检索结果-内蒙古大学图书馆

中华预防医学杂志 2013年第5期47卷 439-443页

作者：李迎丽张义全闫小娟刘梦颖杨瑞馥邱景富周冬生重庆医科大学公共卫生与管理学院 400016 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室

目的构建副溶血弧菌生物膜相关基因突变株并进行验证。方法采用PCR方法扩增得到靶基因的上下游同源臂片段，然后以上下游同源臂片段为模板，PCR扩增得到同源臂融合片段。将同源臂融合片段经酶切处理后克隆到自杀质粒pDSl32中。通过结合... 详细信息

目的构建副溶血弧菌生物膜相关基因突变株并进行验证。方法采用PCR方法扩增得到靶基因的上下游同源臂片段，然后以上下游同源臂片段为模板，PCR扩增得到同源臂融合片段。将同源臂融合片段经酶切处理后克隆到自杀质粒pDSl32中。通过结合转移的方式将携带有同源臂融合片段的重组质粒转入副溶血弧菌RIMD2210633中，利用同源重组得到突变株。用PCR方法筛选和鉴定突变株，同时对突变株进行表型分析，从而在分子水平和表型试验上验证突变株是否构建成功。结果构建得到了分别携带副溶血弧菌生物膜相关基因vbfa、crp、hns、swrZ、swrT、cpsR融合同源臂片段的重组质粒，通过PCR扩增，分别得到了大小为1190、1128、1136、953、1242、1112bp的片段；用重组质粒构建了相应的突变株（AvbfR、Acrp、Ahns、AswrZ、AswrT和AcpsR），进行PCR鉴定时，突变株得到了大小分别为1190、1128、1136、953、1242、1112bp的扩增产物，比阳性对照分别小610、739、421、542、427、1367bp；用靶基因内部的引物进行扩增时，无扩增产物；选其中一株突变株Ahns进行生物膜形成能力表型分析，结果表明突变株Ahns生物膜形成量与野生株相比明显增加。结论构建得到了6株副溶血弧菌生物膜相关基因突变株，并从分子和表型试验上验证了突变株构建正确。

关键词：弧菌属质粒生物膜基因敲除技术突变

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免疫胶体金试剂检测布鲁菌苗接种牛血清结果分析

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军事医学 2013年第11期37卷 873-874页

作者：李岩伟程君生左庭婷韩雪莲何君朱虹毛开荣端青军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 中国兽医药品监察所北京100081

目的评价实验室研制的布鲁菌病抗体快速检测试剂(胶体金法)能否鉴别布鲁菌自然感染和免疫接种所产生的抗体。方法用胶体金试剂对272份接种S2和A19布鲁菌苗的牛血清进行检测,并以虎红平板凝集试验作为对照。结果与结论结果显示,两种方法... 详细信息

目的评价实验室研制的布鲁菌病抗体快速检测试剂(胶体金法)能否鉴别布鲁菌自然感染和免疫接种所产生的抗体。方法用胶体金试剂对272份接种S2和A19布鲁菌苗的牛血清进行检测,并以虎红平板凝集试验作为对照。结果与结论结果显示,两种方法一致率100%。布鲁菌病抗体快速检测试剂(胶体金法)不被疫苗免疫抗体干扰,可用于布鲁菌感染诊断。

关键词：布鲁菌病胶体金快速检测虎红平板凝集试验

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突触小泡膜蛋白VAMP-2的原核表达、纯化及活性鉴定

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军事医学 2013年第4期37卷 250-253页

作者：罗森王琴房华丽王德慧李崭李涛王慧安徽医科大学合肥230032 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的克隆突触小泡膜蛋白(VAMP-2)基因,原核表达、纯化并鉴定重组蛋白VAMP-2活性。方法根据GenBank中已报道的VAMP-2基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR从小鼠的全脑组织总RNA中获得基因。将去疏水区后的基因克隆至含有N端信号肽pelB序... 详细信息

目的克隆突触小泡膜蛋白(VAMP-2)基因,原核表达、纯化并鉴定重组蛋白VAMP-2活性。方法根据GenBank中已报道的VAMP-2基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR从小鼠的全脑组织总RNA中获得基因。将去疏水区后的基因克隆至含有N端信号肽pelB序列的原核表达载体pET-22b中,重组质粒转化BL21(DE3)Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达,表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化,SDS-PAGE及Western印迹进行鉴定,并利用金属内肽酶BoNT/B轻链对该蛋白进行生物活性分析和酶活动力学测定。结果与结论成功构建pET-22b-VAMP-2表达质粒,并转化大肠杆菌BL21(DE3)Rosetta,Western印迹证实重组蛋白VAMP-2(残基Met 1-Met 94)获得可溶性表达。重组蛋白VAMP-2可被金属内肽酶BoNT/B特异性酶解,具有良好的生物学活性。

关键词：囊泡相关膜蛋白质2 金属内肽酶底物原核表达

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鼠疫菌OxyR蛋白对katY的转录调控机制

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中国人兽共患病学报 2013年第9期29卷 850-853,861页

作者：倪斌张义全黄新祥杨瑞馥周冬生江苏大学基础医学与医学技术学院镇江212013 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的利用分子生物学实验研究OxyR对katY的转录调控机制。方法 PCR扩增katY的整个启动子区DNA序列全长,并纯化鼠疫菌His-OxyR蛋白,通过体外的凝胶阻滞实验(EMSA)和DNase I足迹实验研究OxyR对katY启动子区的结合位点;提取鼠疫菌野生株(WT)... 详细信息

目的利用分子生物学实验研究OxyR对katY的转录调控机制。方法 PCR扩增katY的整个启动子区DNA序列全长,并纯化鼠疫菌His-OxyR蛋白,通过体外的凝胶阻滞实验(EMSA)和DNase I足迹实验研究OxyR对katY启动子区的结合位点;提取鼠疫菌野生株(WT)和oxyR突变株(ΔoxyR)的总RNA,采用引物延伸实验研究katY的转录起始位点,并根据产物的丰度判断OxyR对katY的调控关系;进一步采用实时定量RT-PCR的方法验证OxyR对katY的调控关系。结果体外实验结果表明OxyR能结合到katY启动子区-101到-48之间的碱基上;鼠疫菌katY有一个转录起始位点G(-26)(翻译起始位点为+1),其转录表达受OxyR的激活。结论 OxyR能直接结合到katY启动子区而激活其转录表达。

关键词：鼠疫耶尔森氏菌 OxyR katY 转录调控

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西尼罗病毒RNA复制子系统的建立与应用

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军事医学 2013年第2期37卷 114-117页

作者：张富军李晓峰曹飞赵慧邓永强朱舜亚姜涛秦鄂德秦成峰山东省日照市中医院山东日照276800 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的构建具有复制和表达活性的RNA形式的西尼罗病毒(WNV)复制子。方法在DNA形式的WNV复制子pWNrep的基础上,将其CMV启动子替换成SP6启动子,并在3'UTR端引入PacⅠ酶切位点,构建复制子克隆pSP6-WNrep。同时,将增强型绿色荧光蛋白(eGFP... 详细信息

目的构建具有复制和表达活性的RNA形式的西尼罗病毒(WNV)复制子。方法在DNA形式的WNV复制子pWNrep的基础上,将其CMV启动子替换成SP6启动子,并在3'UTR端引入PacⅠ酶切位点,构建复制子克隆pSP6-WNrep。同时,将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)和海肾荧光素酶(***)报告基因分别插入上述复制子质粒中,获得含有报告基因的复制子pSP6-WNrep/eGFP和pSP6-WNrep/***。将上述克隆线性化后进行体外转录,将转录体RNA转染BHK-21细胞,观察不同时间点绿色荧光蛋白(GFP)的活性和***活性。结果与结论获得了WNV复制子pSP6-WNrep、pSP6-WNrep/eGFP和pSP6-WNrep/***,酶切和测序鉴定结果显示,序列与预期一致。将含有报告基因的复制子转染细胞72 h后仍能观察到荧光信号,***的活性随时间延长而增强。本研究成功构建了WNV Chin-01株的RNA复制子,该复制子能够在哺乳动物细胞中有效复制并表达外源蛋白,为下一步构建WNV单轮感染病毒样颗粒奠定了基础。

关键词： RNA 西尼罗病毒复制子转染

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EV71与CB3病毒VP1融合蛋白的构建表达与抗原性初步评价

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安徽医科大学学报 2013年第6期48卷 583-586页

作者：房华丽王琴罗森高翔屠伟田仁茂刘雄李涛王慧安徽医科大学军事医学科学院微生物流行病研究所合肥230032 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的构建pET-22b-ECVP1表达载体,在大肠杆菌中诱导表达肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇B3型(CB3)病毒VP1融合蛋白(ECVP1),并鉴定其抗原性。方法利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分别从EV71与CB3病毒基因组中扩增得到外壳蛋白VP1基因,... 详细信息

目的构建pET-22b-ECVP1表达载体,在大肠杆菌中诱导表达肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇B3型(CB3)病毒VP1融合蛋白(ECVP1),并鉴定其抗原性。方法利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分别从EV71与CB3病毒基因组中扩增得到外壳蛋白VP1基因,经重叠延伸PCR(SOE-PCR)方法拼接构建重组融合蛋白基因(ecvp1),将该片段连接到pET-22b表达载体上,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白,经Western blot鉴定其抗原性。结果pET-22b-ECVP1表达载体构建成功,融合蛋白相对分子量约为65 ku,Western blot分析表明,该融合蛋白能被抗EV71及抗CB3抗体特异识别。结论成功构建pET-22b-ECVP1表达质粒并诱导ECVP1融合蛋白表达,且融合蛋白具有良好的抗原性。

关键词：肠道病毒71型柯萨奇B3病毒外壳蛋白VP1 融合蛋白

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免疫组化分析鼠疫疫苗免疫和鼠疫菌攻毒后恒河猴脾组织中T和B淋巴细胞增殖(英文)

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中国人兽共患病学报 2013年第1期29卷 1-9页

作者：吴小红田光邱业峰祁芝珍张青雯毕玉晶杨永海李豫川杨晓燕辛有全李存香崔白忠王祖郧王虎杨瑞馥王效义病原微生物生物安全国家重点实验室北京微生物流行病研究所北京100071 军事医学科学院实验动物中心北京100071 青海省地方病预防控制所西宁811602

目的在我们先前的研究中发现,鼠疫疫苗免疫的猕猴脾组织中B细胞和T细胞数量明显增加。然而,是否这些细胞是由鼠疫疫苗引起的增殖性B细胞和T细胞还不得而知。方法为回答这个问题,本研究使用免疫组化双标记方法检测了猕猴脾组织中T细胞和... 详细信息

目的在我们先前的研究中发现,鼠疫疫苗免疫的猕猴脾组织中B细胞和T细胞数量明显增加。然而,是否这些细胞是由鼠疫疫苗引起的增殖性B细胞和T细胞还不得而知。方法为回答这个问题,本研究使用免疫组化双标记方法检测了猕猴脾组织中T细胞和B细胞的增殖。应用Ki67抗体以及T细胞和B细胞特异性单克隆抗体的免疫组化双标法,对脾组织T细胞和B细胞增殖进行检测。脾组织分别来自于亚单位疫苗SV1(20μg F1+10μg rV270)免疫的猕猴以及分别通过SV2(200μg F1+100μg rV270)、减毒活疫苗EV和铝佐剂免疫并分别攻毒的猕猴。结果与正常动物相比,受试动物脾组织生发中心有较多的B细胞增殖,边缘区有较多的静止B细胞,在动脉周围淋巴鞘区有较多的静止T细胞,提示原始T细胞可能在免疫早期发生增殖。经SV1、SV2或EV76免疫并攻毒的动物脾组织生发中心较仅用SV1免疫动物的生发中心扩大。此外,铝佐剂免疫并攻毒的猕猴脾组织生发中心不完整,这可能归因于强毒株鼠疫菌感染引起的病理损伤。B细胞增殖、静止B细胞增加、静止T细胞增多及生发中心扩大是诱导特异性体液免疫和保持免疫记忆反应的标志。结论这些结果与我们先前的发现的SV1、SV2或者EV76免疫动物激发较高的抗体和IL-4分泌相一致。

关键词：鼠疫疫苗恒河猴免疫组化鼠疫耶尔森氏菌淋巴细胞增殖

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猪链球菌细胞壁蛋白SSU05_1000的表达、纯化及活性分析

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中国人兽共患病学报 2013年第8期29卷 757-761页

作者：王涛郑玉玲袁媛江华郝淮杰李雪琴姜永强安徽医科大学研究生学院合肥230032 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室北京100101

目的构建猪链球菌细胞壁蛋白SSU05_1000基因的重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,并研究其对细胞间紧密连接的调控作用。方法以05ZYH33基因组为模板设计引物,构建pET30a-SSU05_1000重组表达质粒,转化到大肠杆菌中诱导表达,用... 详细信息

目的构建猪链球菌细胞壁蛋白SSU05_1000基因的重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,并研究其对细胞间紧密连接的调控作用。方法以05ZYH33基因组为模板设计引物,构建pET30a-SSU05_1000重组表达质粒,转化到大肠杆菌中诱导表达,用镍亲和层析的方法对目的蛋白进行纯化,Western blot检测其对人脑微血管内皮细胞紧密连接的调控。结果构建的SSU05_1000重组表达质粒能够在大肠杆菌中高效表达,纯化的SSU05_1000蛋白纯度达90%以上,Western blot结果显示其与人脑微血管内皮细胞(hCMEC/D3)相互作用后,可以下调细胞间紧密连接蛋白Claudin-5的表达。结论 SSU05_1000蛋白能够破坏人脑微血管内皮细胞的紧密连接结构,提示其在猪链球菌穿血脑屏障(BBB,bloodbrain barrier)过程中起重要作用。

关键词：猪链球菌 SSU05_1000 紧密连接

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产气荚膜梭菌α毒素突变体构建及其卵黄抗体制备

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军事医学 2013年第9期37卷 671-675页

作者：李箐辛文文康琳高姗王景林安徽医科大学研究生院安徽230032 军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071

目的制备特异性的产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin,CPA)卵黄抗体(yolk immunoglobulin,IgY)。方法利用定点突变技术,将CPA第56位天冬氨酸和第68位组氨酸分别突变为丝氨酸,构建了重组表达载体pTIG-mCPAD56S和pTIG-mCPAH68S,将其转化入*** Origami中进行诱导表达。用亲和层析的方法对突变体蛋白进行纯化并对其活性及抗原性进行检测,将获得的突变体蛋白分别免疫健康母鸡,收集鸡蛋;经水稀释法纯化卵黄中IgY;用酶联免疫吸附试验检测IgY效价;通过筛选保护剂而选择最佳的IgY冻干条件。结果与结论pTIG-mCPA在Origami表达菌株中得到高效表达,经验证,mCPAD56S和mCPAH68S均完全失去生物学活性同时保留抗原性;纯化卵黄后得到较高纯度的特异性IgY,其效价可达到1∶200 000;经过IgY冻干条件的筛选,最终选择不添加保护剂大量冻干IgY作为抗体的储备。该研究为研制基于IgY抗体的检测方法奠定了基础。

关键词：产气荚膜梭菌α毒素突变 IgY 重组表达

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病原微生物实验室Ⅱ级生物安全柜防护性能评价

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中国消毒学杂志 2013年第8期30卷 703-705,709页

作者：温占波胡凌飞李劲松杨文慧王洁李娜张柯殷喆董晓凯军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室国家生物防护装备工程技术中心北京100071

目的评价病原微生物实验室Ⅱ级生物安全柜的防护性能。方法采用安德森采样器采样方法和通过相关仪器,以粘质沙雷菌气溶胶为防护对象进行Ⅱ级生物安全柜防护性能评价。结果所评价的36台Ⅱ级生物安全柜下降气流的平均合格率为91.7%,流入... 详细信息

目的评价病原微生物实验室Ⅱ级生物安全柜的防护性能。方法采用安德森采样器采样方法和通过相关仪器,以粘质沙雷菌气溶胶为防护对象进行Ⅱ级生物安全柜防护性能评价。结果所评价的36台Ⅱ级生物安全柜下降气流的平均合格率为91.7%,流入气流合格率为43.7%,气流模型合格率为43.9%。人员保护合格率为72.2%,样品保护合格率为88.9%,交叉污染合格率为88.9%。结论所测试的Ⅱ级生物安全柜存在较大的气溶胶泄漏风险,对实验操作人员保护性能较差。

关键词： Ⅱ级生物安全柜气溶胶泄露病原微生物防护性能

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