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中国药理学与毒理学杂志 2016年第9期30卷 975-982页

作者：邓红吴纯启江涛王全军广东药科大学中药学院广东广州510006 军事医学科学院毒物药物研究所国家北京药物安全评价研究中心抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京100850 广东药科大学实验动物中心广东广州510006

微生物组是一新兴研究领域,其研究涉及人类健康、农业、生物能源和环境等领域。其中,肠道微生物组是近年研究的热点。已有研究表明,肠道菌群与消化道疾病(炎症性肠病)、代谢性疾病(2型糖尿病)、心脑血管疾病(帕金森征)等有关。中药常作... 详细信息

微生物组是一新兴研究领域,其研究涉及人类健康、农业、生物能源和环境等领域。其中,肠道微生物组是近年研究的热点。已有研究表明,肠道菌群与消化道疾病(炎症性肠病)、代谢性疾病(2型糖尿病)、心脑血管疾病(帕金森征)等有关。中药常作为补益药而长期大量服用,其口服进入胃肠道后,肠道菌群可影响中药药理和毒理作用。本文主要综述了微生物组的基本概况、常用的检测技术及其与何首乌所致肝毒性、黄芩直接作用于肠道、泽泻所致肾毒性及小柴胡汤所致肺炎等为代表的几种毒性作用间的关系。

关键词：微生物组肠道中药药理毒理

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高通量测序研究何首乌肝损伤大鼠肠道菌群多样性的改变

高通量测序研究何首乌肝损伤大鼠肠道菌群多样性的改变

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2017年中国毒理学会药物毒理与安全性评价学术大会

作者：邓红吴纯启杨威江涛王全军广东药科大学中药学院广州 510006 军事医学科学院毒物药物研究所国家北京药物安全评价研究中心抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京 100850 军事医学科学院毒物药物研究所国家北京药物安全评价研究中心抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京 100850 广东省生物资源应用研究所广东省动物保护与资源利用重点实验室广东省野生动物保护与利用公共实验室广州 510260 广东药科大学实验动物中心广州 510006

目的近年所见何首乌的不良反应中，肝损伤最为常见。从细胞、分子水平研究何首乌肝损伤的毒性机制是常用的方法，但是近年来的研究发现肠道菌群与肝脏疾病病程的发生、发展有很大的相关性。目前罕见关于何首乌肝损伤与肠道菌群的关系... 详细信息

目的近年所见何首乌的不良反应中，肝损伤最为常见。从细胞、分子水平研究何首乌肝损伤的毒性机制是常用的方法，但是近年来的研究发现肠道菌群与肝脏疾病病程的发生、发展有很大的相关性。目前罕见关于何首乌肝损伤与肠道菌群的关系的文献报道，本研究旨在本课题组前期建立的LPS诱导何首乌的大鼠肝损伤评价模型的基础上，采用Illuminate高通量测序技术研究何首乌肝损伤大鼠肠道菌群多样性的改变，探讨其可能的毒性作用机制，为何首乌在临床、保健等领域合理、科学应用提供理论参考和依据。

关键词：高通量测序何首乌肝损伤肠道菌群多样性

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2种方法分析何首乌的肝损伤与肠道菌群的关系

2种方法分析何首乌的肝损伤与肠道菌群的关系

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2017年中国毒理学会药物毒理与安全性评价学术大会

目的何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根,多用于临床用药、美容和营养保健产品等.近年来,何首乌肝损伤的报道屡见不鲜.肝脏是机体最大的代谢器官,肝脏和肠道在生理和解剖学上存在着紧密的联系.两者互相影响... 详细信息

目的何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根,多用于临床用药、美容和营养保健产品等.近年来,何首乌肝损伤的报道屡见不鲜.肝脏是机体最大的代谢器官,肝脏和肠道在生理和解剖学上存在着紧密的联系.两者互相影响,而肠道的改变又会影响肠道微生物.文献研究报道肠道菌群在多种肝脏疾病病程的发生、发展中起着重要作用,所以本研究以肠道菌群为出发点,采用Illumina高通量测序技术和实时荧光定量PCR(Real-Time PCR,RT-PCR)法全面研究何首乌的肝损伤与大鼠肠道微生物组间的关系.方法基于LPS诱导何首乌的大鼠肝损伤模型,对大鼠粪便中细菌16S rRNA基因的V4高变区进行Illumina高通量测序,根据测序结果得出的差异物种,后采用RT-PCR进行验证,观察何首乌的肝损伤与肠道微生物组间的关系及2种定量方法的一致性.结果大鼠肝脏病理学检查结果显示,与正常对照组(C组)比较,LPS组(L组)大鼠存在肉芽肿,PMT组(P组)肝组织病理检查无异常病变;与LPS组比较,LPS联合何首乌给药组(LP组)大鼠肝细胞出现轻度变性和微小肉芽肿增多,LPS联合对乙酰氨基酚(APAP)给药组(LA组)可见微小肉芽肿和淋巴细胞浸润.Illumina高通量测序结果提示,第14 h,与C组比较,给予LPS的组别(L组和LP组)大鼠肠杆菌科细菌数显著升高;随着何首乌给药次数的增加,单独给予何首乌的大鼠肠道微生物无显著变化;与C组比较,LP组表现为肠球菌科和毛螺旋菌科细菌逐渐增加,乳杆菌属细菌减少,且与L组比较差异有统计学意义;qRT-PCR结果显示,随着何首乌给药次数的增加,单独给予何首乌的大鼠肠道微生物无显著变化;与C组比较,LP组肠球菌科、毛螺旋菌科细菌数显著增加(P＜0.05),乳杆菌属细菌数显著减少(P＜0.05),且与L组比较差异有统计学意义.结论何首乌肝损伤大鼠存在不同程度的菌群失衡,且Illumina高通量测序和RT-PCR检测的结果具有良好的一致性,但Illumina高通量测序技术可获得更多的微生物信息,更具有优势.

关键词：何首乌肝损伤肠道菌群 Illumina高通量测序 qRT-PCR

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曲格列酮对HepG2及CD133^+肝癌干细胞的毒性差异研究

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药物评价研究 2017年第4期40卷 455-463页

作者：许赫雷吴纯启董延生邓红井潇韩刚杨威王全军王茜莎广东药科大学药学院广东广州510006 军事医学科学院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室国家北京药物安全评价研究中心北京100850 广东省生物资源应用研究所广东省动物保护与资源利用重点实验室广东省野生动物保护与利用公共实验室广东广州510260

目的分离与鉴定肝癌细胞HepG2中CD133标记的肝癌干细胞(LCSC),初步探讨曲格列酮(Tro)对HepG2及CD133^+ LCSC的细胞毒性差异。方法利用流式细胞仪分选纯化HepG2中的CD133^+ 和CD133-细胞,采用悬浮微球形成法、平板克隆形成法、Transwell... 详细信息

目的分离与鉴定肝癌细胞HepG2中CD133标记的肝癌干细胞(LCSC),初步探讨曲格列酮(Tro)对HepG2及CD133^+ LCSC的细胞毒性差异。方法利用流式细胞仪分选纯化HepG2中的CD133^+ 和CD133-细胞,采用悬浮微球形成法、平板克隆形成法、Transwell侵袭和迁移实验检测HepG2、CD133^+ 和CD133-细胞的自我更新能力;BALB/c裸鼠体内成瘤实验检测HepG2和CD133 LCSC细胞的成瘤能力;流式细胞术检测HepG2、CD133^+ LCSC细胞周期,MTT法测定其对索菲替尼的耐药性;MTT法检测Tro对HepG2、CD133^+ LCSC的毒性情况,全自动生化分析仪测定其对细胞上清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)和总蛋白(TP)水平的影响,荧光法检测Tro对细胞CYP450总活性和ROS水平的影响。结果 CD133标记的CSC在HepG2中占(0.72±0.05)%,CD133^+ 细胞分选后纯度为98.7%;CD133^+ 细胞微球形成能力、克隆形成能力以及Transwell迁移与侵袭能力、肿瘤形成能力明显高于亲本(P<0.05、0.01);CD133^+ 细胞群大多处于G0/G1期,G2/M期未阻滞,并且对索菲替尼表现较大耐药性(P<0.05、0.01);Tro处理12、24、48、72 h后,CD133^+ LCSC半数抑制浓度(IC50)显著低于HepG2(P<0.05、0.01);80μmol/L Tro处理48 h时,LCSC上清AST、TP、LDH、ALB、BUN生化指标不同程度升高,CYP450总活性和ROS水平出现明显抑制(P<0.05、0.01)。结论成功筛选和鉴定具有高增殖能力的CD133^+ HepG2 CSC,其在Tro引起肝细胞毒性方面较HepG2细胞更敏感,细胞毒性差异显著,为Tro靶向CD133^+ LCSC的细胞毒性研究提供新思路。

关键词： HepG2 CD133 肝癌干细胞曲格列酮肝细胞毒性索菲替尼

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何首乌醇提物对脂多糖诱导大鼠肝TLR4/TRIF/IRF-3信号通路的影响

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国际药学研究杂志 2016年第3期43卷 496-503页

作者：毛宏梅谢丽华樊星吴纯启王茜莎王全军中国疾病预防控制中心营养与健康所北京100050 广东药学院广州510006 总后卫生部药品仪器检验所北京100071 军事医学科学院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室、国家北京药物安全评价研究中心北京100850

目的研究大鼠经革兰阴性菌外膜成分脂多糖(LPS)诱导后,何首乌醇提物(PMT)对大鼠的肝毒性,并探讨其肝损伤机制与固有免疫炎症信号通路Toll样受体4(TLR4)-干扰素调节因子3(IRF-3)的关系。方法雄性SD大鼠随机分为正常对照组、对乙酰氨基酚(... 详细信息

目的研究大鼠经革兰阴性菌外膜成分脂多糖(LPS)诱导后,何首乌醇提物(PMT)对大鼠的肝毒性,并探讨其肝损伤机制与固有免疫炎症信号通路Toll样受体4(TLR4)-干扰素调节因子3(IRF-3)的关系。方法雄性SD大鼠随机分为正常对照组、对乙酰氨基酚(APAP,625 mg/kg)组、PMT 6 g/kg(PMT-L)和12 g/kg(PMT-H)组、脂多糖(LPS,4 g/L)组、(LPS+APAP)和(LPS+PMT-L/-H)组。后4组经尾静脉注射LPS 4 mg/kg,2 h后各实验组分别灌胃给予相应药物每日1次,连续7 d。观察每日大鼠体质量变化,分别在给药结束后2 h、14 h、5 d和8 d经HE染色检测大鼠组织形态变化,采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)法及Western印迹法检测肝细胞中TLR4信号通路干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)、IRF-3的表达情况。结果大鼠尾静脉注射LPS诱导后2 h,肝实质出现微小肉芽肿,其后,LPS组大鼠肝损伤逐渐恢复。诱导第8天时,LPS组大鼠肝组织结构清晰完整,LPS+APAP组和LPS+PMT各剂量组肝细胞灶状坏死,伴炎细胞浸润。RT-q PCR检测法和Western印迹法检测结果显示,单独灌胃何首乌醇提物的大鼠肝细胞中TLR4、TRIF和IRF-3的m RNA和蛋白表达水平与正常组相比无显著差异,而经LPS诱导的大鼠肝细胞TLR4、TRIF和IRF-3 m RNA和蛋白表达水平显著高于正常对照组,与LPS组相比有显著性差异(P<0.05),但PMT各剂量组间相比无显著差异。结论何首乌醇提物经LPS诱导能引起肝损伤,其引起的肝毒性与正性调控TLR4/IRF-3信号通路的表达有关,其肝损伤程度与给药剂量无关,提示TLR4/IRF-3信号通路的激活是LPS诱导何首乌醇提物肝损伤的作用机制之一。

关键词：脂多糖何首乌醇提物肝毒性 Toll样受体4 非依赖性信号通路

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高通量测序和实时荧光定量PCR分析何首乌肝损伤与肠道微生物组的关系

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药物评价研究 2017年第4期40卷 464-471页

作者：邓红吴纯启赵春雪许赫雷井潇董延生唐春萍杨威王全军江涛广东药科大学中药学院广东广州510006 军事医学科学院毒物药物研究所国家北京药物安全评价研究中心抗毒药物与毒理学国家重点实验室北京100850 天津市武清区人民医院药剂科天津301700 广东省生物资源应用研究所广东省动物保护与资源利用重点实验室广东省野生动物保护与利用公共实验室广东广州510260 广东药科大学实验动物中心广东广州510006

目的采用Illumina高通量测序技术和实时荧光定量PCR(Real-Time PCR,RT-PCR)法研究何首乌(PM)致肝损伤与肠道微生物组间的关系,并验证两种定量方法的一致性。方法雄性SD大鼠随机分为5组:对照组、脂多糖(LPS)组、LPS+对乙酰氨基酚(APAP)组... 详细信息

目的采用Illumina高通量测序技术和实时荧光定量PCR(Real-Time PCR,RT-PCR)法研究何首乌(PM)致肝损伤与肠道微生物组间的关系,并验证两种定量方法的一致性。方法雄性SD大鼠随机分为5组:对照组、脂多糖(LPS)组、LPS+对乙酰氨基酚(APAP)组、PM组和LPS+PM组;大鼠尾iv给予4.0 mg/kg LPS建立肝损伤模型,各组相应每天1次ig给予0.625 g/kg APAP和12 g生药/kg PM,记录大鼠体质量;分别于造模后2、14 h、5和8 d,对大鼠粪便中细菌16S r RNA基因的V4高变区进行Illumina高通量测序,根据测序结果得出的差异物种,采用RT-PCR进行验证;取造模后8 d大鼠肝脏组织,HE染色,光学显微镜观察。结果大鼠肝脏病理学检查结果显示,与对照组比较,LPS组大鼠存在肉芽肿,PM组无异常病变;与LPS组比较,LPS+PM大鼠肝细胞出现轻度变性和微小肉芽肿增多,LPS+APAP组可见微小肉芽肿和淋巴细胞浸润。Illumina高通量测序结果提示,与对照组比较,随着PM给药次数增加,单独给予PM的大鼠肠道微生物无显著变化;LPS+PM组表现为肠球菌科和毛螺旋菌科细菌逐渐增加,乳杆菌属细菌减少,且与LPS组有差异;RT-PCR结果显示,与对照组比较,随着PM给药次数的增加,单独给予PM的大鼠肠道微生物无显著变化;LPS+PM组肠球菌科、毛螺旋菌科细菌数显著增加(P<0.05),乳杆菌属细菌数显著减少(P<0.05),且与LPS组比较有显著差异。结论 PM肝损伤大鼠存在不同程度的菌群失衡,且Illumina高通量测序和RT-PCR检测结果具有良好的一致性,但Illumina高通量测序技术可获得更多的微生物信息,更具优势。

关键词：高通量测序何首乌肝损伤肠道微生物组

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大鼠灌胃中药AN200706反复给药6个月长期毒性试验毒性病理改变

大鼠灌胃中药AN200706反复给药6个月长期毒性试验毒性病理改变

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中国毒理学会中药与天然药物毒理专业委员会第一次（2016年）学术交流大会

作者：董延生袁本利王和枚瞿文生王全军军事医学科医学院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室国家北京药物安全评价研究中心

目的 AN200706为国内某科研院所研制,拟用于治疗糖尿病的中药5类新药。为评价大鼠灌胃AN200706反复给药6个月的毒性反应,了解毒性作用的靶器官及其损害的可逆性,确定无毒反应剂量,为制订临床用药方案提供参考资料而开展本试验。方法SPF... 详细信息

目的 AN200706为国内某科研院所研制,拟用于治疗糖尿病的中药5类新药。为评价大鼠灌胃AN200706反复给药6个月的毒性反应,了解毒性作用的靶器官及其损害的可逆性,确定无毒反应剂量,为制订临床用药方案提供参考资料而开展本试验。方法SPF级SD大鼠160只分组灌胃AN200706 0、500、1000和2500 mg/kg/天,6天/周,连续给药6个月,每组1/4动物给药3个月和1/2动物给药6个月后解剖取材进行病理检查,剩余1/4动物停药后继续观察1个月。死亡动物当时解剖,其余全部动物按预定时间麻醉放血处死,称量并计算心、肺、肝、脾、肾、胸腺、肾上腺、睾丸或卵巢、附睾或子宫和脑等器官的脏器重量和脏器系数;动物解剖后大体检查,选取脑(大脑、小脑、脑干)、脊髓(颈、胸、腰段)、垂体、胸腺、甲状腺、甲状旁腺、食管、唾液腺、胃、小肠和大肠、肝脏、胰腺、肾脏、肾上腺、脾脏、心脏、气管、肺脏、主动脉、膀胱、睾丸、附睾、卵巢、子宫、乳腺、前列腺、坐骨神经、胸骨和骨髓、肠系膜淋巴结、视神经、气管等组织取材,石蜡包埋HE制片后进行组织学检查。结果心、肺、肝、脾、肾、胸腺、肾上腺、睾丸或卵巢、附睾或子宫和脑等器官的脏器重量和脏器系数未见与受试物相关的明显改变;实验过程中、低剂量组分别死亡2只动物,大体及组织学检查未见明显病变;各试验期高剂量组动物胰腺出现局部胰岛细胞增生、肥大以及局部胰岛内部及外周上皮样细胞增生和外分泌部萎缩,这些改变虽然也出现在同期对照组内,但给药组动物病变严重程度明显高于对照组;其它脏器未见与供试品相关的明显改变。结论大鼠160只分组口服AN200706 0、500、1000和2500 mg/kg/天,连续给药6个月,在2500 mg/kg/天剂量下AN200706可引起SD大鼠发生胰岛细胞轻度增生肥大、胰岛细胞团内部及周围上皮样细胞中度增生以及胰腺局部外分泌部萎缩等改变。

关键词：长期毒性试验 AN200706 毒性病理

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中药临床前安全评价的一些思考

中药临床前安全评价的一些思考

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中国毒理学会中药与天然药物毒理专业委员会第一次（2016年）学术交流大会

作者：高杰秦昭恒郝雅环王晓菲董延生王全军军事医学科医学院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室国家北京药物安全评价研究中心

目前中药的安全性评价研究主要参考和沿用化学药品的研究方法,应根据中药的特殊性和复杂性做一些不同于化药的分析和研究。在临床前的安全性评价中因其特殊性也应从以下几个方面区别对待。(一)受试物:中药尤其复方制剂,人日用剂量较大时... 详细信息

目前中药的安全性评价研究主要参考和沿用化学药品的研究方法,应根据中药的特殊性和复杂性做一些不同于化药的分析和研究。在临床前的安全性评价中因其特殊性也应从以下几个方面区别对待。(一)受试物:中药尤其复方制剂,人日用剂量较大时,由于动物给药容量的限制,可采用提取物(如浸膏或有效部位等),受试物形式与药效学研究一致,如一次提取量不够,试验前将各次获得的样品进行充分的混合。(二)溶媒的选择:不论何种给药途径,水是最佳选择,选择其他溶媒时应考虑动物的敏感性。难以溶解的中药以混悬形式给药,应注意对混悬液的均一性和稳定性进行考察。(三)给药方法:可通过改胶囊为灌胃,增加给药次数,静脉注射降低给药速度,以速度换体积的方式提高给药剂量。(四)剂量设置:毒性不大的中药,一般采用最大给药量法,以最大给药体积和最大给药浓度给予的剂量作为最高剂量,应综合考虑药物的粘稠度和动物可接受的给药体积,配制浓度影响药物在体内的吸收速度和血液峰浓度。(五)血清、尿液毒性指标设定:根据中药组成成分,设定特异性毒性指标,而且不应局限于古籍所记载的"毒物"。(六)综合分析:对出现异常的反应需要具体分析,可能是放大了的药理学作用或毒性反应,也可能是给药容量导致的动物不适。

关键词：临床前安全评价

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浅析中药安全性

浅析中药安全性

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中国毒理学会中药与天然药物毒理专业委员会第一次（2016年）学术交流大会

作者：张依量高杰梁宗星郭珣孙海云董延生王全军军事医学科医学院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室国家北京药物安全评价研究中心

由于中药不良反应事件时而不断的被报道,所以中药安全性已为国内外所关注。本文对近年来我国在中药安全性问题进行了概述,并且总结了影响中药安全性的因素以及在中药临床前安全性研究中存在的问题。

关键词：中药安全性

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Beagle犬经口SMT重复给药13周毒性试验

Beagle犬经口SMT重复给药13周毒性试验

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中国毒理学会中药与天然药物毒理专业委员会第一次（2016年）学术交流大会

作者：张瑞安王晓菲欧阳兆和韩刚董延生关勇彪王全军军事医学科医学院毒物药物研究所抗毒药物与毒理学国家重点实验室国家北京药物安全评价研究中心

目的:SMT是用于功能性消化不良、便秘和术后通气等症状的治疗,本试验目的观察Beagle犬重复灌胃给予SMT后所产生的毒性反应,判断受试物重复给药的毒性靶器官或靶组织,确定未观察到不良反应的剂量水平(No Observed Adverse Effect Level,N... 详细信息

目的:SMT是用于功能性消化不良、便秘和术后通气等症状的治疗,本试验目的观察Beagle犬重复灌胃给予SMT后所产生的毒性反应,判断受试物重复给药的毒性靶器官或靶组织,确定未观察到不良反应的剂量水平(No Observed Adverse Effect Level,NOAEL)。方法:Beagle犬40只,随机分为4组,每组雌、雄各5只。根据人临床拟用剂量0.15 g/kg,设计灌胃给药剂量2 g/kg/天、6 g/kg/天和18 g/kg/天,阴性对照组给予SMT稀释液。按照5 ml/kg进行给药,6天/周,连续给药13周。检查项目包括临床观察、摄食量、体重、体温、心电图、血液学、血清生化、眼科、骨髓、尿液以及病理检查。结果:经口灌胃给予SMT后,Beagle犬出现稀便、呕吐、活动减少、流涎等症状。动物体重增长正常,体温在正常生理范围内波动,心电图指标在正常范围内波动,动物摄食量正常,眼科检查也无异常发现。血液学、血清生化、尿液和骨髓细胞检查未发现有明确的毒理学意义指标变化。组织病理学检查胸腺自发性萎缩加重,肾小管轻微自发性空泡变性加重。结论:在本实验所确定的条件下,Beagle犬经口灌胃SMT 2、6和18 g/kg/天,6天/周,连续给药13周,没有发现明确的毒性作用和毒性靶器官,受试物NOAEL小于2 g/kg/天。

关键词： SMT Beagle犬灌胃长期毒性试验

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