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分析化学 2022年第7期50卷 1048-1057页

作者：武海江张雅姣刘勤陈佳徐斌徐华谢剑炜军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室

DNA加合物的分析鉴定是研究DNA损伤的重要技术手段。采用不同的DNA水解方法可获得不同的碱基、核苷和核酸片段等产物，这些方法各具优势，可用于不同的分析目的。本研究以经典的烷基化试剂芥子气为模型化合物，进行溶液孵育与动物染毒... 详细信息

DNA加合物的分析鉴定是研究DNA损伤的重要技术手段。采用不同的DNA水解方法可获得不同的碱基、核苷和核酸片段等产物，这些方法各具优势，可用于不同的分析目的。本研究以经典的烷基化试剂芥子气为模型化合物，进行溶液孵育与动物染毒实验。采用3种常用的水解方式(加热水解、酸水解和酶解)处理目标分析物，利用质谱技术对产物进行筛查与定量分析，系统地比较了这3种常用的水解方法对不同分析样本和具有不同加合形式的加合物的水解效率的影响。结果表明，不同修饰位点的DNA加合物的稳定性存在差异，鸟嘌呤与腺嘌呤的N位点加合物的结构较稳定，鸟嘌呤的O6位点加合物则对酸和热不稳定。在3种水解方式中，加热水解法的水解效率较低；酸水解法高效稳定，其产率较加热水解法提高了10.4%～94.9%,产物中碱基形式占比>99%,适用于已知结构的DNA加合物的高通量、高灵敏质谱分析；酶解法可产生碱基与核苷等多种产物，产物信息丰富，适用于新结构以及未知结构加合物的筛查与鉴定，但因其酶解效率受DNA加合位点、基质效应与酶解条件等因素限制，定量分析加合物时其准确性受到影响。

关键词： DNA水解 DNA加合物液相色谱-质谱联用技术

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基于γ-H2AX检测的两种基因毒性体外测试方法的比较研究

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分析化学 2021年第12期49卷 2039-2047页

作者：瞿敏敏陈佳张雅姣徐斌徐华谢剑炜军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室

以7种基因毒性化合物(GCs)及7种非DNA损伤作用化合物(Non-DCs)为模型,分别采用质谱技术与高内涵技术在两种人源细胞株即肝癌细胞HepG2和宫颈癌细胞HeLa中检测磷酸化组蛋白γ-H2AX,对化合物孵育细胞后的基因毒性进行分析检测,进而对基于... 详细信息

以7种基因毒性化合物(GCs)及7种非DNA损伤作用化合物(Non-DCs)为模型,分别采用质谱技术与高内涵技术在两种人源细胞株即肝癌细胞HepG2和宫颈癌细胞HeLa中检测磷酸化组蛋白γ-H2AX,对化合物孵育细胞后的基因毒性进行分析检测,进而对基于γ-H2AX检测的两种基因毒性体外测试方法进行比较。结果表明,两种技术均具有高通量检测的优点,均可在2天内完成实验流程。对于本研究所考察的5个GCs,两种技术测定的细胞γ-H2AX水平显著变化的最低起效浓度(MEC)值相同;针对其余2个GCs,质谱测定的MEC值比高内涵技术低。其中,质谱技术在浓度低至10μmol/L苯丁酸氮芥及0.1μmol/L丝裂霉素C时,即可检测到γ-H2AX水平发生显著变化;而高内涵技术需在100μmol/L苯丁酸氮芥及1μmol/L丝裂霉素C浓度下才能检测到γ-H2AX水平发生显著变化,表明质谱技术具有更高的灵敏度。本研究还表明,质谱技术可特异性检测GCs所诱导的γ-H2AX水平变化;而高内涵技术无法区分检测GCs与Non-DCs导致的γ-H2AX焦点,即高内涵技术对于Non-DCs易呈现假阳性结果。本研究通过比较基于γ-H2AX检测的两种基因毒性体外测试方法发现,基于质谱技术的γ-H2AX检测方法不仅能更灵敏、特异性检测化合物基因毒性,而且可动态监测GCs诱导的DNA损伤修复过程,在化合物的基因毒性测试中显示了可行性及优越性。

关键词：质谱高内涵技术基因毒性组蛋白H2AX 磷酸化组蛋白H2AX

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大鼠灌胃黄独素B单体和黄药子醇提物后黄独素B的药动学和组织分布比较

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中国药理学与毒理学杂志 2018年第1期32卷 72-78页

作者：许玉凤阳海鹰原梅李桦军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物和毒理学国家重点实验室北京100850

目的研究黄独素B(DIOB)在大鼠体内的血浆药动学和组织分布特征,并比较DIOB单体和黄药子醇提物(EEDB)给药后DIOB血浆和组织暴露以及消除的差异。方法建立并验证了定量分析血浆和组织样品DIOB的液相-串联质谱法(LC-MS/MS)。SD大鼠ig给予DI... 详细信息

目的研究黄独素B(DIOB)在大鼠体内的血浆药动学和组织分布特征,并比较DIOB单体和黄药子醇提物(EEDB)给药后DIOB血浆和组织暴露以及消除的差异。方法建立并验证了定量分析血浆和组织样品DIOB的液相-串联质谱法(LC-MS/MS)。SD大鼠ig给予DIOB 1.3 mg·kg^(-1)和EEDB 1.0 g·kg^(-1),不同时间点采样,测定血浆和组织样品中的DIOB浓度。快速平衡透析法测定DIOB在血浆和组织的蛋白结合率。采用Win Nonlin 6.4软件拟合并获得药动学参数。结果大鼠给予DIOB单体和EEDB后,血浆DIOB的峰浓度(c_(max))和达峰时间(t_(max))分别为312±67和(131±84)μg·L^(-1)(P<0.01)以及0.12±0.07和(0.23±0.17)h;消除半衰期(t1/2)分别为1.17±0.28和(2.34±0.83)h(P<0.05)。组织分布研究结果表明,DIOB在肺的分布浓度最高,其次是肝和肾。DIOB单体组DIOB在肺、肝和肾组织的AUC(0-24 h)分别为4527.0±557.7,183.0±51.1和(64.4±22.4)ng·h·g^(-1),EEDB组分别为6507.9±424.3(P<0.01),467.5±202.7(P<0.05)和(238.6±70.0)ng·h·g^(-1)(P<0.01)。DIOB的血浆、肝和肺组织的蛋白结合率为38.7%~43.6%,61.3%~66.9%和61.4%~64.7%。DIOB肺/血浆游离浓度AUC比值>48。结论 DIOB以单体和EEDB 2种形式给药后,大鼠血浆动力学和组织分布存在一定的差异。DIOB在肺组织的分布具有较强的靶向性。在黄药子和DIOB的药效学和毒理学研究中应关注上述特征和差异。

关键词：黄独素B 黄药子药动学组织分布蛋白结合

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基于磷酸化组蛋白H2AX质谱定量分析的药品基因毒性杂质的毒效应导向高通量筛查方法研究

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分析化学 2021年第9期49卷 1531-1539页

作者：瞿敏敏陈佳徐斌张雅姣徐华谢剑炜军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室

细胞中组蛋白H2AX磷酸化水平的变化能灵敏指示DNA断裂的毒性反应,基于此,本研究建立了药品中基因毒性杂质的同位素稀释高效液相色谱-串联质谱高通量筛查方法。H2AX及其磷酸化特异肽段的检出限分别为1和2 ng/mL,准确度和精密度均符合方... 详细信息

细胞中组蛋白H2AX磷酸化水平的变化能灵敏指示DNA断裂的毒性反应,基于此,本研究建立了药品中基因毒性杂质的同位素稀释高效液相色谱-串联质谱高通量筛查方法。H2AX及其磷酸化特异肽段的检出限分别为1和2 ng/mL,准确度和精密度均符合方法学要求。以两种重要的基因毒性杂质甲磺酸乙酯(EMS)及N-亚硝基二甲胺(NDMA)为代表,考察了两种具有不同药物代谢酶体系的受试细胞HepG2和HeLa,结果表明,EMS在两种受试细胞中均呈现基因毒性特点,而NDMA仅在具有相应药物代谢酶的HepG2细胞中呈现基因毒性。EMS与NDMA的检测灵敏度分别为0.06和0.03μg/g,满足国际限量检出标准要求(EMS:0.6μg/g, NDMA:0.3μg/g)。将本方法应用于5种市售药片中基因毒性杂质的筛查,药片用水溶解后即直接与细胞孵育,药物活性成分及赋形剂不干扰测定,结果表明,本方法具有简便、灵敏度高和准确度好的特点,可用于药品中基因毒性杂质的快速高通量筛查。

关键词：质谱磷酸化组蛋白H2AX 定量分析基因毒性杂质筛查

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蛋白修饰定量质谱法研究两种不同作用模式基因毒化合物对组蛋白H3乙酰化的影响

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分析化学 2022年第6期50卷 940-947页

作者：瞿敏敏陈佳徐斌李治郭磊徐华谢剑炜军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室

建立了细胞中组蛋白H3的9位（H3K9ac）或14位（H3K14ac）赖氨酸乙酰化及其相应原型特征多肽片段的高效液相色谱-三重四极杆质谱同时定量分析方法。样品经胰酶消化、丙酰化衍生、除盐及肽段富集等前处理后，在ACQUITY UPLCBEH C18色谱柱... 详细信息

建立了细胞中组蛋白H3的9位（H3K9ac）或14位（H3K14ac）赖氨酸乙酰化及其相应原型特征多肽片段的高效液相色谱-三重四极杆质谱同时定量分析方法。样品经胰酶消化、丙酰化衍生、除盐及肽段富集等前处理后，在ACQUITY UPLCBEH C18色谱柱上分离，采用质谱技术在正离子多反应监测模式（MRM）下检测。空白细胞样品中组蛋白H3的各特征肽段在1～250 ng/mL浓度范围内线性关系良好（R2> 0.99），检出限（LOD,S/N=3）均为0.1 ng/mL，准确度、精密度、基质效应及提取回收率均符合方法学要求。本方法具有操作简便、灵敏度高、检测速度快及定量分析准确等优势。将本方法应用于2种典型的不同作用模式的基因毒性化合物（喜树碱和秋水仙碱）对2种人源细胞株即肝癌细胞HepG2和宫颈癌细胞HeLa中组蛋白H3的9位或14位赖氨酸乙酰化修饰影响的研究，测得了组蛋白H3中H3K9ac及H3K14ac修饰含量的变化，探讨了其与不同基因毒性化合物作用模式的关系，为基因毒性化合物的DNA损伤/修复及转录研究提供了技术支持。

关键词：高效液相色谱质谱组蛋白H3 乙酰化基因毒性化合物

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雷公藤甲素在人和大鼠肝微粒体代谢消除和酶动力学的比较研究

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中国药理学通报 2018年第10期34卷 1414-1419页

作者：吴桐阳海鹰原梅车津晶李桦军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物和毒理学国家重点实验室北京100850

目的研究中药活性成分雷公藤甲素(triptolide,TP)在人和大鼠肝微粒体的代谢消除性质和酶促动力学特征,比较种属间差异,为深入研究代谢与肝毒性的关系提供科学依据。方法应用前期验证的LC-MS/MS方法,定量检测孵育体系中的雷公藤甲素,考... 详细信息

目的研究中药活性成分雷公藤甲素(triptolide,TP)在人和大鼠肝微粒体的代谢消除性质和酶促动力学特征,比较种属间差异,为深入研究代谢与肝毒性的关系提供科学依据。方法应用前期验证的LC-MS/MS方法,定量检测孵育体系中的雷公藤甲素,考察其在人和大鼠肝微粒体的代谢稳定性和酶促动力学;研究雷公藤甲素在人源重组CYP3A4、大鼠源重组CYP3A1和3A2同工酶孵育体系中的酶促动力学,计算并比较酶动力学参数。结果雷公藤甲素在人肝微粒体的代谢消除明显慢于大鼠,消除半衰期T^(1/2)分别为(154±9.4)、(19.9±0.09)min(P<0.01)。雷公藤甲素在人和大鼠肝微粒体的表观酶动力学参数K_m分别为(11.2±3.45)、(18.4±3.29)μmol·L^(-1),V_(max)分别为(139±12.6)、(2194±176.7)pmol·min^(-1)·mg^(-1);在CYP3A4、3A1、3A2的K_m分别为(15.5±1.80)、(5.89±0.96)、(9.55±3.13)μmol·L^(-1),V_(max)分别为(11.1±0.91)、(62.8±16.17)、(51.6±10.19)pmol·min^(-1)·pmol^(-1),差异具有显著性。结论雷公藤甲素的肝微粒体代谢消除和酶促动力学存在明显的种属差异,其与人和大鼠CYP3A亚型的亲和力和反应速率差异是代谢消除种属差异的原因之一。

关键词：雷公藤甲素肝微粒体细胞色素P4503A酶代谢消除酶动力学种属差异

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顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法快速筛查油性基质中化学武器公约相关化合物

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色谱 2023年第4期41卷 348-358页

作者：陈佳刘玉龙徐斌刘勤谢剑炜军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京100850

《化学武器公约》核查的化合物范围广泛,数量庞大,而核查样品通常来源复杂多样,且目标化合物含量很低,极易发生漏检和误检。鉴于核查结果的政治、军事敏感性,建立快速、有效的筛查方法对于准确鉴定复杂环境样品中公约相关化合物十分重... 详细信息

《化学武器公约》核查的化合物范围广泛,数量庞大,而核查样品通常来源复杂多样,且目标化合物含量很低,极易发生漏检和误检。鉴于核查结果的政治、军事敏感性,建立快速、有效的筛查方法对于准确鉴定复杂环境样品中公约相关化合物十分重要。针对油性基质样品前处理费时费力,低沸点化合物易漏检等问题,研究建立了顶空固相微萃取(HS-SPME)结合全扫描模式下气相色谱-质谱(GC-MS)检测,快速筛查油性基质中化学武器公约相关化合物的分析方法。为模拟筛查过程,选取24种性质各异的重要公约清单物为代表性化合物,并根据性质将所选化合物分为3组分别进行研究。对HS-SPME的工作条件进行了优化,包括萃取纤维涂层种类、萃取温度、萃取时间、解吸时间、衍生化方法等。对极性较低的挥发性和半挥发性公约相关化合物,采用二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)纤维提取,以分流模式(分流比10∶1)进样分析,检出限为0.5~100 ng/mL。对中等极性和较高极性化合物,衍生化后采用聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)纤维提取,以不分流模式进样分析,检出限为20~300 ng/mL。所建方法简单、快速、灵敏,特别是可避免样品浓缩导致的低沸点化合物的损失和漏检,可用于复杂油性基质中痕量化学武器公约相关化合物的快速筛查与鉴定,并已多次成功应用于国际禁止化学武器组织效能水平测试中。

关键词：顶空固相微萃取气相色谱-质谱联用化学武器公约相关化合物油性基质快速筛查

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芘基对在dsDNA中的构建:基于8-氮-7-去氮-2′-脱氧腺苷的7位取代及连接臂对荧光性质的影响

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高等学校化学学报 2018年第10期39卷 2206-2213页

作者：李阳李志文朱俊飞刘世会何军林贵州大学药学院贵州550025 军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京100850

通过7-芘乙炔基-8-氮-7-去氮-2'-脱氧腺苷(2)和7-芘乙基-8-氮-7-去氮-2'-脱氧腺苷(3) 2个脱氧腺苷类似物在双螺旋DNA(ds DNA)中构建芘基对,同时保持2'-脱氧腺苷的碱基配对专一性,探讨了芘基对的多种组合在ds DNA中的荧光光... 详细信息

通过7-芘乙炔基-8-氮-7-去氮-2'-脱氧腺苷(2)和7-芘乙基-8-氮-7-去氮-2'-脱氧腺苷(3) 2个脱氧腺苷类似物在双螺旋DNA(ds DNA)中构建芘基对,同时保持2'-脱氧腺苷的碱基配对专一性,探讨了芘基对的多种组合在ds DNA中的荧光光谱变化及其与ds DNA形成和解离的关系. DNA双螺旋的热稳定性和圆二色光谱表征结果反映了连接臂与芘基在ds DNA大沟区的相互作用.芘基荧光光谱表明,化合物2在ds DNA中的荧光光谱反映了双螺旋的变化,PY02+D02在形成双螺旋前后发生了荧光猝灭,而PY03+PY05在形成双螺旋前后呈现荧光,这2个芘基对组合在含双螺旋结构域的功能核酸和生物传感器中具有潜在应用价值.

关键词：芘基脱氧腺苷类似物双螺旋DNA 荧光光谱热稳定性

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阿尔茨海默病发病机制及防治药物研究思考

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中国药理学与毒理学杂志 2017年第12期31卷 1129-1141页

作者：程肖蕊周文霞张永祥军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京100850

阿尔茨海默病(AD)是一种典型的中枢神经退行性疾病,由于其发病机制尚不十分清楚,目前临床可用的治疗药物均只能短期改善症状,而不能阻止或延缓疾病的进展。迄今为止,基于主流发病机制学说的改善病情治疗(disease-modifying therapy)药... 详细信息

阿尔茨海默病(AD)是一种典型的中枢神经退行性疾病,由于其发病机制尚不十分清楚,目前临床可用的治疗药物均只能短期改善症状,而不能阻止或延缓疾病的进展。迄今为止,基于主流发病机制学说的改善病情治疗(disease-modifying therapy)药物的研发尚无一成功,迫使研究者们重新审视、思考并探寻新的研发思路和出路。本文在对AD防治药物的研发现状进行较系统梳理的基础上,对其发展方向和趋势、面临的主要挑战及可能取得的进展进行了分析、思考和展望。

关键词：阿尔茨海默病轻度认知损害联合治疗表观药物重定位

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芥子气三肽加合物合成新路线开发及在确证分析中的应用

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分析化学 2022年第1期50卷 136-146页

作者：杨展刘玉龙陈佳吴剑峰何跃忠谢剑炜军事科学院军事医学研究院军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室

芥子气(Sulfur mustard, SM)是一种典型的难防难治化学战剂，生物体SM暴露后，除自身发生氧化水解代谢反应外，还会与体内的蛋白质、谷胱甘肽及DNA等生成一系列的加合物。白蛋白在血浆中丰度较高，芥子气与其34位半胱氨酸(Cys-34)结合... 详细信息

芥子气(Sulfur mustard, SM)是一种典型的难防难治化学战剂，生物体SM暴露后，除自身发生氧化水解代谢反应外，还会与体内的蛋白质、谷胱甘肽及DNA等生成一系列的加合物。白蛋白在血浆中丰度较高，芥子气与其34位半胱氨酸(Cys-34)结合形成加合物，再经蛋白酶K水解后生成三肽加合物(HETE-Cys-Pro-Phe, HETE-CPF)。HETE-CPF半衰期长、稳定性好，是溯源SM暴露最有效，也是最重要的生物标志物。本研究以易获取的商品化试剂氯乙醇为起始原料，开发了一条新的HETE-CPF合成方法。相比于原有以2-氯乙基巯基乙醇为起始原料的合成方法，新方法副反应更少、纯化更简便。在此基础上建立了可用于全血样本中HETE-CPF的高灵敏分析检测方法，检测灵敏度可达2 ng/mL。同时，还鉴定出大鼠经尾静脉注射SM暴露后，其与血浆白蛋白形成的暴露标志物与人源血浆差异显著，为HETE-Cys-Pro-Tyr(HETE-CPY),并非HETE-CPF,两者白蛋白一级序列差异是导致标志物不同的根本原因。

关键词：芥子气固相肽合成白蛋白加合物高分辨质谱

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