检索结果-内蒙古大学图书馆

生物工程学报 2005年第3期21卷 473-477页

作者：王宏金宁一尹革芬徐一鸣金洪涛张立树李子建军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程实验室

以pPIC9K为载体,构建抗HIV 1gp12 0单链抗体scFv12 0与葡萄球菌肠毒素A(StaphylococcalenterotoxinA ,SEA)融合基因表达质粒,线性化、电转化法整合入巴斯德毕赤酵母菌,经表型鉴定、PCR分析和G4 18筛选得到Muts型多拷贝整合菌,甲醇诱导... 详细信息

以pPIC9K为载体,构建抗HIV 1gp12 0单链抗体scFv12 0与葡萄球菌肠毒素A(StaphylococcalenterotoxinA ,SEA)融合基因表达质粒,线性化、电转化法整合入巴斯德毕赤酵母菌,经表型鉴定、PCR分析和G4 18筛选得到Muts型多拷贝整合菌,甲醇诱导培养可分泌表达5 7kD的预期大小蛋白—重组导向毒素SL12 0 ,表达量达5 0 1mg L。通过单链抗体亲和力测定,表明蛋白SEA和scFv12 0的构象有微弱的相互影响,但此重组导向毒素仍可高效介导CTLs杀伤HIV 1靶细胞。

关键词： HIV-1,gp120,单链抗体,金黄色葡萄菌外毒素A,分泌表达,毕赤酵母

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小鼠对HIV-2gp105核酸疫苗免疫应答的研究

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细胞与分子免疫学杂志 2005年第1期21卷 86-89页

作者：李子健金宁一江文正张立树军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程重点实验室

　目的: 探讨HIV- 2gp105基因核酸疫苗在小鼠体内的免疫应答, 为开发HIV- 2核酸疫苗提供实验依据。方法:将HIV- 2外膜蛋白 (gp105 )基因插入真核表达质粒载体pVAX1中, 构建pVAX1 gp105重组表达质粒。将其肌注免疫BALB/c小鼠, 用ELISA法... 详细信息

　目的: 探讨HIV- 2gp105基因核酸疫苗在小鼠体内的免疫应答, 为开发HIV- 2核酸疫苗提供实验依据。方法:将HIV- 2外膜蛋白 (gp105 )基因插入真核表达质粒载体pVAX1中, 构建pVAX1 gp105重组表达质粒。将其肌注免疫BALB/c小鼠, 用ELISA法检测小鼠血清抗HIV -2抗体, 用流式细胞仪测定CD4+、CD8+ T细胞亚群数, 以乳酸脱氢霉释放法检测脾特异性CTL的杀伤活性。结果: 重组质粒pVAX1 -gp105免疫组小鼠的血清抗体滴度、脾T细胞亚群的数量及特异性CTL的杀伤活性, 均明显高于对照组, 分别为P<0. 01, P<0. 05和P<0. 01。结论: HIV -2gp105核酸疫苗能诱导小鼠产生特异性细胞和体液免疫。

关键词： HIV-2 gp105 DNA疫苗免疫应答

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新型抗HIV-1重组导向制剂SL41在毕赤酵母中的表达及活性实验

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高等学校化学学报 2007年第8期28卷 1493-1496页

作者：李昌王宏金宁一金洪涛刘玉生于芳李子健张立树军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程重点实验室暨南大学生命科学技术学院广州510632

以酵母分泌型表达载体pPIC9k为基础,通过一段柔性连接肽Linker构建含有人源化抗HIV-1 gp41单链抗体(ScFv41)和免疫诱导因子葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxinA,SEA)的融合表达质粒pPIC9k-SL41,线性化后,采用电转化法整合入巴... 详细信息

以酵母分泌型表达载体pPIC9k为基础,通过一段柔性连接肽Linker构建含有人源化抗HIV-1 gp41单链抗体(ScFv41)和免疫诱导因子葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxinA,SEA)的融合表达质粒pPIC9k-SL41,线性化后,采用电转化法整合入巴斯德菌毕赤酵母GS115中,经His+MutS表型鉴定、PCR分析以及G418筛选获得高拷贝重组转化子.摇瓶培养、甲醇诱导表达、SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明,目的蛋白得到良好表达,表达量最高可达到47.9 mg/L.目的蛋白经初步纯化后,用于制备的HIV-1感染靶细胞复制模型进行抗体亲和力测定、细胞结合活性测定和细胞杀伤活性研究,结果显示,目的蛋白能够很好地与靶细胞模型中的HIV-1外膜蛋白gp160发生结合反应,并可介导特异的CTL反应,对靶细胞具有明显的杀伤活性,表明获得了具有生物活性的抗HIV-1重组导向制剂.

关键词： HIV-1 重组导向制剂单链抗体金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA) 分泌表达毕赤酵母

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抗AIDS新型导向毒素CVN-LP1融合基因的构建及原核表达

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中国生物工程杂志 2007年第3期27卷 100-104页

作者：李昌金宁一刘玉生于芳金洪涛李臻佟敬山胡宁宁军事医学科学院军事兽医研究所基因工程实验室

目的:构建重组抗病毒融合蛋白CVN-LP1原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法:将已经构建好的pET-CVN和pET-LP1重组质粒,EcoRI和HindⅢ同时进行双酶切,保留LP1片段前端的linker序列。将所得的CVN片段连入pET-LP1载体上,构建pET-CVN-LP1融... 详细信息

目的:构建重组抗病毒融合蛋白CVN-LP1原核表达载体,并进行表达和鉴定。方法:将已经构建好的pET-CVN和pET-LP1重组质粒,EcoRI和HindⅢ同时进行双酶切,保留LP1片段前端的linker序列。将所得的CVN片段连入pET-LP1载体上,构建pET-CVN-LP1融合表达载体,转化入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western-blot鉴定表达产物。结果:重组载体pET-28a(+)-CVN-LP1经PCR及XhoI/EcoRI和EcoRI/HindIII双酶切鉴定,证实构建成功。将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物相对分子量约为20kDa,与理论大小一致。凝胶成像分析表明最高表达量可占菌体总蛋白的49.58%。SDS-PAGE、Western-blot分析表明目的蛋白得到了很好的表达。结论:构建了pET-CVN-LP1原核表达载体,并得到了目的融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了坚实的基础。

关键词：核糖体失活蛋白原核表达Cyanovirin-N LuffinP1

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表达猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5/ORF6基因重组鸡痘病毒的构建与小鼠免疫试验

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中国兽医学报 2010年第1期30卷 1-5页

作者：韩松金宁一鲁会军金扩世南文龙牟伟峰赵翠青军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程重点实验室

本试验构建了1株表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)RF5/ORF6基因的重组鸡痘病毒,并进行了小鼠免疫实验,对其诱导BALB/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应的能力进行了评价。结果表... 详细信息

本试验构建了1株表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)RF5/ORF6基因的重组鸡痘病毒,并进行了小鼠免疫实验,对其诱导BALB/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫反应的能力进行了评价。结果表明,重组鸡痘病毒能够刺激免疫鼠产生特异性PRRSV ELISA抗体,促进特异性T淋巴细胞增殖。对免疫小鼠血清中细胞因子检测结果表明,IFN-γ的分泌显著提高。结果表明,所构建重组鸡痘病毒可以对小鼠起到良好的免疫效果,具有成为抗PRRSV感染新型疫苗的潜力。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5/ORF6基因鸡痘病毒载体免疫试验

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共表达H5N1、H7N1亚型AIV HA与鸡IL-18多价重组鸡痘病毒免疫保护性研究

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中国病毒学 2005年第6期20卷 607-612页

作者：王振国金宁一马鸣潇费东亮郑敏尹革芬贾雷立金扩世夏志平金明兰军事医学科学院军事兽医研究所全军重点基因工程实验室

用本实验室构建的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18和rFPV-H5HA,经翼蹼免疫1日龄SPF鸡和7日龄商品Leghorn蛋鸡,同时以H5亚型AIV全病毒灭活疫苗作为对照。免疫后测定HI抗体效价、淋巴细胞转化指标、重组疫苗对增重的... 详细信息

用本实验室构建的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18和rFPV-H5HA,经翼蹼免疫1日龄SPF鸡和7日龄商品Leghorn蛋鸡,同时以H5亚型AIV全病毒灭活疫苗作为对照。免疫后测定HI抗体效价、淋巴细胞转化指标、重组疫苗对增重的影响、免疫后的攻毒保护效力、免疫后的抑制排毒情况。免疫后不同时间分别测定特异性抗体和淋巴细胞刺激指数。试验结果表明,3株重组鸡痘病毒株均能诱导鸡体产生血凝抑制抗体(HI);共表达鸡IL-18的rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18诱导商品蛋鸡的细胞免疫水平明显高于非共表达鸡IL-18的rFPV-H5HA。重组鸡痘疫苗免疫SPF和商品蛋鸡后第21d进行攻毒实验,rFPV- H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫攻毒保护率达10／10,rFPV-H5HA免疫攻毒保护率达9／10,与常规疫苗相当。免疫的商品蛋鸡于攻毒后7d采集泄殖腔棉试子样品,检测排毒情况。结果表明,rFPV-H5HA- IL18、rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫组在攻毒后第7d无排毒,其抑制免疫鸡排毒效果优于常规疫苗和单独表达 HA的rFPV-H5HA重组鸡痘病毒。rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA-H7HA-IL18免疫组鸡,在14日龄时的体重明显高于rFPV-H5HA免疫组和常规疫苗对照免疫组,表明共表达的鸡IL-18能降低鸡痘病毒载体对雏鸡增重的影响。

关键词：禽流感病毒重组鸡痘病毒疫苗实验免疫血凝素白介素 18

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禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立

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高技术通讯 2005年第5期15卷 77-81页

作者：马鸣潇金宁一王振国费东亮郑敏金扩世夏志平葛淑敏金明兰中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程重点实验室长春130062 锦州医学院畜牧兽医学院锦州121001 不详

参照国内外已发表的禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)的基因序列和AIV相关的RT-PCR检测方法,根据AIV高保守、高特异的M蛋白基因设计了一套通用型引物,通过对相关病毒、棉拭子检测,建立了AIV通用型RT-PCR检测方法.根据AIV HA基因... 详细信息

参照国内外已发表的禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)的基因序列和AIV相关的RT-PCR检测方法,根据AIV高保守、高特异的M蛋白基因设计了一套通用型引物,通过对相关病毒、棉拭子检测,建立了AIV通用型RT-PCR检测方法.根据AIV HA基因设计了H5、H7、H9亚型的联合RT-PCR引物,其上下游引物分别位于裂解位点两侧,在确定各亚型单项RT-PCR检测方法的反应条件和反应体系的基础上,建立、优化了三联RT-PCR检测方法的反应体系和反应条件,并通过相关病毒、质粒、棉拭子检测,建立了AIV三联RT-PCR检测方法.最终建立了AIV系列RT-PCR检测方法,该方法具有快速、敏感、特异等优点,为AIV检测、流行病学调查、致病性分析及疫苗使用等奠定了基础.

关键词： PCR检测方法禽流感病毒流行病学调查基因设计反应体系反应条件 AIV Virus PCR引物基因序列 H9亚型裂解位点疫苗使用通用型国内外相关 M蛋白 V系列致病性基础三联棉

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口蹄疫三价重组鸡痘病毒疫苗分子设计及其构建

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高技术通讯 2007年第3期17卷 288-294页

作者：马鸣潇金宁一刘慧娟沈国顺郑敏金明兰鲁会军霍晓伟马海利中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程重点实验室长春130062 辽宁医学院动物医学院锦州121001 吉林大学畜牧兽医学院长春130062

针对我国口蹄疫（FMD）流行情况,利用计算机软件模拟分析,构建了口蹄疫病毒（FMDV）复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT。该表达盒以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和AsiaⅠ型FMDV2个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因（其... 详细信息

针对我国口蹄疫（FMD）流行情况,利用计算机软件模拟分析,构建了口蹄疫病毒（FMDV）复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT。该表达盒以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和AsiaⅠ型FMDV2个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因（其中2个抗原表位来源于FMDVIND63/7株,该毒株与我国新疆分离株属于同一基因拓扑型,其余3个抗原表位来源于FMDVYNBS/58株）作为主要免疫原基因,以非结构蛋白上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因。将构建好的表达盒OAAT和猪IL-18基因分别插入到鸡痘病毒（FPV）表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子（ATI-P7.5×20）和单一启动子（P7.5）下游,构建了携带OAAT表达盒和猪IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-OAAT-IL18。应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,经BrdU进行3次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用FMDVVP1基因和猪IL-18基因特异引物进行RT-PCR和IFA检测,筛选出OAAT和猪IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rF-PV-OAAT-IL18,该重组鸡痘病毒的构建为新型FMDV活载体疫苗的研究奠定了基础。

关键词：复合多表位抗原表达盒 OAAT口蹄疫病毒鸡痘病毒

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口蹄疫病毒复合多表位DNA疫苗的设计及构建

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中国生物制品学杂志 2007年第3期20卷 190-194页

作者：马鸣潇金宁一刘慧娟鲁会军田明尧金明兰沈国顺张林李旭计越金扩世吉林大学畜牧兽医学院长春130062 军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程重点实验室长春130062

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT及其DNA疫苗。方法以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和Asia1型FMDV两个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因作为主要免疫原基因,非结构蛋白3ABC上的2个Th2细胞表... 详细信息

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT及其DNA疫苗。方法以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和Asia1型FMDV两个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因作为主要免疫原基因,非结构蛋白3ABC上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白VP4上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因,构建表达盒。将构建好的表达盒OAAT克隆到真核表达载体pVAX1 PCMV启动子下游,构建三价口蹄疫核酸疫苗pVAX1-OAAT,并用Western blot和IFA方法检测目的蛋白在HeLa细胞中的表达。结果通过InsightⅡ软件同源建模和DNAStar5.0软件分析表明,所构建的FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT理论上符合设计要求,且在真核细胞获得了正确表达。结论已成功设计FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT,并构建了三价口蹄疫核酸疫苗pVAX1-OAAT。

关键词：口蹄疫病毒复合多表位抗原表达盒 DNA疫苗

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重组HIV-1 DNA疫苗工程菌中试发酵工艺的优化

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中国生物制品学杂志 2010年第5期23卷 500-502,506页

作者：宋英今金宁一李霄田明摇张立树李昌天津大学农业与生物工程学院天津300072 解放军军事医学科学院军事兽医研究所全军基因工程实验室长春130062

目的优化重组HIV-1DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺。方法优化质粒转化条件,制备工程菌Jm109/pVAX1-MEGp24种子液,连续传30代,检测其遗传稳定性;优化培养基成分、补料基质、补料方式和培养时间,确定最佳发酵参数;并应用最佳发酵参数,于50L... 详细信息

目的优化重组HIV-1DNA疫苗工程菌的中试发酵工艺。方法优化质粒转化条件,制备工程菌Jm109/pVAX1-MEGp24种子液,连续传30代,检测其遗传稳定性;优化培养基成分、补料基质、补料方式和培养时间,确定最佳发酵参数;并应用最佳发酵参数,于50L发酵罐进行3批中试规模的发酵,考察在发酵培养过程中质粒的稳定性和超螺旋质粒的比例。结果工程菌在连续传代30次后,质粒拷贝数基本保持稳定;最佳发酵参数为:采用以甘油为碳源的培养基,以梯度恒速流加方式补料,培养时间13h;通过3批稳定发酵,最终可获得湿菌67.0～68.6g/L,质粒含量可达1.62～1.73mg/g菌,超螺旋质粒的比例达93%以上。结论已建立了稳定的重组HIV-1DNA疫苗工程菌中试发酵工艺,为进一步规模化生产奠定了基础。

关键词： HIV-1 DNA疫苗工程菌发酵

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