鼠,经气溶胶肺递送和滴鼻两种途径攻毒高毒力肺炎克雷伯菌NTUHK2044,记录金黄地鼠攻毒后14 d的生存状况,计算两种途径的半数致死量、存活率,并对呼吸道沉积分布、肺部细菌载量及组织病理进行检测。结果气溶胶肺递送途径攻毒引起金黄地鼠半数死亡剂量(3×10^(4)CFU)低于滴鼻途径(7×10^(5)CFU)。4×10^(6)CFU高毒力肺炎克雷伯菌以气溶胶肺递送途径感染金黄地鼠后,96.46%沉积在肺部并成功定植,主要引起大叶性肺炎,4 d内动物全部死亡;而同等剂量菌液滴鼻后95.62%沉积在口鼻部,随后下移至气管定植,主要引起支气管肺炎,病变程度相对较轻,细菌更易被机体清除,14 d存活率为70%。结论细菌呼吸道感染造模效果受攻毒途径影响,高毒力肺炎克雷伯菌经气溶胶肺递送攻毒主要引起病变严重的大叶性肺炎,滴鼻则主要引起病变较轻的支气管肺炎。上述两种动物模型的成功建立可为肺炎克雷伯菌致病机制研究和药效评价提供关键支撑。

关键词：高毒力肺炎克雷伯菌气溶胶金黄地鼠动物模型

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痘苗病毒蛋白D8纳米抗体的原核表达及结合活性分析

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中国兽医学报 2024年第8期44卷 1728-1734页

作者：田婧婧杨晓岚李涛王慧范瑞文山西农业大学动物医学学院山西太谷030801 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

利用SUMO标签制备痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)蛋白D8的纳米抗体,并分析其与抗原是否具有结合活性。设计并合成序列,构建原核表达质粒pKMD-SUMO-D8,将其转化大肠杆菌(Escherichia coli,***)BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达;纯化带有Hi... 详细信息

利用SUMO标签制备痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)蛋白D8的纳米抗体,并分析其与抗原是否具有结合活性。设计并合成序列,构建原核表达质粒pKMD-SUMO-D8,将其转化大肠杆菌(Escherichia coli,***)BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达;纯化带有His标签和SUMO标签的抗体Anti-SUMO-D8,之后利用SUMO蛋白酶切除His标签和SUMO标签,进一步获得Anti-D8;最后,应用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)及间接免疫荧光试验(IFA)对其结合活性进行检测并分析。结果显示,成功构建了原核表达质粒pKMD-SUMO-D8和重组菌株,在30℃条件下,终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导表达菌株4 h时,Anti-SUMO-D8表达量最佳;获得了高纯度的Anti-SUMO-D8和Anti-D8纳米抗体;间接ELISA结果显示,Anti-SUMO-D8和Anti-D8与抗原均具有结合活性;在相同条件下,Anti-D8与VACV及E8L的结合活性高于Anti-SUMO-D8。间接IFA结果显示,VACV侵染48 h后,试验组部分细胞核在荧光显微镜下可见绿色荧光。利用SUMO标签可高效制备VACV蛋白D8的纳米抗体,且制备的纳米抗体具有一定的结合活性。本研究结果为纳米抗体的制备提供了新思路,也为深入研究VACV蛋白D8纳米抗体的生物学功能奠定了基础。

关键词：痘苗病毒纳米抗体 SUMO 结合活性

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基于同源重组原理快速验证fim家族基因簇对鲍曼不动杆菌蹭动的影响

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安徽医科大学学报 2024年第1期59卷 8-14页

作者：孙千姿宁年智王慧安徽医科大学基础医学院合肥230032 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的旨在利用含有抗生素耐药盒的线性PCR片段对鲍曼不动杆菌靶基因片段进行同源重组替换,实现基因的快速敲除及功能验证。方法以鲍曼不动杆菌Ab4294菌株为研究对象,PCR分别扩增fim基因簇(全长4980 bp)上游901 bp、下游1028 bp的序列作... 详细信息

目的旨在利用含有抗生素耐药盒的线性PCR片段对鲍曼不动杆菌靶基因片段进行同源重组替换,实现基因的快速敲除及功能验证。方法以鲍曼不动杆菌Ab4294菌株为研究对象,PCR分别扩增fim基因簇(全长4980 bp)上游901 bp、下游1028 bp的序列作为重组的同源臂;从pUC57质粒中扩增获得卡那霉素抗生素耐药盒(KanR);利用重叠延伸PCR技术将上述3个片段连接,并将连接片段转化至鲍曼不动杆菌Ab4294中,筛选获得基因缺失突变株,构建质粒回补株,对所得菌株进行表型鉴定,探究fim基因簇的功能。结果利用含有抗生素耐药盒的线性PCR片段同源替换的方法成功构建了fim基因簇缺失的鲍曼不动杆菌Ab4294突变菌株;缺失菌株与野生株相比生长速率无明显差异,蹭动运动能力明显下降,回补该基因簇后表型恢复。结论利用含有抗性耐药盒的线性PCR片段同源替换的方法成功敲除鲍曼不动杆菌Ab4294的fim家族基因簇,该基因簇编码产物参与鲍曼不动杆菌的蹭动运动。

关键词：鲍曼不动杆菌基因敲除 fim基因簇蹭动运动

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宿主ARF4和ARF5基因敲除小鼠的构建及其在寨卡病毒感染中的作用

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生物工程学报 2024年第12期40卷 4605-4615页

作者：邓考李明圆张惠莹邓永强秦源秦成峰福建农林大学生命科学学院福建福州350002 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所、病原微生物生物安全全国重点实验室北京100071 香港中文大学化学病理系、李嘉诚健康科学研究所中国香港999077

本研究旨在构建宿主ADP-核糖基化因子4(ADP-ribosylation factor 4,ARF4)和ADP-核糖基化因子5(ADP-ribosylation factor 5,ARF5)基因敲除小鼠,明确ARF4和ARF5基因对寨卡病毒感染的作用。首先利用CRISPR-Cas9技术,获得ARF4和ARF5单基因敲除小鼠(ARF4KO和ARF5KO),并通过杂交繁育获得双基因敲除小鼠(ARF4KO/ARF5KO),通过PCR法鉴定小鼠基因型,定量RT-PCR法检测目标基因的敲除效果。之后,用寨卡病毒感染基因敲除小鼠,采集第2、4、6天小鼠血液和各组织样本,提取核酸后用RT-q PCR法检测病毒载量,用HE染色观察组织病理变化。结果显示,用ARF4和ARF5特异引物,分别在ARF4KO^(–/+)、ARF5KO^(–/–)以及ARF4KO^(–/+)/ARF5KO^(–/–)小鼠扩增到与目标基因大小一致的条带。RT-qPCR检测结果显示,ARF4KO^(–/+)小鼠各组织中ARF4mRNA水平显著降低,其敲除效率在37.8%-50.0%之间,ARF5表达水平无变化。ARF5KO^(–/–)小鼠组织中ARF5 mRNA完全敲除,ARF4无变化。ARF4KO^(–/+)/ARF5KO^(–/–)小鼠在肺、肾和睾丸中ARF4mRNA水平显著降低,ARF5完全敲除。最后,用寨卡病毒分别感染基因敲除小鼠和野生型小鼠。结果显示,与野生型小鼠相比,ARF4KO^(–/+)小鼠在各时间点血清中病毒载量均显著下降,但ARF5KO^(–/–)小鼠与ARF4KO^(–/+)/ARF5KO^(–/–)小鼠无明显变化。同时,与野生型小鼠相比,ARF4KO^(–/+)小鼠各组织病毒载量没有显著降低,但其大脑和睾丸的病理性改变减轻。本研究利用CRISPR-Cas9技术成功构建了ARF4和ARF5基因敲除小鼠,并证实ARF4是寨卡病毒感染必需的宿主蛋白,为后续深入研究ARF4和ARF5在寨卡病毒感染致病中的作用机制以及抗病毒药物研发奠定了基础。

关键词： CRISPR-Cas9技术基因敲除小鼠 ADP-核糖基化因子4 ADP-核糖基化因子5

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猴痘病毒蛋白的原核表达及免疫效果评价

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病毒学报 2024年第4期40卷 772-778页

作者：王雪琛李涛杨晓岚孙娅坤王慧王凤雪内蒙古农业大学兽医学院农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室呼和浩特010018 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全全国重点实验室北京100071

猴痘是由猴痘病毒引起的一种人兽共患疾病。研发特异性预防和治疗猴痘的疫苗或药物成为目前全球研究重点之一。本研究以猴痘主要抗原蛋白其中的A29L、E8L、M1R为研究基础,加入His标签构建质粒、原核表达、纯化,并对表达蛋白进行SDS⁃PAGE... 详细信息

猴痘是由猴痘病毒引起的一种人兽共患疾病。研发特异性预防和治疗猴痘的疫苗或药物成为目前全球研究重点之一。本研究以猴痘主要抗原蛋白其中的A29L、E8L、M1R为研究基础,加入His标签构建质粒、原核表达、纯化,并对表达蛋白进行SDS⁃PAGE及Western blot鉴定其特异性。后续将3种抗原蛋白与CpG⁃ODN 1826单佐剂、铝单佐剂或CpG与铝复合佐剂三次免疫小鼠,通过酶联免疫吸附实验及病毒蚀斑减少中和实验测定三价疫苗的结合抗体和中和抗体能力。结果表明,重组蛋白A29L、E8L、M1R诱导后均可溶性表达且表达量及纯度良好。三价疫苗以CpG⁃ODN 1826佐剂联合铝佐剂施行肌肉注射一组表现出较好的结合抗体和中和抗体能力。本研究为研发特异性针对猴痘的疫苗或药物提供基础。

关键词：猴痘猴痘病毒原核表达蛋白纯化佐剂

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HIV-1整合位点分布机制及检测的研究进展

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中华医院感染学杂志 2024年第11期34卷 1755-1760页

作者：孙孜璇韩婧婉李敬云李韩平王晓林温红玲李林山东大学齐鲁医学院公共卫生学院微生物检验学系新发突发传染病防控与生物安全重点实验室山东济南250012 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物与生物安全国家重点实验室北京100071

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)引起的慢性传染性疾病,对人类的生命健康构成了严重威胁.整合是HIV-1病毒复制生命周期的关键环节,不同于新冠病毒等非整合型病毒,HIV-1自身基因编码的逆转录酶和整合酶,可帮助病毒整合入宿主细胞... 详细信息

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)引起的慢性传染性疾病,对人类的生命健康构成了严重威胁.整合是HIV-1病毒复制生命周期的关键环节,不同于新冠病毒等非整合型病毒,HIV-1自身基因编码的逆转录酶和整合酶,可帮助病毒整合入宿主细胞基因组,同步复制,确保病毒的遗传信息长期存在于宿主细胞中.然而HIV-1整合位点的选择不是随机的,而是与染色体结构和宿主基因功能等紧密相关.本文综述了有关HIV-1整合位点的检测方法、分布特征及影响其选择的因素等方面的研究进展,旨在为艾滋病的精准防控、治疗,乃至最终治愈提供信息参考.

关键词：人类免疫缺陷病毒1型整合位点分布特征影响因素

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弗氏枸橼酸杆菌中发现介导bla_(KPC-2)传播的新型质粒及比较基因组学分析

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中华预防医学杂志 2023年第12期57卷 2122-2128页

作者：郭会钱李昕悦陈素明张旺鲍春梅殷喆李伯安潍坊医学院医学检验学院潍坊261053 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 解放军总医院第五医学中心检验科北京100039

目的探讨来自弗氏枸橼酸杆菌的产碳青霉烯酶的新型不相容群组质粒pNY2385-KPC的耐药机制及基因结构特征。方法从宁波市医疗中心李惠利医院急诊病房的发热患者尿液样本中获得1株多药耐药菌。采用16S rRNA基因扩增和平均核苷酸一致性(ANI... 详细信息

目的探讨来自弗氏枸橼酸杆菌的产碳青霉烯酶的新型不相容群组质粒pNY2385-KPC的耐药机制及基因结构特征。方法从宁波市医疗中心李惠利医院急诊病房的发热患者尿液样本中获得1株多药耐药菌。采用16S rRNA基因扩增和平均核苷酸一致性(ANI)进行菌种鉴定;采用全自动细菌鉴定及药敏分析系统检测细菌MIC值;通过“三代”测序方法获得基因组序列,然后通过BLASTP/BLASTN、RefSeq、ConservedDomains、ResFinder、Isfinder等对基因功能进行详细注释及比较基因组学分析。结果弗氏枸橼酸杆菌NY2385携带的质粒pNY2385-KPC为一种新型不相容群组质粒,包含bla_(KPC-2),具有接合转移(Ⅳ型分泌系统)基因,可发生接合转移。NCBI中共检索到同型质粒15个,来源于弗氏枸橼酸杆菌、黏质沙雷菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌和植生拉乌尔菌等细菌,为泛宿主质粒。通过对来自弗氏枸橼酸杆菌中6个该新型质粒进行序列比较分析,发现该新型质粒结构具有一定的保守性,具有携带bla_(KPC-2)的Tn6296变体结构,而且质粒pCF1807-3同时具有repApNY2385-KPC和repAIncX8。结论弗氏枸橼酸杆菌中的pNY2385-KPC型质粒均携带bla_(KPC-2)耐药基因,分为repApNY2385-KPC单复制子和repApNY2385-KPC/repAIncX8双复制子两种亚型,属于泛宿主质粒,作为可移动遗传元件促进了bla_(KPC-2)的传播。

关键词：弗氏枸橼酸杆菌多药耐药新型质粒肠杆菌科

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